一种脂肪酶及其编码基因和其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型脂肪酶ThiLip及其编码基因与应用。该蛋白ThiLip，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1）序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有酯类水解活性的蛋白。本发明的蛋白和其编码基因可用在食品加工，医药化妆品制备以及洗涤行业。
【专利说明】一种脂肪酶及其编码基因和其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种脂肪酶蛋白及其编码基因和其应用。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(Lipase)是自然界中常见的一类脂肪水解酶，普遍存在于动植物和微生物中。虽然不同来源的脂肪酶的核苷酸序列差别比较大，但是在三维结构上具有极高相似性的α/β折叠酶结构，催化遵循丝氨酸水解酶的反应机制，即催化结构域包含丝氨酸-组氨酸-谷氨酸(或天冬氨酸)三联体活性中心结构并在丝氨酸活性位点附近的保守序列为G-X-S-X-G。脂肪酶蛋白分子稳定、催化反应简单、不依赖辅助因子、底物范围广等特点。
[0003]在酿酒工业中，脂肪酶可提高白酒中酯类香味物质的含量，加快白酒中各种酸醇酯的反应平衡，缩短贮存老熟时间，调节白酒中各种酸醇酯的含量和比例，使酒质窖香浓郁、绵甜爽例，香味协调饱满，余味悠长；优质酒品率明显提闻。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种脂肪酶ThiLip蛋白及其编码基因和其应用，所述脂肪酶ThiLip 蛋白来源于中间型高温放线菌(Thermoactinomyces intermedius, CICC 23799)。
[0005]本发明的一个目的是提供一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白:
1)序列表中的SEQID Ns.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中的SEQID N0.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯类水解活性的蛋白质。
[0006]序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列由275个氨基酸残基组成。
[0007]上述1)和2)中的脂肪酶ThiLip蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述1)和2)中的脂肪酶ThiLip蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQID N0.1所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变后得到。
[0008]编码所述脂肪酶ThiLip蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0009]所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0010]当所述核酸分子是DNA时，其序列是下述核苷酸序列之一:
1)序列表中SEQID Ns:1第1-828位的核苷酸序列；
2)编码序列表中SEQID No:2蛋白质序列的多核苷酸序列；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQID No:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
[0011]上述高严谨条件可为用6XSSC，0.5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC，0.1% SDS 和 1XSSC，0.1% SDS 各洗膜一次。
[0012]其中，序列表中的SEQ ID No:1由828个核苷酸组成，其开放阅读框架(0RF)为自5/末端第1-828位核苷酸，编码序列表中SEQ ID N2:2所示的蛋白质，即本发明所述的脂肪酶ThiLip蛋白。
[0013]含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0014]所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0015]所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0016]所述重组表达载体具体为将具有序列表中SEQ ID N2:1所示核酸序列的核酸片段插入pET28a载体的Bern HI和Hind III酶切位点之间得到的。
[0017]扩增本发明所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明保护的范围。
[0018]本发明的另一个目的是提供本发明所述蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的应用。
[0019]本发明的还一个目的是提供本发明所述蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在水解酯类中的应用。
[0020]本发明的再一个目的是提供本发明所述蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在水解橄榄油中的应用。
[0021]本发明提供的新型脂肪酶蛋白具有酯类水解活性，最适的作用温度为50°C，最适作用pH值为8。本发明提供的新型脂肪酶蛋白及其编码基因在食品加工，医药化妆品制备以及洗涤行业具有重要的应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为新型脂肪酶蛋白ThiLip表达和纯化的SDS-PAGE电泳图；lanel:纯化前的重组菌粗酶液；lane2:镍柱纯化后的重组蛋白溶液。
[0023]图2为新型脂肪酶ThiLip在不同温度条件下的比活性。
[0024]图3为新型脂肪酶ThiLip在不同pH条件下的比活性。
【具体实施方式】
[0025]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0028]中间型高温放线菌(intermedius,CICC 23799)分离于板倒井高温大曲，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0029]实施例1、脂肪酶基因的获得
提取中间型高温放线菌(intermedius, CICC 23799)的总 DNA 并纯化，以该纯化的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增引物如下:
h游引物:5’_ GCGGGATCCCAAACGGATGAAGACATC-3’ (含有汉■ HI 酶切位点)
下游引物:5’ -GCGAAGCTTTGCTCCAAGGGCATCATAAAC-3’ (含有 Hind 111 酶切位点)得到的PCR产物送去测序。测序结果表明，上述PCR扩增得到的核酸片段包含酶切位点和具有序列表中SEQ ID N2:l所示核苷酸序列的核酸片段；SEQ ID N2:1所示核苷酸序列共828bp，其中编码区长828bp，该编码区序列如序列表中SEQ ID Ns:1中第1-828位核苷酸所示，编码序列表中SEQ ID N2:2所示的氨基酸序列，共257个氨基酸残基。将该具有序列表中SEQ ID No:1所示核苷酸序列的核酸片段命名为Thilip。
[0030]也可通过人工合成来制备具有序列表中SEQ ID N2:1所示核苷酸序列的核酸片段。
[0031]实施例2、脂肪酶基因的功能验证 (一)重组质粒pET- ThiLip的构建
1、用限制性内切酶及? HI和Hind III双酶切实施例1得到的PCR扩增产物，得到酶切产物。
[0032]2、用限制性内切酶汉.HI和Hind III双酶切质粒pET28a (购自北京全式金生物技术有限公司)，回收约5300bp的载体骨架。
[0033]3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒；测序验证序列的正确性；测序结果表明所得质粒为在质粒pET28a的Bam HI和Hind III酶切位点之间插入具有序列表中SEQ ID N2:1所示核苷酸序列的核酸片段，将该质粒命名为pET-ThiLip。
[0034](二)重组蛋白的表达与纯化
将步骤(一)得到的质粒pET-ThiLip通过化学转化法转化大肠杆菌BL21 (DE3)(购自北京全式金生物技术有限公司)，在含有50mg/mL卡那霉素的LB琼脂平板对转化子进行筛选，得到重组菌pET-ThiLip/万.coli BL21 (DE3)。质粒pET28a转化大肠杆菌BL21 (DE3)得到的重组菌作为对照菌株。
[0035]将重组菌pET-ThiLip/厶coli BL21 (DE3)接种到 lOOmL LB 液体培养基(含 50mg/mL卡那霉素)中，37°C振荡培养至0D6(i(i达到0.6左右，加入终浓度为0.5 mM IPTG，25°C诱导过夜。6000rpm离心10分钟收集菌体，按照1:5加入100 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，超声波破碎细胞10分钟(200w，超声2s，停止3s)。12000 rpm离心10分钟去除细胞碎片，得到粗酶液。
[0036]将粗酶液通过ProteinlsoTM N1-NTA Resin (购自北京全式金生物技术有限公司)进行纯化。待粗酶液完全流经层析柱后，使用5mL洗涤液冲洗镍柱中未结合的杂蛋白，再用10mL漂洗液漂洗镍柱中结合较弱的蛋白。最后使用5ml洗脱液将目的蛋白洗脱下来，收集洗脱液，加入25mL 100 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，使用10000Da的蛋白浓缩管，3000 rpm离心30分钟，去除多余的咪唑，得到浓缩的洗脱液，SDS-PAGE电泳检测得到的脂肪酶Thilip，检测结果见图1。
[0037](三)新型脂肪酶ThiLip的性质测定脂肪酶的活力定义为lg固体酶粉(或1 mL液体酶)，在最适的温度和pH值条件下，1分钟水解底物产生1 μ mol的可滴定的脂肪酸即为1个酶活力单位，以u/g (或u/mL)表示。
[0038]以橄榄油为底物，按照GB/T 23535-2009的方法，测定新型脂肪酶在不同温度(10°C-80°c)以及不同pH值(pH 3-10)条件下的酶活力。图2为新型脂肪酶ThiLip在不同温度条件下的比活性。图3为新型脂肪酶ThiLip在不同pH条件下的比活性。结果表明:重组蛋白的最适温度为50°C,最适pH值为8。
[0039]综上所述，本发明提供的新型脂肪酶蛋白具有酯类水解活性，最适的作用温度为50°C，最适作用pH值为8。在食品加工，医药化妆品制备以及洗涤行业具有重要的应用潜力。
【权利要求】
1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白: 1)序列表中的SEQID Ns.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)将序列表中的SEQID N0.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯类水解活性的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因具有下述核苷酸序列之一: 1)序列表中SEQID Ns:1第1-828位的核苷酸序列； 2)编码序列表中SEQID No:2蛋白质序列的多核苷酸序列； 3)在高严谨条件下可与序列表中SEQID No:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列； 4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。
5.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任意片段的引物对。
6.权利要求1所述的蛋白和权利要求2-3任一所述的编码基因和权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的应用。
7.权利要求1所述的蛋白和权利要求2-3任一所述的编码基因和权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在水解酯类中的应用。
8.权利要求1所述的蛋白和权利要求2-3任一所述的编码基因和权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在水解橄榄油中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104450645SQ201410695438
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】程池, 翟磊, 姚粟, 张锋国, 信春晖, 李辉 申请人:中国食品发酵工业研究院, 山东扳倒井股份有限公司