胰淀素样融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种可用于糖尿病治疗的重组胰淀素样融合蛋白及其编码基因与应用，目的是提供胰淀素样融合蛋白及其编码基因与高效表达该蛋白的方法。本发明提供的胰淀素样融合蛋白是胰淀素样肽的N末端氨基酸残基与一种所述人工短肽的羧基端（C末端）氨基酸残基序列部分或全部相融合的蛋白质。本发明可作为药物在临床上用于糖尿病治疗,具有高效、作用时间长等特点，可望成为一全新的糖尿病治疗药物。
【专利说明】胰淀素样融合蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域中的胰淀素样融合蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病已成为影响人群健康的主要疾病之一，其患病率正随着生活条件的改善、 人口老化、生活方式的改变而迅速增加。流行病学调查显示.我国目前有4000万糖尿病患 者，其中I型糖尿病患者占5. 6%，II型糖尿病患者占93. 7%.其他类型糖尿病患者约占 0.7%。控制患者的血糖水平，减少并发症仍然是主要治疗方法。目前临床使用的降糖药 物较多，但患者随着用药时间的延长，会产生不同程度的药物抵抗。20Q5年美国FDA批准 Amylin公司的普兰林肽（Pramlintide,以下称作"胰淀素样肽"）注射剂用于成人I型和 II型糖尿病，也是继胰岛素后第二个获准用于治疗1型糖尿病的药物。但其血液药物半衰 期较短，约为50分钟，影响治疗效果。因此，延长其血液药物半衰期具有重要的临床治疗价 值。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种可用于糖尿病治疗的胰淀素样融合蛋白及其编码基因。
[0004] 本发明提供的融合蛋白为胰淀素样肽的氨基端（N末端）氨基酸残基与人工短肽 Arg-GLY-ASP-SER的羧基端（C末端）氨基酸残基序列部分或全部相融合的蛋白质。
[0005] 所述胰淀素样肽为序列表中SEQ ID Ns :1的氨基酸残基序列或将SEQ ID Ns :1的 氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID Ns:l相 同活性的由SEQ ID Ns :1衍生的蛋白质。
[0006] 所述人工短肽为Arg-GLY-ASP-SER的氨基酸残基序列或将Arg-GLY-ASP-SER 的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同活性的由 Arg-GLY-ASP-SER 衍生的短肽。
[0007] 所述的与所述人工短肽相融合的胰淀素样肽为氨基端（N末端)氨基酸残基的起始 位点在SEQ ID Ns :1序列1 一 37中的任意部位的氨基酸残基，例如，所述人工短肽的羧基 端（C末端)氨基酸残基可与SEQ ID N2 :1序列1的氨基端（N末端)氨基酸残基相融合形成 所述人工短肽与SEQ ID Ns :1序列1 一 37氨基酸残基的融合蛋白或SEQ ID Ns :2短肽的 羧基端（C末端)氨基酸残基与SEQ ID N2 :1序列5的氨基端（N末端)氨基酸残基相融合形 成所述人工短肽与SEQ ID Ns :1序列5 - 37氨基酸残基的融合蛋白或所述人工短肽的羧 基端（C末端）氨基酸残基与SEQ ID N2:l序列10的氨基端（N末端）氨基酸残基相融合形 成所述人工短肽与SEQ ID N2 :1序列10-37氨基酸残基的融合蛋白等不同的组合。
[0008] 所述的与序列表中SEQ ID N2:l胰淀素样肽相融合的所述人工短肽为羧基端（C 末端）氨基酸残基的融合位点在所述人工短肽序列3-4中的任意部位的氨基酸残基，例如， SEQ ID N2:l胰淀素样肽的氨基端（N末端)氨基酸残基可与所述人工短肽序列3的羧基端 (C末端)氨基酸残基相融合形成SEQ ID N2 :1胰淀素样肽与所述人工短肽序列1 一 3氨基 酸残基的融合蛋白或SEQ ID N2 :1胰淀素样肽的氨基端（N末端)氨基酸残基可与所述人工 短肽序列4的羧基端（C末端)氨基酸残基相融合形成SEQ ID N2:l胰淀素样肽与所述人工 短肽序列1 一 4氨基酸残基的融合蛋白等不同的组合。
[0009] 所述的与序列表中SEQ ID N2 :1胰淀素样肽通过短肽桥与所述人工短肽相融合， 所述的短肽桥为1-10个任意氨基酸残基短肽，例如，SEQ ID N2 :1胰淀素样肽的氨基端（N 末端）氨基酸残基可与短肽桥的羧基端（C末端）氨基酸残基相融合，短肽桥的氨基端（N末 端）氨基酸残基与所述人工短肽序列4氨基酸残基的融合蛋白。
[0010] 本发明的第二个目的是提供胰淀素样融合蛋白的编码基因。
[0011] 本发明提供的胰淀素样融合蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一： (1) 编码序列表中SEQ ID N2 :3蛋白质序列的多核苷酸； (2) 所述人工短肽序列的多核苷酸； 含有上述基因的表达载体及细胞系均属本发明所要求保护的范围。
[0012] 本发明的第三个目的是提供一种上述胰淀素样融合蛋白在大肠杆菌中的高效表 达方法。
[0013] 胰淀素样融合蛋白的高效表达方法是将编码胰淀素样融合蛋白的基因导入到大 肠杆菌中，表达获得胰淀素样融合蛋白。
[0014] 具体地说，该方法包括以下步骤： 1、 选用大肠杆菌优选密码子，设计并合成序列1和所述人工短肽的部分或全部序列 的融合蛋白基因序列； 2、 将合成的基因片段分别与载体pET21b连接，得到表达质粒，转化大肠杆菌后获得 表达工程菌； 3、 培养工程菌，表达产物，获得目标蛋白。
[0015] 本发明将胰淀素样肽的部分或全部分子结构和所述人工短肽进行融合，合成新 的具有胰淀素样肽活性的蛋白质融合体。该融合体具有明显的辅助降血糖作用，在糖尿病 的治疗方面，具有重要意义。
[0016] 本发明的第四个目的是提供上述胰淀素样融合蛋白在制备治疗糖尿病的药物中 的应用。临床上本发明可与胰岛素或其它降糖药物合用用于I型和II型糖尿病的治疗。
[0017] 需要的时候，在以上述胰淀素样融合蛋白为活性成分的药物中，还可以加入一种 或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合 剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
[0018] 本发明的药物可以制成注射液、冻干粉针剂等多种形式。上述各种剂型的药物均 可以按照药学领域的常规方法制备。
[0019] 有益效果 本发明提供了一种新的可望成为优于普兰林肽的用于糖尿病治疗的药物，具有如下特 点：1、本发明引入所述人工短肽，与胰淀素样肽形成融合蛋白，增加了药物的稳定性，延长 了血液药物半衰期。2、本发明引入的所述人工短肽具有与整合素结合的细胞粘附作用，提 高细胞药物浓度，增强疗效。3、工业化程度高：用本发明的方法得到的胰淀素样融合蛋白占 培养液总蛋白的30%以上，表达过程操作简单，产品成本较低，可用于规模化生产，对于开 发新的糖尿病治疗药物具有重要意义。
[0020]
【具体实施方式】
[0021] 实施例1、胰淀素样融合蛋白的大肠杆菌体外表达 1、人工基因的合成：人工合成序列表中序列3的所述人工短肽和胰淀素样肽氨基酸 残基编码基因的部分或全长序列，并在其5 '端加上BamH 1、3'端加上Notl酶切位点，得到 序列表中序列3的克隆序列。用BamH I和Notl分别酶切合成的核酸序列，纯化、连接，合 成融合蛋白的核酸序列。
[0022] 2、胰淀素样融合蛋白体外表达纯化 (1)将上述人工合成的全序列分别装入pGEM-T-EASY质粒内，构建pGEM-PRAM克隆载 体。
[0023] (2)表达质粒的构建 采用购自美国Novagen公司的高效表达质粒pET21b，用SnabI和Notl分别酶切 pGEM-PRAM质粒和pET21b质粒，凝胶电泳收集目标片段，用T 4连接酶16°C过夜连接。经 常规方法的转化，挑菌，扩增获得表达质粒pET-PRAM。
[0024] (3 )分别将质粒pET-PRAM经转化导入BL21-DE3大肠杆菌内，经培养，挑选，筛选等 过程，获得单克隆菌。
[0025] (4)挑选的单克隆菌，接种于5ml培养基中，37°C过夜，然后转入1000ml培养基中， 继续培养至〇D 6QQ = 0. 8,加入IPTG至终浓度为1% 37°C诱导表达4小时。
[0026] (5)将培养的菌液8000g离心20分钟，收集菌体，每升菌液收集的菌体加入50ml 裂解缓冲液（50mM Tris HC1，lm M EDTA，20m Μ 2-巯基乙醇，100m Μ氯化钠)，室温放置30 分钟，然后加入 10% Triton-X-100 2. 5ml，加入 0· 1Μ PMSFO. 25ml，37°C孵育 15 分钟，进行 超声破碎，之后20000g离心20分钟，弃上清，沉淀加入20ml 8M尿素裂解缓冲液，搅拌30 分钟，离心，收集上清。将含有cTnl的上清液在溶液A (含25m M TEA/HC1 Ph7. 5，8M的 尿素，2mM EDTA，lmM的DTT)中室温下透析2-3小时，12000g 4°C离心30分钟。用溶液A平 衡DEAE S印harose柱，然后将离心上清液上样，以吸附杂蛋白，收集流出液。再用溶液A平 衡CM S印harose柱，用所收集的流出液上样，此时目的蛋白将被吸附在填料上，然后用溶 液B(含有1M氯化钠的溶液A)将目的蛋白洗出。用分光光度法测定蛋白质含量。取纯化 后的蛋白质溶液5ug，用12% SDS-PAGE电泳，并经考马斯亮兰染色，所得的目的蛋白的纯度 为 93%。
[0027] 实施例2、本发明胰淀素样融合蛋白对大鼠血清葡萄糖和胰岛素浓度的影响： 取雄性SD大鼠12只体重235 -275 g，实验前动物均禁食16 h，随机分为2组，A组 为对照组6只，静脉注射生理盐水；B组为实验组6只，静脉注射5mg/kg胰淀素样融合蛋 白，于30分钟后取血，用常规实验室检测方法测定血清葡萄糖和胰岛素浓度。结果血糖浓 度为 3·9±0·9 mol/ L，7.3±L2 mol/ L (ρ〈0·01)，血胰岛素水平为 15.0±L8 mIU/L， 37.9±4.3mIU/L (p〈0.01)，说明胰淀素样融合蛋白可升高血清葡萄糖和胰岛素浓度。 〈11〇>北京康华源科技发展有限公司 〈120>胰淀素样融合蛋白及其编码基因与应用 <160>3 <210>1 <211>37 <212>PRT 〈213>人工序列 <220> <223> <400>1 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe 5 10 15 Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro lie Leu Pro Pro Thr 20 25 30 Asn Val Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210>2 〈211M1 <212>PRT 〈213〉人工序列 <220> 〈223〉 <400>2 Arg Gly Asp Ser Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg 5 10 15 Leu Ala Asn Phe Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro lie 20 25 30 Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr Tyr 35 40 <210>3 <211>123
【权利要求】
1. 一种具有胰淀素样作用的融合蛋白，为胰淀素样肽的氨基端（N末端）氨基酸残基序 列部分或全部与所述人工短肽的羧基端（C末端)氨基酸残基序列部分或全部相融合的蛋白 质。
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述胰淀素样肽为序列表中SEQ ID Ns :1的氨基酸残基序列或将SEQ ID N2:l的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基 的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID Ns :1相同活性的由SEQ ID Ns :1衍生的蛋白质。
3. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述人工短肽为Arg-GLY-ASP-SER 的氨基酸残基序列或将Arg-GLY-ASP-SER的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基 的取代、缺失或添加且具有与Arg-GLY-ASP-SER相同活性的由Arg-GLY-ASP-SER衍生的短 肽。
4. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：与所述的与Arg-GLY-ASP-SER短肽 相融合的胰淀素样肽为氨基端（N末端）氨基酸残基的起始位点在SEQ ID N2:l序列1 一 37中的任意部位的氨基酸残基。
5. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述的与序列表中SEQ ID N2:l 胰淀素样肽融合的Arg-GLY-ASP-SER短肽为羧基端（C末端）氨基酸残基的融合位点在 Arg-GLY-ASP-SER序列3 - 4中的任意部位的氨基酸残基。
6. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述的序列表中Arg-GLY-ASP-SER 短肽与序列表中SEQ ID N2:l胰淀素样肽通过短肽桥相融合，其中短肽桥为1-10个任意氨 基酸残基的短肤。
7. 权利要求1所述的胰淀素样融合蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用，临床上本 发明可与胰岛素或其它降糖药物合用用于I型和II型糖尿病的治疗。
【文档编号】A61P3/10GK104086655SQ201310110871
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年4月2日 优先权日:2013年4月2日
【发明者】刘凤鸣 申请人:北京康华源科技发展有限公司