用于检测nqo1基因多态性的引物、试剂盒及其在病理检测上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了检测NQO1基因多态性的引物、试剂盒及其在病理检测上的应用，所述引物包括从样本核酸中扩增醌氧化还原酶1基因第四外显子C465T位点片段和第六外显子C609T位点片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物。通过本发明的引物、方法和试剂盒，采用焦磷酸测序技术，可检测出与肿瘤易感性相关的醌氧化还原酶1基因第四外显子C465T位点和第六外显子C609T位点多态性，特异性好，准确度高。
【专利说明】用于检测NQ01基因多态性的引物、试剂盒及其在病理检测上的应用
【技术领域】
[0001]本发明属生命科学和生物【技术领域】，特别涉及用于醌氧化还原酶I基因NQ01*2(C609T)、NQ01*3(C465T)位点多态性检测的引物、试剂盒和在病理检测上的应用，采用焦磷酸测序技术，能对醌氧化还原酶I基因多态性进行检测，特异性好，准确度高。
【背景技术】
[0002]醌氧化还原酶I 基因(NADPH:quinone oxidore_ductasel,NQ01)是由 Ernster 和Navazio于1958年首先报道的，最初被称为DT-硫辛酰胺脱氢酶(DT-diaphorase)。它是绝大多数真核生物细胞中普遍存在的一种黄素蛋白酶，能够解除许多天然和合成化合物的毒性，同时又能活化一些醌类抗肿瘤药物，因而引起了广泛关注。NQOl是一种可诱导的还原酶，酚类抗氧化剂、多环芳烃、偶氮染料、缺氧等外界环境因素均可以强烈地诱导NQOl表达。这种可诱导性表达使得NQOl可能在肿瘤预防和肿瘤治疗上起重要作用。
[0003]20世纪90年代初，有研究发现NQ01cDNA609位点上存在C/T单核苷酸多态性(SNP)，可能改变酶的二级结构，使酶的活性降低，增加了氧自由基的生成。目前发现人的NQOl基因序列中，引起蛋白质编码氨基酸序列改变的非同义编码单核苷酸多态性有三个，其中包括位于第四外显子的C465T和第六外显子的C609T，分别引起所编码的139位氨基酸由色氨酸(Trp)变为精氨酸(Arg)，187位氨基酸由脯氨酸(Pro)变为丝氨酸(Ser)。这些氨基酸序列改变，可能导致了个体中酶NQOl活性的降低或缺失，减弱了 NQOl对醌类化合物的解毒作用及改变肿瘤对特定原癌基因及抑癌基因功能的影响，从而使机体患肿瘤的可能性增加。
[0004]研究发现，酶NQOl具有2个野生型等位基因即野生纯合子(C/C)的个体，NQOl酶的活力正常；而具有杂合子(C/T)的个体酶的活力降低，具有突变纯合子(T/T)的个体NQOl酶的活力则完全消失。
[0005]目前对于NQ01C465T研究尚不很多。NQ01cDNA465位点上存在C/T单核苷酸多态性。不同人群NQ01465T等位基因频率较低(0~0.05)。许多研究还发现，NQ01C609T基因多态性频率在种族分布上有很大差异，基因型为(T/T)的纯合子个体在中国和其他亚洲人种为18%~20%，大约为高加索人和美籍非洲人的4倍。
[0006]鉴于NQOl与肿瘤的发生、发展密切相关，其第六位外显子(C609T)和第四位外显子(C465T)具有非同义编码单核苷酸多态性，可引起蛋白质编码的碱基序列改变从而导致蛋白质功能的改变，进而影响肿瘤的发生发展。对其进行检测将有助于进一步明确其遗传背景在肿瘤发生中的作用，并为肿瘤个体化治疗提供有益的指导。
[0007]在临床实验室中，目前检醌氧化还原酶I基因NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)多态性的常用方法为限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism, RELP)法。该技术为第一代DNA分子标记技术,利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生特征性的限制性片段，该方法的缺陷在于检测灵敏度低且只能检测大概型别，不能具体到突变比例。
[0008]本发明在原有的基础上进行焦磷酸测序检测，不仅能检测到多态性位点的具体突变情况，也能根据图谱辨别出突变比例，使检测结果更加具体化。
【发明内容】
[0009]针对现有技术的缺陷，本发明除了利用两对特异性的引物分别对醌氧化还原酶I基因NQOl的第四外显子C465T位点片段和第六外显子C609T位点片段进行常规PCR扩增外，还利用一对焦磷酸测序引物对PCR扩增片段进行正向测序和反向测序，不仅能够检测到多态性位点的具体突变情况，也能根据测序图谱辨别出突变比例，使检测结果更加具体化，从而能够更好地为肿瘤个体化治疗提供有益的指导。 [0010]在进行焦磷酸测序过程中，四种dNTP (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)依序被加入测序反应体系中。在每一轮测序反应中，只加入其中一种。如被加入的dNTP与DNA模板配对，DNA聚合酶可以催化该dNTP与焦磷酸测序引物C465T-S或C609T-S的3’端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团(PPi)就被释放出来。加入的dNTP和释放出来的PPi的摩尔数是相等的。接着,ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase)催化过硫酸铵(ammonium persulfate, APS)和 PPi 形成ATP，此ATP和PPi的摩尔数也是一致的。利用ATP作为能源，荧光素酶(Iuciferase)可将荧光素氧化为氧化荧光素(oxyluciferin)，进而发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测，并由程序pyrogramTM转为波形讯号。每个波峰的高度(光信号)与反应中加入的核苷酸数目成正比。
[0011]基于这种焦磷酸测序技术，本发明提供用于检测NQOl基因的C609T和C465T位点多态性的引物，其特征在于，所述引物包括从样本核酸中扩增NQOl基因第四外显子C465T位点片段和第六外显子C609T位点片段的特异性引物，其碱基序列为:
[0012]C465T-F:5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0013]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0014]C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0015]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0016]以及对所获得的核酸扩增产物进行焦磷酸测序的引物，其碱基序列为:
[0017]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0018]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3’(SEQ ID N0.6)。
[0019]进一步地，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素标记。
[0020]进一步地，所述扩增的反应条件为94°C 2分钟；98°C 10秒，60°C 20秒，68°C 20秒，35个循环；68°C 5分钟。
[0021]本发明还提供了检测NQOl基因的C609T和C465T位点多态性的方法在病理检测上的应用，包括:
[0022](I)提取样本中的DNA ；
[0023](2)以步骤(1)中的DNA作为模板，使用一对引物C465T-F和C465T-R扩增NQOl基因第四外显子C465T位点片段，获得PCR扩增产物I ;使用一对引物C609T-F和C609T-R扩增NQOl基因第六外显子C609T位点片段，获得PCR扩增产物2 ；
[0024](3)取步骤⑵中的PCR扩增产物I和2进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功；[0025](4)若步骤(3)中扩增成功，则利用焦磷酸测序引物C465T-S对步骤⑵中的PCR扩增产物I进行测序，利用焦磷酸测序引物C609T-S对步骤(2)中的PCR扩增产物2进行测序；
[0026](5)根据步骤步骤⑷中的焦磷酸测序结果，确定NQOl基因的C465T和C609T位点的多态性，
[0027](6)根据步骤(5)中的多态性结果，确定样本的病理状态；
[0028]其特征在于，所述引物序列为:
[0029]C465T-F:5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’
[0030]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’
[0031 ] C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3'
[0032]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’
[0033]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3'
[0034]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3'。
[0035]进一步地，所述扩增的反应条件为94°C 2分钟；98°C 10秒，60°C 20秒，68°C 20秒，35个循环；68°C 5分钟。
[0036]本发明还提供用于检测NQOl基因的C609T和C465T位点多态性的试剂盒，包括核酸提取试剂、PCR扩增体系、焦磷酸测序试剂，其特征在于，所述PCR扩增体系包括用于扩增基因NQOl第四外显子C465T位点片段和第六外显子C609T位点片段的特异性引物，其碱基序列为:
[0037]C465T-F:5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0038]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0039]C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0040]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0041]所述焦磷酸测序试剂包括对所获得的核酸扩增片段进行焦磷酸测序的引物，其碱基序列为:
[0042]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0043]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3’(SEQ ID N0.6)。
[0044]进一步地，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素标记。
[0045]进一步地，所述PCR扩增体系还包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和纯水。
[0046]进一步地，所述焦磷酸测序试剂还包括75%乙醇和DMS0。
[0047]进一步地，所述核酸提取试剂包括红细胞裂解液。
[0048]本发明将测序技术应用于醌氧化还原酶I基因多态性位点的检测，设计出将NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)多态性位点包含在内的扩增引物和焦磷酸测序引物，进行PCR扩增，扩增片段长度分别为464bp和212bp，随后进行焦磷酸测序分析。
[0049]采用焦磷酸测 序技术，通过本发明的特异性的扩增引物和焦磷酸测序引物，可检测出与肿瘤预防和肿瘤治疗相关的醌氧化还原酶I基因NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)位点多态性，特异性好，准确度高。可以用于临床作为肿瘤发生的早期预防、早期诊断的辅助性指标及筛选。【专利附图】
【附图说明】
[0050]图1是C465T野生型焦磷酸测序图。
[0051]图2是C609T野生型焦磷酸测序图。
[0052]图3是C609T突变杂合型焦磷酸测序图。
[0053]图4是C609T突变纯合型焦磷酸测序图。
【具体实施方式】
[0054]下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:比如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0055]实施例1:检测基因NQOl位点多态性的引物和试剂盒
[0056]用于醌氧化还原酶I基因NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)位点多态性检测的引物，包括从样本核酸中扩增醌氧化还原酶I基因NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)位点片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物，其中，
[0057]从样本核酸中扩增醌氧化还原酶I基因NQ01*2 (C609T) >NQOI*3 (C465T)位点片段的特异性引物序列为:
[0058]C465T-F:5’-CTA GCTTTACTCGGACCCACTC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0059]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0060]C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0061]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0062]其中C465T-F和C609T-R为5’端生物素标记引物；
[0063]对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物序列为:
[0064]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0065]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3’(SEQ ID N0.6)。
[0066]采用焦磷酸测序技术，通过两对特异性的扩增引物C465T-F、C465T-R和C609T-F、C609T-R以及焦磷酸测序引物，可检测出与肿瘤疾病相关的醌氧化还原酶I基因NQOI*2 (C609T)、NQOI*3 (C465T)位点多态性。
[0067]一种用于检测醌氧化还原酶I基因NQ01*2的C609T、NQ01*3的C465T位点多态性的试剂盒，包括核酸提取试剂、PCR扩增体系、焦磷酸测序试剂，其中，所述PCR扩增体系包括用于扩增基因NQOl第四外显子C465T位点片段和第六外显子C609T位点片段的特异性引物，其碱基序列为:
[0068]C465T-F:5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0069]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0070]C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0071]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0072]所述焦磷酸测序试剂包括对所获得的核酸扩增片段进行焦磷酸测序的引物，其碱基序列为:
[0073]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0074]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3’(SEQ ID N0.6)。[0075]优选地，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素标记。
[0076]优选地，所述PCR扩增体系还包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和纯水。
[0077]优选地，所述焦磷酸测序试剂还包括75%乙醇和DMS0。
[0078]优选地，所述核酸提取试剂包括红细胞裂解液。
[0079]实施例2 =DNA提取
[0080]DNA提取试剂:红细胞裂解液，血液基因组DNA抽提试剂盒(TIANGEN公司)。
[0081]操作步骤:取500ul全血，放入到1.5ml的离心管中，加入Iml红细胞裂解液。上下翻转，使完全混匀，旋转摇动15秒后放入离心机中离心,离心速率为5000rpm, IOmin.。倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。加入500ul红细胞裂解液，重复此裂解步骤一次。离心5000rpm, 5min,吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA,振荡至彻底混匀。加A 20 u I蛋白酶K溶液，混匀。加入200 ill缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加人200iU无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm(~13，400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500 U I缓冲液GD (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，OOOrpm(~13，400 Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入700 U I漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，OOOrpm(~13，400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500 u I漂洗液PW，12，OOOrpm(~13，400 Xg)离心30秒，倒掉废液。将吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm(~13，400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加IOOiU洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，OOOrpm(~13，400 Xg)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。最终，获得所提取的DNA。
[0082]实施例3:PCR扩增
[0083]对实施例2中所提取的DNA利用PCR扩增体系进行常规PCR扩增，获得扩增DNA片段扩增产物。[0084]对醌氧化还原酶I基因NQ01*2 (C609T)位点片段进行扩增所用的PCR扩增体系为2*Bufferl0u 1，dNTP4 U 1，腳酶0.411 1，上游引物 C609T-F1 y 1，下游引物 C609T-R1 y 1，纯水2.6 ii I,加I ii I模板DNA到19 ii I扩增体系中，总体积为20 u 10
[0085]对醌氧化还原酶I基因NQ01*3 (C465T)位点片段进行扩增所用的PCR扩增体系为2*Bufferl0u 1，dNTP4 U 1，腳酶0.411 1，上游引物 C465T-F1 y 1，下游引物 C465T-R1 y 1，纯水2.6 ii I,加I ii I模板DNA到19 ii I扩增体系中，总体积为20 u 10
[0086]常规PCR扩增反应条件为94°C 2分钟；98°C 10秒，60°C 20秒，68°C 20秒，35个循环；68°C 5分钟。
[0087]实施例4:琼脂糖凝胶电泳
[0088]取实施例3中的DNA片段扩增产物3 iU进行琼脂糖凝胶电泳，检测是否扩增成功，对清晰较亮的目的条带进行后续焦磷酸测序反应。
[0089]实施例5:焦磷酸测序[0090]焦憐酸测序试剂:75%乙醇，DenaturationSolution,Annealing Buffer,BindingBuffer,I Xffash Buffer, Streptavidin Sepharase High Performance (bead), PyroMarkGold Q96Reagents(E\S\dNTP)，DMS0(二甲基亚砜)，焦磷酸测序引物 C465T-S 和 C609T-S，其中除焦磷酸测序引物之外，均采购自美国QIAGEN公司。
[0091]焦磷酸测序步骤:利用焦磷酸测序试剂，对经过实施例4中的电泳方法确认扩增成功的PCR扩增产物进行焦磷酸测序，具体测序步骤按照PyroMark Gold Q96(美国QIAGEN公司)操作说明书进行。其中利用焦磷酸测序引物C465T-S对醌氧化还原酶I基因NQOl的第四外显子C465T位点片段进行反向测序，利用焦磷酸测序引物C609T-S对第六外显子C609T位点片段进行正向测序。
[0092]针对醌氧化还原酶1基因NQOl的第四外显子C465T位点片段和第六外显子C609T位点片段的扩增产物，分别利用焦磷酸测序引物C465T-S和C609T-S进行测序，根据测序图谱分析和确定这两个位点的多态性。
[0093]实施例6:临床样本病理状态分析
[0094]取临床送检的4份样本,依次编号为I号样本、2号样本、3号样本和4号样本。按照实施例2至实施例5的方法，利用引物C465T-S和C609T-S分别对I号样本、2号样本、3号样本和4号样本中的NQOl基因第四外显子C465T位点片段的扩增产物和第六外显子C609T位点片段的扩增产物进行测序。
[0095]NQOl基因第四外显子C465T位点野生型的基因序列为TTC￡GG。经测定I号样本中的NQOl基因第四外显子C465T位点片段扩增产物的焦磷酸测序结果如图1所示，所得序列为:CC￡GAA,即图1中的方框作标记。多态性位点为G,由于为反向测序,可知I号样本为C465T野生型。针对NQOl基因第四外显子C465T的突变杂合型和突变纯合型的检测结果与实际相同。
[0096]NQOl基因第六外显子C609T位点野生型的基因序列为AA￡CTC。经测定2号样本中的NQOl基因第六外显子C609T位点片段扩增产物的焦磷酸测序结果如图2所示，所得序列为:AA￡CTC，即图2中的方框作标记。多态性位点为C，该位点为正向测序，可知2号赝本为C609T野生型。
[0097]NQOl基因第六外显子C609T位点突变杂合型的基因序列为AAI/￡CTC。经测定，3号样本中的NQOl基因第六外显子C609T位点片段扩增产物的焦磷酸测序结果如图3所示，所得序列为:AAI/￡CTC，即图3中的方框作标记。多态性位点为T/C，该位点为正向测序，可知3好样本为C609T突变杂合型。
[0098]NQOl基因第六外显子C609T位点突变纯合型的基因序列为AAJCTC。经测定4号样本中的片段扩增产物的焦磷酸测序结果如图4所示，所得序列为:AAICTC，即图4中的方框作标记。多态性位点为T，该位点为正向测序，可知4号样本为C609T突变纯合型。
【权利要求】
1.用于检测NQOl基因的C609T和C465T位点多态性的引物，其特征在于，所述引物包括从样本核酸中扩增NQOl基因第四外显子C465T位点片段和第六外显子C609T位点片段的特异性引物，其碱基序列为:
C465T-F: 5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’
C465T-R: 5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’
C609T-F: 5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’
C609T-R: 5’- CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ 以及对所获得的核酸扩增产物进行焦磷酸测序的引物，其碱基序列为:
C465T-S: 5’- GCATTCAGAACCATCCACCTAC -3’
C609T-S: 5’- TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG -3，。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素标记。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述扩增的反应条件为94°C2分钟；98°C10 秒，60°C 20 秒，68°C 20 秒，35 个循环；68°C 5 分钟。
4.一种检测NQOl基因的C609T和C465T位点多态性的方法在病理检测上的应用，包 括: (1)提取样本中的DNA; (2)以步骤(1)中的DNA作为模板，使用一对引物C465T-F和C465T-R扩增NQOl基因第四外显子C465T位点片段，获得PCR扩增产物I ;使用一对引物C609T-F和C609T-R扩增NQOl基因第六外显子C609T位点片段，获得PCR扩增产物2 ； (3)取步骤⑵中的PCR扩增产物I和2进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功； (4)若步骤(3)中扩增成功，则利用焦磷酸测序引物C465T-S对步骤(2)中的PCR扩增产物I进行测序，利用焦磷酸测序引物C609T-S对步骤(2)中的PCR扩增产物2进行测序; (5)根据步骤步骤⑷中的焦磷酸测序结果，确定NQOl基因的C465T和C609T位点的多态性； (6)根据步骤(5)中的多态性结果，确定样本的病理状态； 其特征在于，所述引物序列为:
C465T-F: 5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’
C465T-R: 5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’
C609T-F: 5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’
C609T-R: 5’- CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’
C465T-S: 5’- GCATTCAGAACCATCCACCTAC -3’
C609T-S: 5’- TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG -3，。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应条件为94°C2分钟；98°C10秒，60°C 20 秒，68°C 20 秒，35 个循环；68°C 5 分钟。
6.用于检测NQOl基因的C609T和C465T位点多态性的试剂盒，包括核酸提取试剂、PCR扩增体系、焦磷酸测序试剂，其特征在于，所述PCR扩增体系包括用于扩增基因NQOl第四外显子C465T位点片段和第六外显子C609T位点片段的特异性引物，其碱基序列为:C465T-F: 5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’
C465T-R: 5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’
C609T-F: 5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’
C609T-R: 5’- CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ 所述焦磷酸测序试剂包括对所获得的核酸扩增片段进行焦磷酸测序的引物，其碱基序列为:
C465T-S: 5’- GCATTCAGAACCATCCACCTAC -3’
C609T-S: 5’- TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG -3，。
7.如权利要求6所述的试剂盒，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素标记。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增体系还包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和纯水。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述焦磷酸测序试剂还包括75%乙醇和DMSO。
10.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂包括红细胞裂解液。
【文档编号】C12Q1/68GK103667447SQ201310539817
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】钟丹, 薛群, 陈奕磊 申请人:武汉艾迪康医学检验所有限公司