专利名称：猪IFNγ-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和生物工程技术，尤其是涉及一种猪IFNY-Fc融合蛋白及其编码基因和利用家蚕生物反应器表达猪IFNy-Fc融合蛋白的方法。
背景技术：
干扰素(Interferon, IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN的来源即动物种类、细胞类型、诱生剂的性质和诱生条件不同，可分为α、β、Y三种。其中干扰素-Y (Interf eron-gamma, IFN- Y )是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，主要由活化的T细胞和NK细胞产生，在机体免疫系统中发挥重要作用。但由于干扰素分子量小、吸收快、半衰期短、容易被酶水解等特点，在临床中需要频繁注射给药才能达到治疗的效果。IgG免疫球蛋白是体内的主要抗体，IgG的Fe片段可以和新生的Fe受体(FcRn)结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。因此，IgG的Fe片段可以用来与IFNy连接构成融合蛋白，以提高IFN Y在体内的半衰期，达到长效作用的目的；同时IgG可以通过Fe片段上的补体集合位点激活补体，起到细胞杀伤作用；此外，带Fe片段的IFNy融合蛋白可以通过Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。目前猪干扰素的批量生产主要有诱导血液淋巴细胞法和大肠杆菌异源表达法。前一种方法以动物细胞为原料，生产工艺复杂、生产成本高，产品有携带外源病毒和其他病原微生物的危险。相比之下，大肠杆菌异源表达法`具有产量大、纯度高、适合规模化生产、产品质量容易控制等优点，但是其生产工艺相对较繁琐。并且，由于大肠杆菌体系内缺乏蛋白翻译后加工系统，表达产物多以无活性的包涵体形式产生。而包涵体的复性过程复杂、复性率低，从而导致蛋白比活性也较低。另外，大肠杆菌表达体系的产品纯度不高，含有其他杂蛋白，分离纯化较困难。而杆状病毒表达系统作为一种真核表达系统，具有表达效率高、表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使目的蛋白在生化性质及生理活性方面与天然蛋白基本相似、生产成本较低等优点，从而为基因工程干扰素在畜禽养殖业中广泛奠定了基础。因此，本发明提供了一种新颖的猪IFN Y-Fe融合蛋白杆状病毒表达体系——家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪IFNy-Fc融合蛋白及其编码基因，以及利用杆状病毒表达系统，尤其是家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统高效表达、生产猪IFN Y-Fe融合蛋白的方法。本发明提供了一种猪IFNy-Fc融合蛋白，其氨基酸序列包含有猪Y干扰素蛋白序列的成熟肽部分，同时，在猪Y干扰素蛋白序列C端的终止密码子之前添加有Fe蛋白序列。本发明的上述所述猪IFN Y -Fe融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明还提供了一种猪IFNy-Fc第一优化基因，其碱基序列如SEQ ID N0:1所
/Jn ο本发明还提供了一种猪IFNy-Fc第二优化基因，其碱基序列如SEQ ID NO:2所
/Jn ο本发明还提供了一种猪IFNY-Fc第三优化基因，其碱基序列如SEQ ID NO:3所
/Jn ο本发明还提供了一种质粒，所述质粒含有上述所述的猪IFN Y-Fe第一、第二或第三优化基因，所述质粒优选为Bacmid。本发明还提供了一种病毒，所述病毒具有上述所述的质粒，所述病毒优选为杆状病毒，最优选为BmNPV。本发明还提供了一种猪IFNy-Fc融合蛋白的表达方法，包含如下步骤:(I)在合适的条件下将上述所述的病毒转染家蚕BmN细胞或穿刺接种家蚕幼虫；(2)家蚕BmN细胞或家蚕幼虫表达猪IFN Y -Fe融合蛋白。优选的，所述表达 方法步骤如下:(I)将猪IFN Y -Fe第二优化基因或第三优化基因克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统转移表达载体pFastBac Dual中；(2)通过位点的特异性转座，将转移表达载体上的所述猪IFN Y -Fe第二优化基因或第三优化基因整合入Bacmid杆状病毒质粒完成病毒基因组的重组；(3)将步骤(2)中整合了猪IFN Y-Fe第二优化基因或第三优化基因的杆状病毒质粒转染家蚕BmN细胞，获得重组杆状病毒并完成重组杆状病毒的扩增，并用杆状病毒穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫；所述家蚕幼虫优选为4或5龄的家蚕幼虫；(4)经重组病毒感染的家蚕BmN细胞和经接种的家蚕幼虫可表达猪IFN Y -Fe融合蛋白。本发明利用上述表达系统来生产猪IFNy-Fc融合蛋白的优点在于:1.本发明的表达方法的表达效率高，因而可大大降低猪IFNy-Fc融合蛋白的生产成本，并使通过基因工程方法大规模生产猪IFN Y-Fe融合蛋白成为可能。2.这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使目的蛋白在生化性质和生物活性与天然产品类似，从而为所表达的猪IFNy-Fc融合蛋白具有正确的蛋白结构和生物学活性提供了保证。3.与天然猪IFNy相比，本发明的猪IFNy-Fc融合蛋白增加了 Fe蛋白片段，延长了猪IFNy-Fc融合蛋白的半衰期，增加了其在体内发挥效应的时间和整体免疫调节作用。此夕卜，Fe片段可以起到蛋白标签的作用，有利于后期目的蛋白纯化及猪IFNy-Fc融合蛋白注射剂的制备。4.家蚕体内有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定，而且家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫，可以低成本地大规模饲养，而蚕蛹也是中药中的一味常用中药，所以，本发明的通过家蚕表达的猪IFNy-Fc融合蛋白不仅可以经过进一步纯化后制备注射用制剂，而且也可以不经过纯化而经过病毒灭活后直接添加到禽畜(如鸡、猪)的饲料中去。
图1:总实验设计流程图。图2-a、图2-b:猪IFN Y -Fe原始基因序列与猪IFN Y -Fe第一优化基因序列优化前后在家蚕表达宿主中CAI指数。其中，图2-a表示优化前的猪IFN Y -Fe原始基因序列在家蚕表达宿主中CAI指数为0.88 ;图2-b表示优化后的猪IFN Y -Fe第一优化基因序列在家蚕表达宿主中CAI指数为 0.89。图3-a、图3-b:猪IFN Y -Fe原始基因序列与猪IFN Y -Fe第一优化基因密码子在家蚕表达宿主中最优密码子频率分布区域图其中，图3-a表示优化前的猪IFNy-Fc原始基因序列在家蚕表达宿主中最优密码子频率分布区域图，优化前的序列低频密码子出现百分比为1% ;图3-b表示优化后的猪IFN Y-Fe第一优化基因密码子在家蚕表达宿主中最优密码子频率分布区域图，优化后的序列低频密码子出现百分比为O。图4-a、图4-b:猪IFN Y -Fe原始基因序列与猪IFN Y -Fe第一优化基因密码子在家蚕表达宿主中GC含量分布区域图其中，图4-a表示优化前的猪IFN Y -Fe原始基因序列在家蚕表达宿主中GC含量为45.98% ;图4-b表示优化后的猪IFN Y -Fe第一优化基因密码子在家蚕表达宿主中GC含量为 47.75%。图5-a、图5-b:猪IFN Y -Fe原始基因序列与猪IFN Y -Fe第一优化基因在家蚕表达宿主中mRNA的二级结构示意图其中，图5-a表示优 化前的猪IFN Y -Fe原始基因序列mRNA的二级结构示意图；图5-b表示猪IFN Y -Fe第一优化基因进行了优化，去掉发卡结构、剪切位点、内部核糖体结合位点之后mRNA的二级结构示意图。图6:重组pFastBac-(IFN Y-Fe)转移载体的构建不意图。图7:人工合成的pVL1393-(IFNY-Fc)质粒为模板的猪IFN Y-Fe第一优化基因的PCR扩增图。其中，泳道I为经PCR扩增的猪IFN Y -Fe第一优化基因，在1200和1400bp中间出现目的条带；泳道2为200bp DNA ladder。图8:pFastBac_(IFNy-Fc)的BamH I和Hind III的双酶切鉴定图。其中泳道I为pFastBac-(IFN Y-Fe)经BamH I和Hind III双酶切后的条带，5000bp处的为pFastBac Dual条带，1300bp处的为猪IFN Y -Fe第二优化基因条带；泳道2为阳性对照的原始pFastBac Dual质粒；泳道3为阳性对照的猪IFN Y -Fe第二优化基因的PCR条带；泳道4 为 200bp DNA ladder。图9 =Bacmid-(IFNy-Fc)重组质粒利用M13引物的PCR鉴定图。其中泳道I为未转座的重组Bacmid，在300bp出现条带；泳道2为已成功转座的重组Bacmid-(IFN Y-Fe)，在4000bp处出现目的条带；泳道3为200bp DNA ladder。图10-a、图10-b:在100X的显微镜下BmN细胞感染重组杆状病毒BmNPV-(IFNy-Fc)前后细胞形态比较。图10_a为未感染病毒的BmN细胞，细胞呈圆梭状贴壁生长；图ΙΟ-b为感染BmNPV-(IFN Y-Fe)病毒72小时后的BmN细胞，细胞变圆，细胞核膨大，细胞失去贴壁性能而悬浮于培养基中。
图11:家蚕BmN细胞和家蚕幼虫表达猪IFNy-Fc融合蛋白的PCR鉴定。其中泳道I为以表达猪IFNy-Fc融合蛋白家蚕BmN细胞上清中重组杆状病毒的基因组为模板的PCR产物；泳道2为以表达猪IFN Y -Fe融合蛋白家蚕幼虫蚕血基因组为模板的PCR产物；泳道 3 为 200bp DNA ladder。图12:家蚕BmN细胞和家蚕幼虫表达的猪IFN Y -Fe融合蛋白的westernblotting鉴定。使用的一抗为鼠抗IFN Y抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠的IgG。其中I为10-230kD范围的预染Protein ladder ；2为感染BmNPV-(IFNy)病毒72小时后的BmN细胞；3为家蚕幼虫感染BmNPV-(IFNY)病毒72小时后的家蚕血液。
具体实施例实验材料:1.菌株与载体:大肠杆菌 E.coli DH5a、DH10Bac 和 pVL1393 载体购自 Invitrogen公司。载体pFastBac Dual、家蚕BmN细胞由苏州大学基础医学与生物科学学院贡成良教授惠赠；家蚕品种为青松皓月，由中国农业科学院蚕业研究所提供。2.酶与试剂:DNA聚合酶、限制性内切酶、T4连接酶为NEB公司产品。3.生化试剂:IPTG、X_Gal为Sigma公司产品。过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、低熔点琼脂糖为Promega公司产品。庆大霉素、氨苄青霉素、四环素购自上海生物工程有限公司。Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。鼠抗IFN Y —抗购自ThermoScientific公司、羊抗鼠的IgG 二抗购自Sigma公司。胎牛血清购自Gibco公司。细胞培养基TC-100购自Applichem 公司；鲁米诺/增强剂溶液和稳定型过氧化物溶液购自ThermoScientific 公司。4.培养基:大肠杆菌培养基为LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0)；家蚕细胞培养基为含10%胎牛血清的TC-100。实施例一、猪IFNy-Fc融合蛋白的cDNA基因设计根据GenBank 已公开的 Sus scrofa breed Fengjing interferon gamma 的 cDNA序列(GenBank序列登录号:EU249804.1)，在该序列的3’端的终止密码子之前添加Fe片段标签，所述Fe 片段的基因由 Sus scrofa IgG heavy chain (GenBank 登录号:ΝΜ_213828.I)中铰链区、CH2区和CH3区的cDNA序列组成，所得序列记为猪IFN Y -Fe原始基因序列。再根据家蚕表达系统的特性对该基因序列进行了整体优化，优化后的基因序列记为猪IFNy-Fc第一优化基因序列1如SEQ ID NO:1所示。优化后的猪IFN Y -Fe第一优化基因序列更适合于家蚕表达系统，主要体现在下面几方面:1.基因序列的密码子适应指数CAI (Codon Adaptation Index)由图2-a可知，优化前的猪IFNy-Fc原始基因序列的cDNA基因序列在家蚕表达宿主中CAI为0.88。由图2-b可知，经过密码子优化后，使得猪IFNy-Fc第一优化基因的cDNA基因序列在家蚕表达宿主中CAI指数达到0.89。通常CAI=I时被认为该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差。本发明通过密码子优化提高了 CAI指数，从而提高本发明猪IFN Y -Fe第一优化基因在家蚕表达宿主中的表达水平。
2.最优密码子频率分布区域图 FOP(Frequency of Optimal Codons)由图3_a可知,基于家香宿主的表达载体,优化如的猪IFN Y-Fe原始基因序列的低频密码子(遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有密码子、低频密码子或利用率低的密码子(rare or low-usage codons))出现百分比为1% ;未进行优化的基因采用串联低频密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-b可知，经过密码子优化之后的猪IFN Y-Fe第一优化基因在家蚕表达系统中出现稀有密码子的频率为O。3.GC 含量调整(GC Content Adjustment)GC含量理想分布区域为30%_70%，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a可知:优化前的猪IFN Y -Fe原始基因序列的GC碱基平均含量45.98%，优化中减少了基因序列中的GC含量以进一步延长mRNA的半衰期，由图和4_b可知:最终得到优化后的猪IFN Y -Fe第一优化基因的GC碱基平均含量为47.75%。4.猪IFN Y -Fe融合蛋白在家蚕表达宿主中mRNA的二级结构示意5-a为优化前的猪IFNy-Fc原始基因序列的mRNA的二级结构示意图；在序列的优化过程中去掉了序列中的发卡结构、剪切位点、内部核糖体结合位点、转录终止序列等，优化之后的猪IFNy-Fc第一优化基因的mRNA的二级结构示意图如图5_b。人工合成优化得到的猪IFNY-Fc第一优化基因之后，将该基因亚克隆至转移载体PVL1393中，所得质粒记为pVL1393-(IFNy-Fc)质粒。实施例二、重纟目转移载体DFastBac-QFN Y -Fe)的构律1.PCR扩增猪IFN Y -Fe第二优化基因产物以人工合成的pVL1393-(IFN Y-Fe)质粒为模板，进行PCR扩增去掉IFNy自身所带的23个氨基酸信号肽，添加适合昆虫表达系统的系统gp64信号肽，所得基因序列记为猪IFN Y-Fe第二优化基因，该基因序列如SEQ ID NO:2所示。具体如下:使用引物如下:正向引物1:5’_CGCGGATCCATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATT CTGCCTTTGCGCAAGCCCCTTTCTTCAAAGA-3’，反向引物1: 5 ’ -CCCAAGCTTTTATTTTCCTTGGGTCTTGCT-3，。上游引物含BamH I酶切位点及gp64信号肽序列，下游引物包含Hind III的酶切位点。PCR反应体系如下:10 X PCR缓冲液5 μ L，2.5mM dNTP混合物4 μ L,10yM正反向引物各加I μ L,模板I μ L, DNA聚合酶0.25 μ L,加灭菌双蒸水补足体积至50 μ L。PCR扩增条件为:94°C热变性4min ;94°C变性45s，52°C退火30s，72°C延伸lmin，进行30个循环；最后72 C延伸IOmin后于4 C保温。2.PCR产物的纯化`将PCR扩增得到产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出得到约1300bp左右的DNA片段(如图7所示)。在紫外下用灭菌的手术刀切取含相应DNA片段的凝胶，然后用TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒进行纯化。方法如下:切取凝胶片段并称重，将其放入灭菌的1.5ml小离心管中，加入3倍(v/w)体积的溶胶液，50°C放置IOmin使胶充分溶解。将胶溶液冷却至室温后放入吸附柱，加入含无水乙醇的漂洗液洗2次。将漂洗液除尽之后加入30 μ L的洗脱缓冲液洗脱DNA。3.酶切与连接反应酶切反应:纯化后的DNA用BamH I和Hind III双酶切，酶切体系如下:10Χ缓冲液5 μ L，PCR产物10 μ L,BamH I1.5μ L,Hind II11.5 μ L，补足灭菌双蒸水至总体积50 μ L。将反应体系混合均匀之后置于37°C酶切3h。将pFastBac Dual质粒作同样的酶切反应。反应结束用1%的琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段并进行纯化。连接反应:将双酶切后的PCR产物和pFastBac Dual质粒采用T4连接酶连接，连接体系如下:10 X缓冲液2 μ L，PCR产物10 μ L，pFastBac Dual质粒3 μ L，T4连接酶I μ L，补足灭菌双蒸水至总体积20 μ L0将反应体系混合均匀之后于16°C连接过夜。4.大肠杆菌的转化用75mM CaCl2制备大肠杆菌DH5a感受态细胞。取步骤3中制备的连接反应产物5 μ L，加入到100 μ L的感受态细胞中，冰浴30min后42°C水浴热激90s。将热激后产物迅速置于冰上冷却3min，再加入到已温育至37°C的900mL LB培养基中，37°C，220rpm震荡复苏Ih。取100 μ L复苏后的菌液涂布于含100 μ g/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板上，37 °C倒置培养过夜。5.重组子的鉴定从转化的LB平板中挑取单个菌落，接种于5ml含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C培养过夜。使用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒，采用碱裂法裂解细胞后通过离心吸附柱在高盐状态下特异 性的结合反应溶液中的DNA。将所得质粒经BamH I和Hind在37°C酶切3h，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析目的片段，发现重组子在5000bp处出现pFastBacDual的条带，在1300bp处出现猪IFNy-Fc第二优化基因条带(如图8所示)。将双酶切鉴定正确的重组质粒测序，将测序结果正确的重组质粒命名为PFastBac-(IFNY-Fc)。本发明中也可人工合成猪IFNY-Fc第二优化基因，并将该基因直接亚克隆至PFastBacDual载体中；或将人工合成猪的IFNy-Fc第一优化基因直接亚克隆至pFastBacDual载体中。并基于此进一步进行下述实验。或者，作为优化方案，本发明中也可进一步针对猪IFNy-Fc第二优化基因的gp64信号肽部分进行密码子优化得到猪IFN Y -Fe第三优化基因，如SEQ ID NO:3所示。人工合成猪IFN Y-Fe第三优化基因，并将该基因直接亚克隆至pFastBac Dual载体中，基于此进一步进行下述实验。实施例三、杆状病毒BmN-QFN Y -Fe)的构律1.转移质粒 Bacmid-(IFN Y-Fe)的构建将5 μ L pFastBac-(IFN Y-Fe)质粒加入到100 μ L的DHlOBac感受态细胞中，冰浴30min后42°C水浴热激90s。将热激后产物迅速置于冰上冷却3min，再加入到已温育至37°C的900mLLB培养基中，37°C，220rpm震荡复苏lh。取100 μ L复苏后的菌液涂布于含50 μ g/mL 卡那霉素,7 μ g/mL 庆大霉素，10 μ g/mL 四环素，100 μ g/mL X_gal 和 40 μ g/mL IPTG 的LB固体平板上于37°C培养箱倒置培养。48h后从LB固体平板中挑取单个白色菌落加入含50 μ g/mL卡那霉素，7 μ g/mL庆大霉素，10 μ g/mL四环素的LB液体培养基中过夜扩大培养。提取Bacmid基因组DNA后使用M13通用引物进行PCR验证。所用引物如下:正向引物2:5’ -CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’反向引物2:5’ -AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’PCR反应体系为:10XPCR缓冲液5yL，2.5mM dNTP混合物4 μ L，10 μ M正反向引物各加IuL, DNA聚合酶0.25 μ L, Bacmid基因组DNAl μ L,加灭菌双蒸水补足体积至50 μ L0 PCR扩增条件为:94°C热变性4min ;94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸5min,进行30个循环；最后72°C延伸IOmin后于4°C保温。将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，从Bacmid DNA中扩增出与理论分子量相一致的目的条带(4000bp)(如图9所示)，说明已按要求正确构建了 Bacmid，所得质粒命名为Bacmid-(IFNY-Fc)质粒。未正确构建BacmidDNA的PCR扩增仅在300bp出现一条带。2.杆状病毒 BmNPV-(IFN Y-Fe)的构建按照Applichem公司的产品说明配置I X TC-100昆虫培养基，用2M NaOH调节pH至6.2，使用0.22 μ M的微孔滤膜过滤除菌后的培养基补加10%的胎牛血清，26°C下培养家蚕BmN细胞。将正确Bacmid-(IFN Y-Fe)利用 Invitrogen 公司的 Lipofectamine2000 转染试剂转染家蚕BmN细胞。分别向300 μ L无血清的TC-100培养基中加入5 μ gBacmid-(IFN y -Fe)质粒和18 μ L的Lipofectamine2000，室温孵育5min。将两者轻轻混匀后室温静置20min后滴加到4mL的无血清TC-100培养基中混匀，转染家蚕BmN细胞。于26°C恒温培养5h之后更换含10%胎牛血清的TC-100培养基，在26°C继续恒温培养4-5d。收集病毒感染后BmN细胞培养液，离心取上清即获重组杆状病毒，记为BmNPV-(IFNY-Fc)病毒，该重组杆状病毒为Pl代重组杆状病毒。将Pl代重组杆状病毒BmNPV-(IFNY-Fc)感染正常生长的单层家蚕BmN细胞，26°C培养5d后收集培养基上清液，获得P2代重组杆状病毒BmNPV- (IFN Y -Fe)。取P2代病毒感染单层家蚕BmN细胞，26°C恒温培养，感染72h后BmN细胞出现典型的细胞病变，收取病毒感染的BmN细胞培养基上清，获得P3代重组杆状病毒BmNPV- (IFN y -Fe)，4°C避光保存备用。实施例四、猪IFNy-Fc融合蛋白在家蚕BmN细朐中的表汰将P3代重组杆状病毒BmNPV-(IFNy-Fc)感染正常生长的单层家蚕BmN细胞，在26°C培养箱恒温培养。未感染病毒之前正常的BmN细胞，细胞呈圆梭状贴壁生长(如图ΙΟ-a所示)；而BmN细胞感染P3代重组杆状病毒BmNPV-(IFN Y-Fe)之后，细胞逐渐停止生长，细胞变圆，细胞核膨大，72h后BmN细胞失去贴壁性能而悬浮于培养基中(如图10-b所示)。经病毒感染的BmN细胞的培养液中表达了大量本发明的猪IFNy-Fc融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，收集并离心培养基上清，即获得P4代重组杆状病毒BmNPV-(IFNy-Fc)。实施例五、猪IFNy-Fc融合蛋白在家蚕幼虫中的表汰本实验所用的家蚕高表达品种为青松皓月，按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规 方法进行饲养。桑叶饲养家蚕到五龄，将蚕体表面用75%的乙醇消毒，用微量注射器分别吸取P4代重组杆状病毒BmNPV- (IFN Y -Fe)，按每头1.0 X IO6即5 μ L接种液中含2.0X IO7的pfu/ml的BmNPV-(IFN Y -Fe)重组病毒的量在蚕体腹节倒数第2和第3节间膜处穿刺接种重组病毒，26°C按常规桑叶饲养家蚕。4-5d后收集发病家蚕幼虫的蚕血淋巴，_20°C冰箱冻存备用。
_9] 实施例六、表达猪IFNy-Fc融合蛋白的鉴定利用TIANGEN公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒分别提取实施四例中P4代重组杆状病毒BmNPV-(IFN Y -Fe)的基因组DNA及实施例五中的家蚕幼虫蚕血淋巴的基因组DNA，分别以其为模板进行PCR基因扩增鉴定。PCR所用引物为实施例二中所述的正向引物I和反向引物I。PCR 条件如下:94°C热变性 4min ;94°C变性 45s，52°C退火 30s，72°C延伸 lmin，进行30个循环；最后72°C延伸IOmin后于4°C保温。取10 μ L反应产物1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，发现以家蚕BmN细胞和家蚕幼虫蚕血淋巴为模板PCR的产物条带出现在1200bp和1400bp中间，与预期大小相符(如图11所示)。证明在家蚕BmN细胞和家蚕幼虫已含有可表达本发明的猪IFNy-Fc融合蛋白的第二优化基因。向实施例四中含猪IFN 融合蛋白的重组BmN细胞培养基上清及实施例五中的家蚕幼虫蚕血淋巴中加入2父505凝胶加样缓冲液，1001:加热51^11，室温高速离心31^11。取上清于5%的浓缩胶和12%的分离胶中进行SDS-PAGE电泳。电泳是在浓缩胶的电压为80V，到达分离胶之后提升电压到120V，在溴酚蓝迁移到分离胶底部时停止电泳。使用IOOmA, I小时的方法进行半干法转膜蛋白质样品从PAGE凝胶转移至PVDF膜上固定；使用5%脱脂奶粉/TBST37°C封闭Ih ;使用1:1000稀释的鼠抗IFN Y 一抗抗体37°C孵育Ih后，加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗37°C孵育Ih ;加入鲁米诺和稳定型过氧化物溶液显色后放入凝胶成像系统进行荧光发光检测来验证猪IFNy-Fc融合蛋白的表达情况。发现在家蚕BmN细胞和家蚕幼虫中表达的猪IFNy-Fc融合蛋白在45kD左右处都出现抗IFN Y抗体的特异性目的条带(如图12所示)，证明在家蚕BmN细胞和家蚕幼虫已正确表达了猪IFNy-Fc融合蛋白。经测定BmN细胞中表达总蛋白浓度约为4.43029mg/ml ;蚕血总蛋白浓度为15.8556mg /ml。蚕血中目标蛋白(猪IFN Y-Fe融合蛋白)占总蛋白的百分比为7.91%，即目标蛋白(猪IFN Y -Fe融合蛋白)浓度为1.2541mg/ml。实施例七、猪IFNy-Fc融合蛋白生物学活性测定猪水泡性口炎病毒(VSV，其TCID50为5X 107/100 μ L，广东省农科院兽医研究所提供)可感染猪肾细胞(ΡΚ-15，广东省农科院兽医研究所提供)，本发明利用猪Y干扰素的抗病毒机制检测在猪肾细胞在猪Y干扰素存在条件下对猪水泡性口炎病毒的防御作用，通过检测ΡΚ-15细胞的病变情况得到猪Y干扰素对ΡΚ-15细胞的保护效应曲线，从而测定本发明的猪IFNy-Fc融合蛋白的生物学活性。1.阳性对照品溶液制备:取猪干扰素阳性对照品(猪基因工程重组细胞因子:IFN-LLS-2，购自香港曼普动物营养品有限公司。测定其效价为5 X 104U/mL)，按说明书复溶后，用含有6%胎牛血清的MEM细胞培养液(Gibico产品)按10倍一级逐级稀释。2.猪IFNy-Fc融合蛋白样品溶液制备:将实施例四含猪IFNy-Fc融合蛋白的BmN细胞的培养液上清和实施例五中含猪IFNy-Fc融合蛋白的家蚕蚕血淋巴，并用细胞培养液(含有6%胎牛血清的MEM培养液)做10倍梯度稀释，分别得到总蛋白浓度为1.6mg/mL、1.6X 10 img/mL、1.6X 10 2mg/mL、1.6X 10 3mg/mL、1.6X 10 4mg/mL、1.6X 10 5mg/mL 的含猪IFNy-Fc融合蛋白溶液。
3.在96孔板上每孔加入不同浓度的猪IFN Y-Fe融合蛋白溶液50 μ L，再加入新鲜传代的PK-15细胞悬液(细胞浓度约为1.8X 106-2.2X IO6个/mL)50 μ L，在37°C、5% CO2条件下孵育约24h后，ΡΚ-15细胞贴壁生长至单层。吸去含猪IFNy-Fc融合蛋白的细胞培养液，每孔加入100 μ L含100个TCID50的VSV病毒稀释液(用含2%胎牛血清的MEM培养液)。同时设立病毒对照孔(只加同样剂量的病毒，不加干扰素)和细胞对照孔(只加细胞培养液，不加干扰素)。37°C,5% CO2条件下培养24h后，待病毒对照孔的细胞病变90% —100%时观察结果。以引起半数孔的细胞病变的干扰素的量为一个单位(记为“U”)。 实验结果显示，阴性对照病毒组中的细胞均发生明显病变，空白细胞对照组中细胞生长正常。以引起半数孔的细胞病变的干扰素的量为一个单位(记为“U”)，通过显微镜观察阳性对照存在条件下PK-15细胞生长未受VSV病毒影响的细胞数，确定阳性对照干扰素的效价为3.2X104U/mL。显微镜观察猪IFNy-Fc融合蛋白存在条件下PK-15细胞生长未受VSV病毒影响的细胞数，计算得到在BmN细胞中表达的猪IFN Y -Fe融合蛋白的效价为2X104U/mL，在家蚕幼虫中表达的猪IFNy-Fc融合蛋白的效价为6.4X 104U/mL，表明本发明中制备的猪IFNy-Fc融合蛋白具有显著的抗病毒活性。
权利要求
1.种猪IFNy-Fc融合蛋白，其氨基酸序列包含有猪、干扰素蛋白序列的成熟肽部分，在猪Y干扰素蛋白序列C端的终止密码子之前添加有Fe蛋白序列。
2.权利要求1所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0:4所示。
3.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括在猪Y干扰素蛋白序列的成熟肽部分之前添加的gp64信号肽序列。
4.种编码权利要求3中所述的融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO:2或SEQID NO:3 所示。
5.种质粒，所述质粒具有权利要求4的基因。
6.权利要求5所述的质粒,所述质粒为Bacmid。
7.种病毒,所述病毒具有权利要求5或6中的质粒。
8.权利要求7所述的病毒，所述病毒为BmNPV杆状病毒。
9.种猪IFNy-Fc融合蛋白的表达方法，其特征在于，包含如下步骤: (1)将权利要求8中的杆状病毒感染家蚕BmN细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫； (2)感染的家蚕BmN细胞或者穿刺 接种的家蚕幼虫表达产生猪IFNy-Fc融合蛋白。
10.种含有如权利要求1或2所述的融合蛋白的药品或饲料。
全文摘要
本发明提供了一种依据家蚕反应系统优化的猪IFNγ-Fc融合蛋白及其编码基因和利用家蚕生物反应器表达猪IFNγ-Fc融合蛋白的方法，属于生物基因工程领域。猪干扰素γ作为一种非特异性广谱抗病毒生物制剂在兽药领域具有广阔的药用前景，但是与大多基因工程兽药一样，猪干扰素γ也存在着产量不足、价格昂贵、质量参差不齐、作用时间较短等问题。本发明利用家蚕表达体系对优化后的猪IFNγ-Fc融合蛋白基因进行表达，得到了表达效率较高活性较强的目的蛋白。此外，Fc片段的添加延长了猪干扰素γ的作用时间，增强了整体免疫调节作用，且便于后期纯化，从而使采用基因工程方法大规模生产猪IFNγ-Fc融合蛋白制剂成为可能，也为开发含有该融合蛋白的新型饲料创造了条件。
文档编号A23K1/16GK103087200SQ20131003010
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者马永, 钱林, 徐春林, 陈晨, 王耀方 申请人:江苏众红生物工程创药研究院有限公司, 常州京森生物医药研究所有限公司