血清i型鸭肝炎病毒冻干方法及其冻干制剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，由含有血清I型鸭肝炎病毒的材料直接冷冻干燥制得；所述含有血清I型鸭肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种血清I型鸭肝炎病毒24小时后死亡的8-10日龄鸡胚的尿囊液，或尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体的无菌匀浆混合液；该方法操作简单、成本低廉，不需要添加冻干保护剂和冻干稀释液，制得的血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂可以在10℃～-80℃保存，病毒效价无明显变化，保存条件要求低，保存时间长。
【专利说明】血清I型鸭肝炎病毒冻干方法及其冻干制剂
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种病毒冻干方法及其冻干制剂。
【背景技术】
[0002] 鸭病毒性肝炎（Duck Viral Η印atitis，DVH)是由鸭肝炎病毒（Duck Η印atitis Virus，DHV)引起的一种高度致死性传染病，以发病急、病程短、发病率和死亡率高为特点。 鸭病毒性肝炎分为3个各自独立的没有血清学关系的血清型：1型、II型和III型。其中， 血清I型鸭肝炎病毒（DHV-Ι)又称鸭甲型肝炎病毒（Duck h印atitis A virus，DHAV)，是目 前我国流行的主要鸭肝炎病毒，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失，威胁着养鸭业的健 康发展。
[0003] 鸭甲型肝炎病毒目前发现有三种基因型，S卩DHAV-UDHAV-2和DHAV-3,根据报道， 我国目前流行的主要是DHAV-1，三种基因型均属于小RNA病毒科禽肝病毒属，病毒粒子呈 球形或类球形，核衣壳呈20面体对称，直径为20-40nm，无囊膜，胞浆内繁殖，核酸为不分节 段的单股正链RNA。该病毒对乙醚、氯仿、甲醇、胰酶、硫酸铵、常用消毒剂等有一定程度的 抵抗力；能耐受PH3. 0的酸性环境；对热也有较强抵抗力，56°C加热1小时仍有部分病毒存 活。鸭甲型肝炎病毒不能凝集任何动物的红细胞，可在鸭胚和鸡胚的绒毛尿囊腔及鸡胚组 织、鸭胚肝细胞、鸭胚肾细胞、鹅胚肾细胞等中增殖。
[0004] 病毒的保存在病毒研究中是一个十分重要的环节。例如，在对某病毒株生物学特 性进行长期、深入研究时，或对不同年代、不同地域的流行分离病毒株进行异同比较时，都 需要保持病毒的遗传稳定性。而病毒弱毒疫苗种毒的保存、灭活疫苗种毒的保存等同样与 病毒保存有着紧密的联系。病毒保存的方法有：冰箱保存法（普通冰箱保存：4?8°C ;低 温冰箱保存：-20°C?-40°C ;超低温冰箱保存：_85°C )、液氮保存法（_196°C )和冷冻真空 干燥保存法（冻干法）。其中，冷冻真空干燥保存法因不易发生液体泄漏导致污染、保存时 间长、保存条件简单及保存成本低（不需消耗液氮）等优点而成为病毒保存的一种较好方 法。在冷冻真空干燥保存法中，在冻干前通常需要加入冻干保护剂，冻干保护剂的作用是使 保存对象在冻干过程中免受损伤并减少在保存过程中的死亡。冻干保护剂的种类有很多， 如牛/马血清、无菌牛奶等，但不同保存对象适用的冻干保护剂不一定相同，需要研究者根 据保存对象的特点采用适宜的冻干保护剂才能获得所需要的保存效果。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，该方法简 单，成本经济，获得的冻干制剂保存条件要求低，保存时间长。
[0006] 经研究，本发明提供如下技术方案：
[0007] 1.血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，是将含有血清I型鸭肝炎病毒的材料直接冷冻 干燥，即得；所述含有血清I型鸭肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种血清I型鸭肝炎病毒24 小时后死亡的8-10日龄鸡胚的尿囊液，或尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体的无菌匀浆混合液。
[0008] 进一步，所述血清I型鸭肝炎病毒为1型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-1)。
[0009] 进一步，所述含有血清I型鸭肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种血清I型鸭肝炎病 毒24小时后死亡的9日龄鸡胚的尿囊液，或尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体的无菌匀浆混合 液。
[0010] 进一步，所述冷冻干燥是先在4°C预冻0. 5小时、-20°c预冻1小时，再-70°c冷冻 过夜，次日真空干燥24-48小时。
[0011] 2.采用上述方法制备的血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂。
[0012] 本发明的有益效果在于：本发明提供了一种简单、经济的血清I型鸭肝炎病毒冻 干制剂的制备方法，不需要添加冻干保护剂和冻干稀释液，只需将含血清I型鸭肝炎病毒 的材料（鸡胚的尿囊液，或尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体的无菌匀浆混合液）直接冻干即可， 制得的血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂可以在10°c?-80°c保存，病毒效价无明显变化，保存 条件要求低，保存时间长。
【具体实施方式】
[0013] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面对本发明的优选实施 例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照 试剂制造厂商所建议的条件进行。
[0014] 实施例1、血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂的制备
[0015] 1、病毒株
[0016] 血清I型鸭肝炎病毒CH60株，该病毒株为本实验室分离致弱的病毒株，已申请专 利（申请号为201310011872. 3)并进行生物材料保藏（保藏编号为CCTCC NO. V201248)。
[0017] 2、实验用胚
[0018] 9日龄SPF鸡胚。
[0019] 3、病毒的增殖
[0020] 将血清I型鸭肝炎病毒CH60株种毒用生理盐水稀释5倍后，按常规加入青霉素、 链霉素至终浓度分别为l〇〇IU/mL和100μ g/mL，经尿囊腔接种20枚9日龄鸡胚，0. 2ml/胚， 同时设立生理盐水阴性对照胚5枚。接种后的鸡胚用石蜡封闭进针孔，37°C孵化6天，每天 照胚2次，在生理盐水阴性对照胚不死亡的前提下，弃去24小时内死亡的血清I型鸭肝炎 病毒CH60株接种鸡胚，收集24小时后死亡的血清I型鸭肝炎病毒CH60株接种鸡胚，4°C冷 藏过夜。
[0021] 4、病毒冻干材料的制备
[0022] 取前述收集的血清I型鸭肝炎病毒CH60株接种鸡胚10枚，分别在无菌条件下按 常规方法吸取尿囊液，混匀，作为病毒冻干材料（尿囊液毒）；另取前述收集的血清I型鸭 肝炎病毒CH60株接种鸡胚10枚，分别在无菌条件下按常规方法收取尿囊液、尿囊膜、羊水 和胚体，无菌匀浆，作为病毒冻干材料（混合毒）。
[0023] 5、病毒冻干制剂的制备
[0024] 取前述两种病毒冻干材料，分别注入5ml或10ml西林瓶中，每瓶l_2ml，半加塞； 分别在4°C预冻0. 5小时、-20°C预冻1小时，然后-70°C冷冻过夜，次日真空干燥24小时， 即得两种血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂。
[0025] 实施例2、血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂在冻干前后的特性及效价变化
[0026] 1、血清I型鸭肝炎病毒CH60株对鸡胚半数致死量（ELD5CI)的测定
[0027] 将血清I型鸭肝炎病毒CH60株种毒用生理盐水连续进行10倍的梯度稀释，即 10' 1〇-2、10' ι〇-4、ι〇-5、1〇-6、10' 1〇-8和1〇-9,共9个不同稀释度。将各个稀释度的病毒悬 液分别接种于9日龄鸡胚尿囊腔，每个稀释度接种5枚鸡胚，0. 2ml/胚，同时设立未稀释的 血清I型鸭肝炎病毒CH60株种毒阳性对照组和生理盐水阴性对照组。接种后的鸡胚用石 蜡封闭进针孔，37°C孵化6天，每天照胚2次，观察记录各组鸡胚死亡情况，弃去24小时内 死亡鸡胚，记录24小时后死亡鸡胚数，按Reed-Muench法计算血清I型鸭肝炎病毒CH60株 对鸡胚的半数致死量。
[0028] 2、血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂在冻干前后的特性及效价变化
[0029] 观察记录实施例1所得血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂在冻干前后的特性变化，并 按前述方法测定实施例1所得血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂在冻干前后对鸡胚的半数致死 量。结果见表1，实施例1所得血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂的效价不低于冻干前效价的 90 %，且效价下降在0. 5个滴度以内。
[0030] 表1血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂在冻干前后的特性及效价变化
[0031]
【权利要求】
1. 血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，其特征在于，将含有血清I型鸭肝炎病毒的材料直 接冷冻干燥，即得；所述含有血清I型鸭肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种血清I型鸭肝炎病 毒24小时后死亡的8-10日龄鸡胚的尿囊液，或尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体的无菌匀浆混 合液。
2. 如权利要求1所述的血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，其特征在于，所述血清I型鸭肝 炎病毒为I型鸭甲型肝炎病毒。
3. 如权利要求1或2所述的血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，其特征在于，所述含有血 清I型鸭肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种血清I型鸭肝炎病毒24小时后死亡的9日龄鸡 胚的尿囊液，或尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体的无菌匀浆混合液。
4. 如权利要求1所述的血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，其特征在于，所述冷冻干燥是先 在4°C预冻0. 5小时、-20°C预冻1小时，再_70°C冷冻过夜，次日真空干燥24-48小时。
5. 采用权利要求1至4任一项所述方法制备的血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂。
【文档编号】A61K39/29GK104147598SQ201410397321
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】程安春, 汪铭书, 陈孝跃 申请人:四川农业大学