专利名称：一种腺病毒载体介导的立体状态牙胚成釉细胞基因转染方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及牙胚的基因转染及成釉细胞的基因功能 研究，特别涉及一种腺病毒载体介导的立体状态牙胚成釉细胞基因转染方法。
背景技术：
基因转染是将外源性基因片段转入到宿主细胞表达，是研究基因功能的 重要方法之一，以单层培养细胞作为宿主细胞的基因转染来研究其基因功能 已得到广泛应用。腺病毒载体是目前表达载体较为常用的一种，通常重组的
腺病毒载体包括复制缺陷型和增殖型两种；而且通过腺病毒载体的介导能够 将一些外源性的基因导入一般表达载体较难导入的组织或细胞，如视网膜、 呼吸上皮、胎盘和粘膜下腺等(EhrengruberMU， HennouS， BuelerH， Nairn HY， Deglon N， Lundstrom K. Gene Transfer into Neurons from Hippocampal Slices: Comparison of Recombinant Semliki Forest Virus, ， Adenovirus ， Adeno-Associated Virus, Lentivirus, and Measles Virus. Mo/ecw/ar otwd CW/wAar A^wmsc/e"ce 2001 May;17(5):855-71; Takahashi M， Delivery of genes to the eye using lentiviral vectors, AfeAo<* Afo/ 5/o/ 2004， 46:439-49.)。同时月泉病毒 (AAV)在基因治疗方面也体现出了安全、长效等特征。
AAV-GFP表达载体是一种包含绿色荧光标记GFP基因的常用腺病毒 表达载体(McCarty,D.M.，Christensen，M.,Muzyczka,N.，1991 .Sequences required for coordinate induction of adeno-associated virus pi 9 and p40 promoters by Rep protein. J. Virol.65，:2936 2945; Zolotukhin， S., Potter,M.， Hauswirth,W.W., Guy,J., Muzyczka，N.， 1996. A " humanized "green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells丄Virol.70,4646 C4654 )， 禾U用AAV-GFP表达载体转染人胚肾AAV-293细胞，得到具有传染性的病毒颗粒。 牙胚是一个特殊的器官，可以发育最终形成未来的牙齿。牙胚的发生和 发育包括牙板、蕾状期、帽状期和钟状期等，既有一定的独立性，又于周围 组织存在一定的互动，牙胚内上皮和间充质来源的两种组织相互影响彼此的 发生。成釉细胞是分泌牙釉质基质的一种上皮细胞，出现于钟状期牙胚，位 于成釉器之中，表现为一均匀分布的细胞层，当其分泌牙釉质基质蛋白结束 后，细胞会逐步退化消失。成釉细胞与周围的组织和细胞接触紧密，无法彻 底分离。
目前有一些适合于牙胚体外培养的模型，这些模型采用立体培养牙胚的 方法，包括采用琼脂基质、滤膜、Trowe11系统等(Onishi T, Shintani S, Wakisaka S ， Ooshima T. Relationship of vitamin D with calbindin D9k and D28k expression in ameloblasts, 爿rc/z Ora/ 5/o/ 2008 February, 53(2):117-23; Torres誦Quintana MA， Lecolle S ， Goldberg M. Effects of inositol hexasulphate, a casein kinase inhibitor, on dentine phosphorylated proteins in organ culture of mouse tooth germs. Ac/2 Ora/所o/1998 August, 43(8):597-610)。
相对于其他细胞，成釉细胞数量少，与周围的组织和细胞接触紧密难以
分离，采用常规的机械分离或酶消化等原代细胞培养方法，很难获取足够数 量成釉细胞进行原代培养，其体外基因转染效率就更低，使得目前国际研究 成釉细胞的基因功能采用的是一些细胞系如LS8 (Zhou YL， Snead ML. Identification of CAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. Journal of Biological Chemistry 2000 April 21 ， 275(16):12273-80)和PABSo國E (DenBesten PK, Gao C， Li W, Mathews CHE， Gruenert DC， Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast國like cell line, European Journal of Oral Sciences 1999
4August;107(4):276-81.)等。LS8和PABSo-E细胞系不能完全反应体内成釉 细胞立体生长的状态，不能满足对于其基因功能研究的需要，尤其是从三维 的角度研究牙胚中成釉细胞的基因功能；成釉细胞在分化过程中，存在一个 高度、生长极性的系列变化，这些特征体现了细胞的不同分化阶段，在细胞 单层培养体系，这些三维或极性特征较难维持。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种腺病毒载体介导的立体状态牙胚成釉细 胞基因转染方法，通过腺病毒载体将外源性基因导入到Tmnswell系统体外培 养的牙胚，有利于从三维的角度研究牙胚中成釉细胞的基因功能。
本发明是通过以下技术方案来实现
一种腺病毒载体介导的立体状态牙胚成釉细胞基因转染方法，其特征在 于，包括以下步骤
1) 将分离到的初生牙胚牙尖向上置于Tmnswdl内置小室的微孔滤膜 上，Transwell内置小室位于含有牙胚培养液的孔板内；所述牙胚培养液为 BGJb培养液，还包含体积分数为0.1%的胎牛血清、100 IU/ml的青霉素、 80pg/ml链霉素和5 mg/L肝素；每孔中加入lml牙胚培养液，在37 °C、体 积分数为5%的C02孵育箱饱和湿度下培养；
2) 以包含GFP基因的腺病毒载体AAV-GFP感染人胚肾AAV-293细胞， 产生具有传染性的病毒颗粒，将病毒颗粒与牙胚培养液混和制备成病毒浓度 为500 5000 MOI的感染液；
3) 将感染液加入培养有牙胚的Tmnswell内置小室，感染后48小时，移 去感染液，牙胚继续用牙胚培养液培养，并每天更新牙胚培养液；
4) 当牙胚的表层出现绿色荧光时，结合釉原蛋白的免疫染色，在牙胚定 位GFP和釉原蛋白共表达的牙胚成釉细胞。与现有技术相比，本发明有益的技术效果如下
1、 本发明对Transwdl体系的培养条件进行改进，首次实现了利用 Tmnswdl系统体外培养牙胚，牙胚在此环境下可以很好的生长，保持良好的 组织形态，牙釉质成釉细胞细胞保持着立体状态，可以持续生长；出生一天
(Pl)的小鼠磨牙牙胚可以在Transwell系统持续生长，组织外形完好，在 培养期间，可以观察到牙尖变得锐利，釉质增厚，可以在2周内维持较佳的 生长状态。
2、 将外源性的标志基因GFP通过腺病毒载体介导转染到Transwdl系统 体外培养的小鼠磨牙牙胚，腺病毒-GFP载体(AAV-GFP)感染后24小时， 即在牙胚的表层出现绿色荧光，感染后2天GFP的表达增强，到第3和第4 天后荧光强度基本稳定，腺病毒载体介导外源性基因转染牙胚成功。
3、 GFP的表达定位与组织块法免疫荧光染色对釉原蛋白的染色结果对 比得到GFP的表达与釉原蛋白的染色有一定的交叉，GFP和釉原蛋白共表 达细胞的比例占总釉原蛋白阳性细胞的50%,成釉细胞的基因转染效率相当 高。
4、 在Transwell系统体外培养牙胚的成釉细胞保持着立体状态，即体内 三维生长状态，成釉细胞与周围的基质和相关细胞存在互动，而这种模式下 基因转染成釉细胞成功，其基因转染效果更能反应体内的生命活动，有利于 从三维的角度研究牙胚中成釉细胞的基因功能。
图1为Transwell系统体外培养牙胚的培养模式图，牙胚从动物体内分离 后，将其牙尖向上正置于Transwell内置小室的微孔滤膜上；其中，1为 Tmnswell内置小室，2为微孔滤膜，3为下层腔室，4为上层腔室，5为牙胚；
图2是采集新生小鼠牙胚中AAV-GFP基因转染后绿色荧光蛋白的表达 图，图中较亮的点为绿色荧光，荧光显微镜4倍显示；图3是新生小鼠牙胚中AAV-GFP基因转染后组织块法免疫荧光染色釉 原蛋白，激光共聚焦显微镜40倍显示，由于采用Hoechst 33342作为荧光染 料，釉原蛋白阳性呈红色荧光，绿色荧光的GFP与红色荧光标记的成釉细胞 存在共定位，GFP阳性细胞占成釉细胞的50%;其中，图3a表示细胞核， 图3b表示细胞表面的绿色、红色荧光共显示。
具体实施例方式
下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
如图1所示，Transwell是一种细胞培养的支架系统，Transwell内置小室
1的底层为微孔滤膜2，微孔滤膜2的下层为下层腔室3，上层为上层腔室4，
外周为环形支架。
将Transwell系统置于24孔板的孔内，由于底层的微孔滤膜2具有通透 性，下层腔室3的培养液能够及时的供应微孔滤膜2上的培养物的生长，适 合于上皮细胞的立体极性生长。
本发明将Transwell系统置于包含牙胚培养液的24孔板的孔内，培养的 牙胚置于微孔滤膜2上。
1、利用Transwell系统体外培养牙胚
a、 在解剖显微镜下，从出生第一天的C57BL6小鼠相应的上下颌位置 分离磨牙牙胚，分离过程中保证组织处于4°C，用冰浴的pH7.2的磷酸盐缓 冲液(PBS， phosphate-buffered saline)清洗分离的磨牙牙胚两次，每次5分 钟；
b、 然后将分离的磨牙牙胚其牙尖向上置于Transwell内置小室的微孔滤 膜上(如图l所示)，Tmnswell内置小室位于含有牙胚培养液的24孔板内， 在37 °C、体积分数为5%的C02孵育箱饱和湿度下培养2周；所述牙胚培 养液以BGJb培养液(Fitton-. Jackson modification, Gibco， Grand Island, NY， 目录号12591038)为基础培养液，所配制的牙胚培养液还包含体积分数为
70.1%的胎牛血清、100IU/ml的青霉素、80pg/ml链霉素、5 mg/L肝素；每 孔中加入lml培养液。
2、 基因转染
a、 感染性腺病毒病毒颗粒的制备
使用含GFP (绿色荧光蛋白)基因的腺病毒载体AAV-GFP，感染人胚肾 AAV-293细胞，产生具有传染性的病毒颗粒，用斑点杂交法测定重组病毒颗 粒的滴度，并按lxl(^感染复数(multiple ofinfection， MOD病毒颗粒浓度 制备浓縮的病毒感染储存液，至于-80。C冰箱储存。
b、 腺病毒颗粒感染体外培养的牙胚
用牙胚培养液将浓縮的病毒感染储存液稀释至500 5000 MOI，然后将 稀释后的病毒感染液加入培养有牙胚的Transwell内置小室，病毒感染牙胚后 48小时，移去病毒感染液，牙胚继续用牙胚培养液培养，并每天更新牙胚培 养液。
采用Olympus IX 71荧光倒置显微镜每日固定时间点观察GFP的表达情 况，并在相同的图像采集条件下拍摄(1/45sec)。
3、 组织块法免疫荧光染色标记釉原细胞
腺病毒颗粒感染牙胚后每天时间点取样，用冰浴的4%多聚甲醛4。C固 定20分钟，倾去固定液并用PBS洗涤后，封闭液(含有5%山羊血清和0.3% TritonX-100的0.01MPBS)室温封闭1小时；
然后进行常规免疫荧光染色用兔抗小鼠釉原蛋白抗体4°C孵育过夜，
通过Cy3标记的羊抗兔IgG (H+L， Jackson ImmunoResearch)禾口 1 jug/ml Hoechst33342 (购自Molecular Probe公司)37°C孵育1小时，PBS洗涤后， 将其置于一个有中心凹陷的载玻片，采用防荧光淬灭剂(ProlongAntifade ， 购自Molecular Probe公司)封片。
采用激光共聚焦显微镜拍摄照片，通过与采集的GFP表达的图像做比
8较，集中观察牙尖部位的荧光特征。
4、 GFP表达和釉原蛋白表达的定位比较
AAV-GFP感染牙胚24小时后，即在牙胚的表层出现绿色荧光，GFP表 达于磨牙的边缘，釉质区存在更多的GFP表达，特别是牙尖部位，在牙胚的 根部也有一些散在的GFP荧光斑点，如图2所示，其中较亮的部分为GFP 荧光斑点。感染后2天，GFP的表达增强，到第3和第4天后，荧光强度基 本稳定；与1000MOI相比，同一时间点5000MOI组表现出较强的荧光强度 (如图2所示)。结果表明，采用腺病毒载体介导的基因转染在小鼠磨牙牙胚 获得了较高的转染效率，阳性转染细胞的百分比大于50%，并且GFP的表达 可持续在7天以上，该种方法简单易行，所使用的AAV病毒颗粒浓度相对 较低。
组织块免疫荧光显示在牙尖部位有釉原蛋白的阳性红色荧光染色，这些 荧光代表了釉原蛋白在成釉细胞内外的分布，而GFP同样在牙尖有表达。与 采集的GFP表达图像比较，有GFP绿色荧光和釉原蛋白的阳性红色荧光染 色处于同样的位置，GFP和釉原蛋白共表达细胞的比例占总釉原蛋白阳性细 胞的50%，如图3所示。
上述比较发现GFP的表达定位与成釉细胞的釉原蛋白的染色有一定的 交叉，表面成釉细胞是主要的被感染细胞，成釉细胞表达GFP占其总数的 50%，说明成釉细胞的基因转染成功率相当高。同时在Transwell系统体外培 养牙胚模型下，成釉细胞保持着体内三维生长状态，与周围的基质和相关细 胞存在互动，成釉细胞的基因转染成功可以作为研究成釉细胞某些基因功能 的一个很好模型，这种模式下的基因转染效果可持续在7天以上，能够较长 时间的反应成釉细胞分化的过程，更能反应体内的生命活动。
权利要求
1、一种腺病毒载体介导的立体状态牙胚成釉细胞基因转染方法，其特征在于，包括以下步骤1)将分离到的初生牙胚牙尖向上置于Transwell内置小室的微孔滤膜上，Transwell内置小室位于含有牙胚培养液的孔板内；所述牙胚培养液为BGJb培养液，还包含体积分数为0.1％的胎牛血清、100IU/ml的青霉素、80μg/ml链霉素和5mg/L肝素；每孔中加入1ml牙胚培养液，在37℃、体积分数为5％的CO2孵育箱饱和湿度下培养；2)以包含GFP基因的腺病毒载体AAV-GFP感染人胚肾AAV-293细胞，产生具有传染性的病毒颗粒，将病毒颗粒与牙胚培养液混和制备成病毒浓度为500～5000MOI的感染液；3)将感染液加入培养有牙胚的Transwell内置小室，感染后48小时，移去感染液，牙胚继续用牙胚培养液培养，并每天更新牙胚培养液；4)当牙胚的表层出现绿色荧光时，结合釉原蛋白的免疫染色，在牙胚上定位GFP和釉原蛋白共表达的牙胚成釉细胞。
全文摘要
本发明公开了一种腺病毒载体介导的立体状态牙胚成釉细胞基因转染方法，包括以下步骤将分离到的初生牙胚牙尖向上置于Transwell内置小室的微孔滤膜上，在包含牙胚培养液下培养；使用含AAV-GFP基因的传染性病毒颗粒，感染培养的牙胚；感染24小时后在牙胚的表层出现绿色荧光，结合釉原蛋白的免疫染色，在牙胚定位GFP和釉原蛋白共表达的重组牙胚成釉细胞。在Transwell系统体外培养牙胚的成釉细胞保持着立体状态，成釉细胞与周围的基质和相关细胞存在互动，而这种模式下基因转染成釉细胞成功，有利于从三维的角度研究牙胚中成釉细胞的基因功能。
文档编号C12N15/861GK101586121SQ20091002299
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月19日 优先权日2009年6月19日
发明者段小红, 勇 毛 申请人:中国人民解放军第四军医大学