一种抑制癌细胞生长的短肽及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制癌细胞生长的短肽及其编码基因。本发明提供的多肽是如下（a）或（b）的多肽：（a）由序列表中SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列组成的多肽；（b）将序列表中SEQ?ID?No：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的由（a）衍生的多肽。实验证明，本发明提供的多肽能够造成人类子宫颈癌细胞HeLa细胞的凋亡，因此该短肽可能成为良好的低副作用的抗癌药物。
【专利说明】—种抑制癌细胞生长的短肽及其编码基因
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种抑制癌细胞生长的短肽及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]癌症是一种由于细胞增殖与凋亡的调控机制失常所引起的疾病。癌细胞生长失控，消耗人体过多营养，挤压正常器官，妨碍正常器官作用，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统扩散或转移到身体其他器官，引起器官功能衰竭。癌症已经成为全球人类健康的首要杀手之一，近年来我国癌症发病更是逐渐趋于低龄化。发现并发展新的癌症治疗的药物，对于社会的稳定，人民健康生活质量的提高，社会经济发展都具有良好的推动作用。 [0003]目前对于癌症的治疗主要有以下几种:手术治疗，对于良性肿瘤疗效较好，但是对于没有包膜包裹的癌症组织和扩散性肿瘤难以完全根除；放射性治疗，是利用某些肿瘤对射线敏感的特点选择性地杀死癌细胞，但是对于不敏感型以及易扩散型癌细胞疗效较差，而且在治疗过程中也会造成正常细胞的死亡；化学治疗，是将对细胞有毒、有害的药物经由循环系统带到全身，虽然对于扩散型癌细胞也有一定疗效，但是这种治疗方法对于全身的正常细胞也会造成极大伤害，使癌症病人在治疗癌症过程中承受巨大的生理和心理的折磨。因此开发出一种疗效好、应用范围广、副作用小的抗癌药物是癌症患者和医学工作者的共同心愿。
[0004]癌症细胞的调控机制失常往往是由于一些重要调控基因的失活造成的。目前，已经发现的抑癌基因根据其在细胞中的失活机理可简单的分为两类。I型抑癌基因是指其在DNA层面上，基因发生突变而丧失抑制细胞生长作用的基因。II型抑癌基因是一种新颖的抑癌基因，它们在正常细胞中存在一定水平的表达，具有一定的功能，在肿瘤细胞中其基因的转录和翻译在不同程度上下调，从而丧失抑制细胞生长的作用，但其DNA并没有发生改变。正因如此，II型抑癌基因对于正常细胞没有生长抑制或诱导凋亡的作用，而对于大多数癌症细胞则具有很明显的抑制和诱导细胞凋亡的作用。因此，II型抑癌基因中具有抑癌作用的短肽将有望成为新型的抗癌新药。
[0005]由人类基因组片段翻译得到的短肽在细胞中能够被多种酶降解代谢为天然氨基酸，对人体没有毒性，也不会造成累计效应。由于II型抑癌基因的自身特点，对正常细胞不产生抑制作用，来自II型抑癌基因的短肽将不会对正常细胞或人体正常器官组织产生副作用，减少治疗过程对癌症病人造成的痛苦。因此，来自II型抑癌基因的抑癌短肽有望成为一种新型的绿色仿生药物。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是提供一种具有抑癌作用的多肽。
[0007]本发明提供的多肽，是如下(a)或(b)的多肽:[0008](a)由序列表中SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的多肽；
[0009](b)将序列表中SEQ ID No:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
[0010]所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0011]本发明还提供了上述多肽的编码基因。
[0012]所述多肽的编码基因为如下I)~3)中任一所述的DNA分子:
[0013]I)序列表中的SEQ ID No:1所示的DNA分子；
[0014]2)在严格条件下能与I)限定的DNA序列杂交且编码具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的多肽的DNA分子；
[0015]3)与I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的多肽的DNA分子。
[0016]含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也在本发明保护的范围内。
[0017]在本发明的一个具体实例中，所述重组载体为将所述多肽的编码基因插入BFP-1inker-pcDNA3.1中，得到表达所述多肽的重组载体。
[0018]所述BFP-1inker_pcDNA3.1按照如下方法制备:
[0019]I)在pcDNA3.1载体的NotI和ClaI酶切位点间插入Tag BFP编码基因(SEQ IDNo:3)，得到重组载体 BFP-pcDNA3.1 ；
[0020]2)在步骤I)得到的重组载体BFP-pcDNA3.1的ClaI和BspEI酶切位点间插入Linker 基因的 DNA 片段(SEQ ID No:6)，得到载体 BFP_linker-pcDNA3.1。
[0021]所述转基因细胞系是将所述的重组载体导入到宿主细胞中得到的转基因细胞系，所述宿主细胞具体可以为子宫颈癌细胞，所述子宫颈癌细胞尤其优选为HeLa细胞。
[0022]扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也在本发明保护的范围内。这样的引物对的核苷酸序列例如序列表中的SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示。
[0023]本发明的保护范围还包括:所述多肽、所述多肽的编码基因、所述重组载体或所述转基因细胞系在抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡中的应用；所述多肽、所述多肽的编码基因、所述重组载体或所述转基因细胞系在制备抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡的产品中的应用。
[0024]在本发明的实施例中，所述肿瘤细胞具体为子宫颈癌细胞，所述子宫颈癌细胞尤其优选为HeLa细胞；
[0025]所述抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡的产品为药物。
[0026]本发明的另一个目的是提供一种抑制肿瘤生长的产品。
[0027]本发明提供的产品，其活性成分为所述多肽、所述多肽的编码基因、所述重组载体或所述转基因细胞系。
[0028]本发明通过对II型抑癌基因功能区域的研究，发现一种可以抑制人类癌细胞的生长并诱导细胞凋亡的三十七肽，通过对HeLa细胞的施用实验，发现该短肽能够造成人类子宫颈癌细胞HeLa细胞的凋亡，因此该短肽可能成为良好的低副作用的抗癌药物。【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1显示了本发明短肽诱导细胞死亡的死亡率统计结果。
【具体实施方式】
[0030]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]实施例1、短肽的获得
[0033]本发明所用短肽序列来自一种人类第二类肿瘤抑制因子，其DNA片段可以通过以人类肝脏cDNA文库(购自武汉三鹰生物技术有限公司)为模板的PCR (聚合酶链式反应)扩
增获得。
[0034]以人类肝脏cDNA文库为模板，以Tl-N和T2_C为引物，进行PCR扩增，得到该短肽基因片段的DNA编码序列，该基因片段两端分别带有BspEI和XbaI酶切位点。
[0035]Tl-N:5，-CAAGTCCGGAATGCGCTGTAAACAGGTGG-3’ (SEQ ID No:4)；
[0036]T2-C:5，-CTAGTCTAGATTAGGCTGTCGCTTTTTTTTG-3’(SEQ ID No:5)。
[0037]具体PCR反应体系如下:
【权利要求】
1.一种多肽，是如下(a)或(b)的多肽: Ca)由序列表中SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的多肽； (b)将序列表中SEQ ID No:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
2.权利要求1所述多肽的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因为如下I)~3)中任一所述的DNA分子: 1)序列表中的SEQID No:1所示的DNA分子； 2)在严格条件下能与I)限定的DNA序列杂交且编码具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的多肽的DNA分子； 3)与I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的多肽的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为将权利要求1所述多肽的编码基因插入BFP-1inker-pcDNA3.1中，得到的表达所述多肽的重组载体。
6.根据权利要求4所述的转基因细胞系，其特征在于:所述转基因细胞系是将权利要求5所述的重组载体导入到宿主`细胞中得到的转基因细胞系，其中所述宿主细胞为子宫颈癌细胞。
7.权利要求1所述多肽、权利要求2或3所述多肽的编码基因或者权利要求4所述重组载体或转基因细胞系在抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡中的应用；或 权利要求1所述多肽、权利要求2或3所述多肽的编码基因、权利要求4所述重组载体或转基因细胞系在制备抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述肿瘤细胞为子宫颈癌细胞。
9.一种抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡的产品，其活性成分为权利要求1所述多肽、权利要求2或3所述多肽的编码基因或者权利要求4所述重组载体或转基因细胞系。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于:所述肿瘤细胞为子宫颈癌细胞。
【文档编号】A61K48/00GK103626863SQ201310580998
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】夏斌, 王磊, 魏贺佳 申请人:北京大学