专利名称：一个编码冰缘植物冷诱导蛋白基因及其在抗冻转基因烟草中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个编码冰缘植物冷诱导蛋白基因及其在抗冻转基因烟草中的应用， 特别是涉及一个编码高山离子芥GRP(Glycine-rich RNA bindingprotein)基因及其在抗 冻转基因烟草中的应用。
背景技术：
GRP基因编码一类受低温诱导而产生的蛋白(冷诱导蛋白)，是主要的基因转录后 调节蛋白家族，特别是在植物非生物胁迫应答中，这种蛋白发挥了重要功能(Mazzucotelli E et al 2008)。GRP是一种RNA结合蛋白，其分子结构的特征是N-端含有一个保守的RNA 识别区域(RRM)，在C-端是富含甘氨酸的酸性区域，甘氨酸的含量可高达70%。GRP蛋白 是一种胁迫应答蛋白，在胁迫下GRP作为一种分子伴侣与单链RNA结合，防止其重新自发折 叠。目前对拟南芥GRP基因家族中的AtRZ-Ia (C-端含有zinc-finger结构的GRP)的研究 比较深入，AtRZ-Ia是一种冷诱导蛋白，转基因过表达AtRZ-Ia的拟南芥已经构建成功(Kim Y0, et al. 2005, Kim Y0, et al. 2006)。在低温胁迫下，与野生株相比，过表达AtRZ-Ia的 转基因拟南芥出芽较早，播种苗生长好。而且与野生株相比，过表达株的冷冻耐受性更好。高山离子芥是十字花科离子芥属多年生植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石 质山坡上。其环境条件的特点是气候寒冷、空气稀薄、辐射强、劲风。本实验采样地处 于43. 05N，86. 49E的乌鲁木齐河源区流石碓，海拔3600 3900m。该地区年平均气温 在-5 -7°C之间，6 8月平均气温为3. 6°C，气温日差较大，是一种伴随反复冻融的冰冻 环境。并且处于迎风坡，流石碓中砾石保水性差，时常造成干旱胁迫。高山离子芥在外部形 态结构和生态策略上没有显著的抗性特征，为了耐受长期低温、强紫外、大风和生理干旱， 适应这些不利的环境条件，势必通过表达抗性基因来维持自身的生理代谢和生长发育，以 避免或减轻严酷的环境胁迫的危害。高山离子芥与拟南芥同属于十字花科，两者的基因组具有很高的保守性。由于高 山离子芥处于冰缘环境，积累了适应低温的有益突变，所以克隆高山离子芥的GRP基因并 应用到转基因作物中具有广阔的应用前景。
发明内容
鉴于上述，本发明的目的是提供一种编码冰缘植物冷诱导蛋白基因及其编码产 物；本发明的另一目的提供编码冰缘植物冷诱导蛋白基因在抗冻转基因烟草中的应用。(1) 一种编码冰缘植物高山离子芥GRP (Chorispora bungeana GRP, ChGRP)冷诱 导蛋白基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示1)序列表中序列1的DNA序列；ATGGCGTCCGCAGATGTTGAGTTCAGGTGCTTCGTTGGCGGTCTAGCCTGGGCCACTGATGACAGAGCTCTCGAGACTGCATTCTCCCAGTACGGCGACGTTGTTGATTCCAAGATCATTAACGACCGTGAG
ACCGGAAGATCAAGGGGATTTGGATTCGTCACATTCAAGGACGAGAAATCCATGAAAGACGCCATT
GAGGGAATGAACGGACAAGATCTCGATGGTCGCAGCATCACTGTGAACGAGGCTCAGTCCCGTGGAAGCGGTGGCGGAGGTGGTGGCCGTGGAGGCGGCGGTGGTGGATACCGCAGCGGTGGAGGCGGTGGCTATGGAGGTGGTGGTGGAAGTTACGGAGGCGGTGGAGGTAGACGCGAGGGTGGATACAGCGGCGGTGGTGGAGGCTACCCCTCAAGAGGAGGTGGCGGAGGAGGTTACGGTGGTGGTGGTGGCCGACGTGAGGGTGGATACGGAGGTGGTGAAAGTGGTGGATACGGAGGAAGCGGTGGAGGTGGAGGCGGATGGTAA。(2) 一种由序列表中序列1的DNA序列所述的核苷酸序列所编码的蛋白质，它具有 序列表中序列2的氨基酸残基序列。2)序列表中序列2的氨基酸序列MASADVEFRCFVGGLAWATDDRALETAFSQY⑶VVDSKIINDRETGRSRGFGFVTFKDEKSMKDAIEGMNGQDLDGRSITVNEAQSRGSGGGGGGRGGGGGGYRSGGGGG
YGGGGGSYGGGGGRREGGYSGGGGGYPSRGGGGGGYGGGGGRREGGYGGGESGGYGGSGGGGGGW。本发明中的GRP基因和拟南芥的DNA序列具有90%以上同源性(图1)，且编码相 同功能蛋白质，蛋白序列的同源性在80%以上(图2)。本发明序列表1的DNA序列有528个碱基组成，编码序列表2中由176个氨基酸 残基组成的蛋白质序列。含有本发明基因CbGRP的表达载体及细胞系也在本发明的保护范围之内。将序列 1基因的cDNA插入植物表达载体pBI121 (Clontech公司)的CAMV35S启动子下游的BamHI/ Xba I之间，得到重组表达载体pBI121-CbGRP(其图谱如图1所示)，用冻融法(《植物基因 工程》，王关林主编)将重组载体pBI121-CbGRP转化到根瘤农杆菌LBA4404 (Invitrogen公 司)中。含有重组质粒pBI121-CbGRP的根瘤农杆菌LBA4404侵染烟草叶盘，叶盘在过夜培 养的对数生长期农杆菌菌液中浸6-9秒种后，置于培养基上共培养，待菌株在叶盘周围生 长至肉眼可见菌落时再转移到含有抑菌剂的培养基中除去农杆菌，同时在该培养基中加入 抗生素进行转化体选择，3 4周培养可获得转化的再生植株。转基因植株的冷冻耐受性实验。借助农杆菌介导的转化，分析了 CbGRP基因在组 成型过表达时对烟草植株抗冻性的影响。CbGRP转基因阳性烟草植株，在MSIII (KanlOOmg/ L+Cef500mg/L)中继代培养，每罐放4个植株。同时在另一培养罐中接种4个非转基因烟草 继代培养植株。同时置25°C光照培养。至长出2片叶片。两罐同时进行冷处理。冷处理程 序0°C 24h，-4°C 24h，恢复25°C光照培养，培养15天后，发现转基因烟草植株叶片长大，面 积从0.41 士0.03cm2生长至1.03士0.04cm2，ρ < 0. 05，二者有显著性差异。而非转基因植 株叶片面积基本不变，由0. 39士0. 06cm2,生长至0. 42士0. 07cm2, ρ > 0. 05，二者无显著性差 异。说明，与非转基因植株相比，转基因植株有较高的冷冻耐受性(见图2)。
图1为表达载体的构建图谱。图2为对照和转基因植株抗冻的比较。
具体实施例方式在本发明下述的实施例中，所用的实验材料为高山离子芥(C.bimgeana)和烟草 (Nicotiana tabacum)。实施例1.高山离子芥GRP基因序列的克隆高山离子芥采样。拟定候选标准是无分泌蜡质的腺体、无表皮绒毛、无角质层加 厚；利用采集杖挖掘冰川附近的高山离子芥植物，用聚乙烯袋收集带土植株，运输时去掉聚 乙烯袋移栽到塑料泡沫运输箱内。利用RNA提取分离试剂盒(Trizol GibcoBRL)分离高山离子芥叶片中总RNA。其 具体方法是收集高山离子芥材料lOOmg，立即置于液氮中研磨，加入Iml Trizol试剂，充 分混勻；室温放置5min ；加入0. 2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15s，室温温育3min ；4°C，12000g离 心15min ；上清水相转移到一个新的1. 5ml离心管中，加入0. 5ml异丙醇沉淀RNA ；RNA沉淀 用Iml 75%乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，-70°C保存备用。根据生物信息学提供的序列资料设计以下引物5，端引物TACTCTAGAATGGCGTCCGCAGATGTT (其中划线序列为 Xba I 位点)；3，端引物:AATAGGATCCCCATCCGCCTCCACCTCC,(其中划线序列为 BamH I 位点)。通过RT-PCR扩增得到CbGRP的cDNA序列，具体方法是依据Plant RT-PCRKit 2. 01 (TaKaRa ,Japan)的用户手册进行。1-2 μ g总RNA (大约1-2 μ 1)，和Kit的各种反转录 试剂混合(MgCl2 4μ 1 ;10XRNA PCR Buffer 2 μ 1 ；RNaseInhibitor 0. 5 μ 1 ；RNase free Water 8. 5 μ 1 ；dNTP Mixture 2 μ 1 ；ReverseTranscriptase 1 μ 1 ；Oligo dT-Adaptor Ιμ )。混勻后，42°C 30min ;99°C 5min ;5°C 5min，完成反转录反应。吸取2μ1反转录产 物，作为模板进行PCR反应94°C 2min后进入扩增程序94°C lmin、62°C lmin、72°C lmin， 30个循环后，72°C 7min。扩增得到的CbGRPcDNA序列自起始密码子到终止密码子总长528 碱基，编码176个氨基酸，推测分子量16. 7kD，等电点5. 43。2、CbGRP基因的表达模式比较蛋白质组学研究发现，与对照组相比，CbGRP在高山离子芥冷适应过程中是积累的。Western-blotting杂交表明，CbGRP在高山离子芥冷适应过程中在根，茎，叶中都 是积累的，无组织表达特异性。Quantitative real-time RT PCR试验表明，CbGRP的mRNA的转录在高山离子芥 冷适应过程中是升高的。2. 1.蛋白组学研究方法2. 1. 1高山离子芥冷适应的处理挑选非缺刻缘型高山离子芥再生植株，高度约4厘米，分为两组，一组置于4°C光 照培养箱，光照16/8hrs，冷适应30天，另一组置于20°C光照培养箱，光照16/8hrs，培养30 天，作为对照组。2. 1. 2高山离子芥冷适应叶片蛋白的提取及2-D电泳样品的处理分别取冷适应和对照植株的叶片500mg，加液氮研磨，分别加入300ul的细胞裂解 缓冲液(50mM Tris,pH8. 0,2mM EDTA, 50mMNaCl, and proteaseinhibitor cocotail)混勻，
5冰浴20min, 12000rpmX 30min,吸取上清 300ul。按操作说明，用 cleaning up Kit (Bio-RAD) 处理提取上清。2. 1. 3 2-D 电泳2. 1. 3. 1 等点聚焦将1.3 cleaning up kit处理提取的沉淀中加入等点聚焦样品缓冲液(7Mure a ,2Mthiourea, 0. 05 % dodecylmaltoside,4 % 3-[ (3-cholamido-propyl)-dimethylammonio]-1-pro pane sulfonate,20mMTris,20mM DTT,0.5 % IPG buffer, and 0.001 % bromophenol blue)350ul，用酚试剂法测定蛋白浓度，等点聚焦上样蛋白量为600ug/350ul/胶条。等 点聚焦胶条为PH3-10，17cm固定化胶条。上样方法为聚焦盘上样法。在PROTEIN IEF cell (BioRad)上进行等点聚焦。等点聚焦程序:50V主动水化16hr ；250V,快速30min ； 1000V 快速 Ihr ； 10，000V 线性 5hr ； 10，000V 快速，直到 60，000V/hr ；500V 快速保存。等点聚焦完成后，将胶条置于胶条盘中，加入6ml的胶条平衡缓冲液I (50mMTris， ρΗ8·8，6Μ urea, 30% glycerol, 2% SDS, and 20mM DTT)，室温摇床 10_15min，取出胶条平衡 缓冲液 I，加入胶条平衡缓冲液 II(50mMTris, ρΗ8· 8，6M urea, 30% glycerol, 2% SDS, and 20mM iodoacetamide)，室温摇床15min。倒出胶条平衡缓冲液II。将胶条浸入电泳缓冲液 中，轻轻漂洗，置于干净的滤纸上。2. 1. 3. 2 SDS-PAGE 电泳配制12%的SDS-PAGE胶，将等电聚焦胶条置于SDS-PAGE胶的上方，加5ml 1 %的 低溶点琼脂糖，用特制镊子将等电聚焦胶条推下与SDS-PAGE胶上沿紧密接触，直到低溶点 琼脂糖凝固，开始电泳，电泳程序，70V，45mins，145V，8hrs。2. 1. 3. 3考马斯亮兰染色SDS-PAGE 电泳结束后，用 1 % 的 Coommassie brilliant blue R250(l % Coommassie brilliant blue R250,10 % HAc, 30 % methol)染色 lhr，脱色液(10 % HAc， 30% methol)脱色至背景无色。2. 1.3.4 2-D胶的表达分析PAGE凝胶用凝胶成像仪成像，用Imaginmaster 2D Elite software软件进行分 析。2. 1. 3. 5目的蛋白点的挖取和处理根据软件分析结果，用毛细管吸取表达升高最大的4个点，放入EP管加入20ul 5% HAc, -80°C保存，送相关单位进行质谱测定。2. 1. 3. 6 MALDI-TOF-MS 和数据库查询由上海基康生物技术公司，复旦大学医学生物中心，中国国家蛋白质组学中心进 行质谱测定和数据库查询。质谱结果在http //www, matrixscience. com上通过Mascot序 列查寻程序与NCBInrdatabase进行比对。 2. 2. ffestern-blottong 杂交 SDS-PAGE 电泳结束后，将凝胶按照标准程序(Sambrook J,Fritsch EF,ManiatisT 1989)进行Wester-blotting分析。特异性抗体为自行制备的CbGRP多克隆抗体，按一定稀 释度稀释后使用。第二抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体(Sigma)，按标示浓度使用。显色用ECL(Amersham)显色剂。2. 3. Quantitative real-time RT-PCR冷适应0.5(1、1(1、2(1、3(1、7(1、10(1、20(1、30(1高山离子芥叶片2(^，用111^201试剂研磨 提取RNA，变性琼脂糖电泳确认RNA的完整性。用PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) (Takara)进行反转录合成cDNA。目的基因的定量real-time PCR用SYBR Premix EX Taq(Perfect Real Time)(Takara) ^t iCycler iQ Real-time PCR system(Bio-RAD) 上进行。Real-time RT-PCR 所用 CbGRP 特异性引物为 CbGRPRTF(5 ‘ -AGGGGATTTGGATTC GTCAC-3 ‘和 CbGRPRTR (5 ‘ -GGACTGAGCCTCGTTCACAG-3 ‘ )。Real-Time PCR 程序为a 95°C 10sec，b(95°C 5sec-60°C 20sec)，b循环40次。内控用高山离子芥actin基因特异性 引物 CbActinRTF (5 ‘ -ATACGCTCTTCCACACGCTATTC-3 ‘)和 CbActinRTR (5 ‘ -TCACGATTTCAC GCTCTGCT-3‘ )。RT-PCR所用 RNA 量与 CbGRP 相同。Real Time PCR程序为a 95°C IOsec, b (95°C 5sec-59°C 20sec)，b 循环 40 次。3. CbGRP在烟草中过表达表型观察3. lpBI121_CbGRP重组质粒的构建将CbGRP的全长编码序列亚克隆到PBI121的BamH I/Xba I (见图1)，转化到大 肠杆菌DH5a感受态细胞中，挑选4单克隆接种到LB(50ug/mlKan)中，碱裂解法提取质粒， BamH I/Xba I双酶切鉴定重组质粒。3. 2 pBI 121-CbGRP 重组质粒转化 LBA4404 农杆菌LBA4404农杆菌在YEB(Rif+)平皿上画线，挑取单克隆接种于YEB(Rif+)液体培 养液，28 °C摇床过夜，1 50转接YEB(Rif+)，28°C摇床培养至0D600 = 0.5。吸取1. 5ml 于1.5ml离心管，冰浴lOmin，12000rpm离心lmin，弃上清，沉淀悬于1. 5ml0. 5MNaCl, 冰浴20min，12000rpm离心lmin，弃上清，沉淀悬于100ul20mM CaCl2，用于转化。2ul pBI 121-CbGRP重组质粒加入到50ul农杆菌感受态细胞中，冰浴30min，放入液氮中5min，然 后立即放入37°C水浴5min，取出离心管，加入0. 5mlYEB，28°C摇床5小时。取出菌液涂于 YEB (Rif+Kan+)平皿上，挑取单克隆接种于YEB (Rif+Kan+)液体培养基2ml中，28°C摇床过 夜，菌体为模板PCR鉴定转化阳性菌。3. 3转化pBI121-CbGRP重组质粒的LBA4404农杆菌转染烟草叶盘挑取转化pBI121-CbGRP重组质粒的LBA4404农杆菌单克隆，接中于 YEB (Rif+Kan) 2ml 中，28 °C 摇床过夜，1 50 转接同一 YEB 培养液，28 °C 培养至 0D600 = 0. 5， 用YEB稀释至0D600 = 0. 2，将菌液倒入无菌平皿中待用。烟草无菌试管苗，培养4周，挑取无菌叶片，用无菌6mm打孔器凿成圆盘，浸 入菌液中，浸泡3分钟，取出叶盘，在无菌滤纸上吸去附着的菌液，接种分化培养基 MSI (MS+IAA1. 0mg/L+KT2. Omg/L)，28 °C暗培养3天。3天后，将叶盘转接到选择培养基 MSII(MS+IAA1. 0mg/L+KT2. 0mg/L+Kanl00mg/L+Cef500mg/L)，25 °C 光照(12h/d)培养 2-3 周。选择培养2-3周后，转化叶盘将分化出抗性不定芽，当芽长到Icm左右时，切下，接种到 MSIII (Kanl00mg/L+Cef500mg/L)，25°C光照(12h/d)培养 3 周，长成烟草再生植株。3. 4转基因再生植株的鉴定3. 4. 1转基因植株基因组PCR鉴定用CTAB法分离转基因再生植株的总基因组DNA (Clark MS)。用CbGRP表达引物，以转基因植株基因组DNA为模板，PCR扩增CbGRP基因。用未转基因烟草植株DNA为阴性 对照。3. 4. 2转基因植株表达CbGRP蛋白的Western-blot鉴定从转基因烟草植株叶片、根、茎中提取可溶性蛋白。3. 4. 3转基因烟草植株报告基因的表达分析-GUS活性组织化学定位转基因烟草植株浸泡于底物缓冲液中(lmmol/L X-gluc于lOOmmol/L磷酸缓冲液 (ρΗ7· 0)，IOmmol/L EDTA, 3mmol/L铁氰化钾，3mmol/L亚铁氰化钾)，真空抽气5min,置于 37°C过夜，将组织转入95%乙醇浸泡除去叶绿素。4. CbGRP转基因植株的冷冻耐受性实验借助农杆菌介导的转化，分析了 CbGRP基因在组成型过表达时对烟草植株抗冻性 的影响。CbGRP转基因阳性烟草植株，在MSIII (Kanl00mg/L+Cef500mg/L)中继代培养，每 罐放4个植株。同时在另一培养罐中接种4个非转基因烟草继代培养植株。同时置25°C 光照培养。至长出2片叶片。两罐同时进行冷处理。冷处理程序…！^处，^！？处，恢复 25°C光照培养，培养15天后，发现转基因烟草植株叶片长大，面积从0. 41 士0. 03cm2生长 至1.03士0.04cm2，ρ < 0. 05，二者有显著性差异。而非转基因植株叶片面积基本不变，由 0. 39士0. 06cm2，生长至0. 42士0. 07cm2,ρ > 0. 05，二者无显著性差异。说明，与非转基因植 株相比，转基因植株有较高的冷冻耐受性(见图2)。以上的实验结果说明CbGRP基因可以 提高转基因过表达烟草植株的冷冻耐受性。
权利要求
一种编码冰缘植物高山离子芥冷诱导蛋白基因，其核苷酸序列如下ATGGCGTCCGCAGATGTTGAGTTCAGGTGCTTCGTTGGCGGTCTAGCCTGGGCCACTGATGACAGAGCTCTCGAGACTGCATTCTCCCAGTACGGCGACGTTGTTGATTCCAAGATCATTAACGACCGTGAGACCGGAAGATCAAGGGGATTTGGATTCGTCACATTCAAGGACGAGAAATCCATGAAAGACGCCATTGAGGGAATGAACGGACAAGATCTCGATGGTCGCAGCATCACTGTGAACGAGGCTCAGTCCCGTGGAAGCGGTGGCGGAGGTGGTGGCCGTGGAGGCGGCGGTGGTGGATACCGCAGCGGTGGAGGCGGTGGCTATGGAGGTGGTGGTGGAAGTTACGGAGGCGGTGGAGGTAGACGCGAGGGTGGATACAGCGGCGGTGGTGGAGGCTACCCCTCAAGAGGAGGTGGCGGAGGAGGTTACGGTGGTGGTGGTGGCCGACGTGAGGGTGGATACGGAGGTGGTGAAAGTGGTGGATACGGAGGAAGCGGTGGAGGTGGAGGCGGATGGTAA；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；3)该基因的读码框为自5’端第1到第526位碱基。
2.根据权利要求1所述一种编码冰缘植物高山离子芥冷诱导蛋白基因，其特征在于 所述具有序列表中序列1的DNA序列离子芥冷诱导蛋白基因表达载体为pBI121-GbGRP。
3.一种由序列表中序列1的DNA序列所述的核苷酸序列所编码的蛋白质，且具有氨基 酸残基序列如下MASADVEFRCFVGGLAWATDDRALETAFSQYGDVVDSKIINDRETGRSRGFGFVTFKDEKSMKDAIEGMNGQ DLDGRSITVNEAQSRGSGGGGGGRGGGGGGYRSGGGGGYGGGGGSYGGGGGRREGGYSGGGGGYPSRGGGGGGYGGG GGRREGGYGGGESGGYGGSGGGGGGff。
4.将含有权利要求1所述基因的表达载体pBI121-GbGRP转化农杆菌LBA4404，利用叶盘法转化烟草获得转基因烟草在抗寒育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个编码冰缘植物高山离子芥冷诱导蛋白基因及其在烟草抗冻转基因中的应用。CbGRP基因为下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。由上述基因CbGRP编码的蛋白质，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。该基因可被冷胁迫诱导表达，并能提高转基因过表达烟草植株的抗冻能力，对于培育抗冻的作物品种具有重要的理论及实际意义。
文档编号C12N15/63GK101979577SQ20101023498
公开日2011年2月23日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者向云, 孙正龙, 安黎哲, 张华 , 白慕群, 盛红梅, 陈书燕 申请人:兰州大学