一种昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法

专利名称：一种昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法
技术领域：
本发明涉及领域包括昆虫资源利用、生物技术和医药与兽药研制，可适合各种昆虫的 筛选。
背景技术：
作为地球上种类最多的生物，昆虫具有繁殖快、适应性广的特点，除海洋外，所有生 态环境都有昆虫的分布。自19世纪起，昆虫就被作为免疫防卫系统的研究对象，研究表明 抗菌蛋白在昆虫体液免疫反应中起着关键作用(Boman， 2003; Kimbrell， 2001; Hoffmann 等，1992; Hiiltmark, 1993)。尚存于地球上的现有昆虫都是经受剧烈的生存竞争获胜而 生存下来的，它们在长期进化的过程中增强了抵抗各种病原菌侵染的能力，这就为我们筛 选具有抗菌作用的昆虫抗菌蛋白/肽及其目的基因提供了丰富的基因资源库。抗菌蛋白/肽 因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊作用机理，已引起人们极大的研究兴 趣。它抗菌谱广，对细菌、病毒、某些原虫、真菌及肿瘤细胞等具有选择性杀伤作用(Boman， 2000)且本身无毒、无害(Giacometti等，2000)。目前，从昆虫体内获得约有170种抗菌 肽(Bulet等，1999)。自1980年瑞典斯德哥尔摩大学Boman研究小组，首次由大肠杆菌注射诱导处理的惜古 比天蚕蛾滞育蛹血淋巴中提纯得抗菌肽以来，国内外许多学者就昆虫源的抗菌蛋白/肽已做 了大量的筛选、活性测定、基因克隆与表达等工作，且明确昆虫抗菌蛋白/肽可分成天蚕素 (cecropins)、防卫素(defensins)、富含月甫氛酸的抗菌月太(prolin-rich antibacterial peptides) 和富含甘氨酸的抗菌肽(glycine-rich antibacterial peptides)，计四大类(Brey等，1998)。 尽管如此，在筛选方法及相应的基因克隆技术方面还是存在效率偏低，新抗菌蛋白/肽及其基因难以发现等问题。如图1所示，传统的研究中所采取的技术途径不外乎2种途径1(1)先用外源因子如常用注射大肠杆菌，诱导昆虫产生抗菌蛋白/肽；(2) 以抗生素(青霉素)为对照，用纸片法进行抑菌圈测定，以评价抗菌效果；(3)再分离 纯化虫体匀浆液或血淋巴中的抗菌蛋白/肽，作进一步活性验证；(4)测定纯抗菌蛋白/ 肽的N端氨基酸序列，设计兼并引物，采用PCR法扩增基因，再进行表达，及表达产物活性的验证 (Lehrer，R丄，ROSENMAN, m" Harwig， S.S" Jackson, R. and Eisenhauer, P. Ultrasensiteve assays for endogenous antimicrobial polypiptides丄Immunol. Methods, 1991,137: 167-173; Cole， A.M., Wu, M., Kim, Y.H. and Ganz, T. Microanalysis of antimicrobial proerties of human fluids.丄Microbiol. Methods, 2000, 41: 135-143; Barreteau, H., Mandoukou, L., Adt, I" Gaillard, I., Courtois, B. and Courtois, J. A rapid method for determing the antimicrobial activity of novel natrual molecules. J. Food Prot， 2004,67: 1961-1964 )。该研究途径的主要局限 一是需要对一个一个组分进行逐一分析，工作量大，效率低； 二是对蛋白/肽纯化技术及设备要求高，正因为这样，有时即使发现了有很强抗菌活性的组 分，也因纯化不过关而难以获得其相应的基因，使得采用基因工程手段规模化生产该强活 性组分不能实现。途径2(1)根据已有报道的抗菌蛋白/肽基因设计相应引物；(2)以某种昆虫或 不同昆虫为材料，提取mRNA，采用PCR方法扩增相似目的基因；(3)表达获得的目的基 因；以抗生素(如青霉素)为对照，用纸片法进行抑菌圈测定，以评价抗菌效果。最后， 评判哪些基因的表达产物具有理想的抗菌活性，具备应用前景(Steinberg,D.A. and Lehrer, R.I. Designer assays for antimicrobial peptides. Disputing the "one-size-fits-all，' theory. Methods Mol. Biol" 1997， 189: 113-130; Tanchak, M., Schemthaner, J., Giband, M. and Altosaar I. Tryptophanins: isolation and molecular characterization of oat cDNA clones encoding proteins structurally related to puroindoline and wheat grain softness proteins. Plant Sci.，1998, 137: 173-184)。该研究途径的主要局限 一是因根据现有抗菌蛋白/肽基因而设计引物，其结果使得获 得的基因与现有的有较大的相似性，其有所不同的只是因供试昆虫不同而已，这样难以发 现新抗菌蛋白/肽及其基因；二是对所获得的目的基因表达物要逐一进行活性测定与评价，效率欠高。发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种能大大提高筛选的针对性与效率的昆虫源抗菌蛋白/肽基因文库的构建及筛选方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种昆虫源抗菌蛋白/肽基因文库的构建及筛选方法，包括以下步骤(1)昆虫源抗菌蛋白/肽基因的cDNA表达性文库的构建自昆虫分离总RNA，提取poly (A)+RNA，克隆构建得昆虫源抗菌蛋白/肽基因的cDNA表达性文库；(2) cDNA表达性文库的筛选a、 制备S0LR菌液；b、 将原噬菌体文库转化入制备好的SOLR菌液中并测定效价；c、 制备LB/Amp+滤膜平板；d、 取已转化的S0LR菌液铺板，先在0.45鹏的LB/Amp+微孔滤膜平板上涂板，37°C 倒置培养15小时左右至膜上有O. 1 0.5咖的菌落形成；再转移至LB/Amp7lPTG+培养基， 37。C倒置培养3 4小时，至菌落生长到0. 9 1. 1毫米，转至染色琼脂培养基，染色10 15分钟；同时与未经IPTG诱导培养的作对照；挑取蓝色菌落，于100微升含20%甘油的 LB/Amp+培养液中，一7(TC贮存，得昆虫源抗菌蛋白/肽基因。作为本发明的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法的改进步骤(1)中总認A 自昆虫的整体或特定器官分离得到。作为本发明的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法的进一步改进步骤(1)采用纯化mRNA试剂盒获得poly (A)+RNA。作为本发明的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法的进一步改进步骤(1)采 用cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA合成试剂盒和ZAP-c咖A Gigapack III克隆试剂盒构建得cDNA表达性文库。作为本发明的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法的进一步改进步骤(2) d 中的染色琼脂培养基按照如下方法配制称取0. 5g苔酚蓝和0. 5g溴酚蓝，分别溶解于9. 5 克水中，从而分别配成5%的苔酚蓝母液和溴酚蓝母液；另称取4克琼脂溶于1L水中，加 热使其彻底溶解，再加入1毫升苔酚蓝母液和1毫升溴酚蓝母液，混匀后放置半小时使其 冷却凝固即可。作为本发明的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法的进一步改进步骤(2) d 中的SOLR菌液是cDNA合成试剂盒中自带SOLR菌液。作为本发明的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法的进一步改进步骤(2)的 原噬菌体文库即步骤(1)中所构建的cDNA表达性文库；LB/A卿+滤膜平板的制备方法如下按照下列配方配制LB培养基琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物 5克、蒸馏水l升；均匀混合后，120'C高温高压灭菌后冷却至5(TC左右，加入100毫克/6毫升的氨苄青霉素母液1毫升；摇匀后倒于培养皿中，等其冷却凝固后在培养基表面放上 高温灭菌过的孔径为0. 45微米的微孔滤膜，即得LB/A卿+滤膜平板； LB/Amp7lPTG+培养基的制备方法如下按照下列配方配制LB培养基琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物 5克、蒸馏水1升；均匀混合后，12(TC高温高压灭菌后冷却至5(TC左右，加入100毫克/ 毫升的氨苄青霉素母液1毫升，0.5摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷母液l毫升，摇匀后倒 于培养皿中，等其冷却凝固后，即得18^1^+/1 1&+培养基。本发明是针对传统昆虫源抗菌蛋白/肽基因的克隆与筛选技术耗时、费钱，效率较低， 对蛋白/肽纯化要求高，以及难以发现新抗菌蛋白/肽等的技术问题，解决并建立基于cDNA 表达性文库而无须任何相关基因研究背景就能筛选出具有抗菌活性的蛋白/肽及其基因的 高效克隆筛选技术。该技术鉴于潜在抗菌蛋白/肽目的表达物能致死本身宿主菌的特点，将 潜在抗菌蛋白M太的昆虫源目的基因的表达与表达物抗菌活性初步测定紧密相合，进行筛 选。当筛选到表达物能使宿主菌死亡的克隆时，也就获得了相应的源于昆虫的插入之文库 中的目的基因。这就大大提高了筛选的针对性与效率。本发明的方法具体如下1 、 cDNA表达性文库的构建自昆虫(种类可选择)的整体或特定器官(组织)分离总RNA，以纯化mRNA试剂 盒获得poly(A)+RNA。再采用cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA 合成试剂盒和 ZAP-cDNA Gigapack III克隆试剂盒，参照试剂盒操作说明进行各步操作，即构建得cDNA 表达性文库。2、 cDNA文库的筛选(1) 制备SOLR菌液；(2) 将原噬菌体文库转化入制备好的SOLR菌液中并测定效价；(3) 制备LB/Amp+滤膜平板；(4) 取已转化的SOLR菌液铺板，先在LB/Amp+微孔滤膜(①0.45 mra)平板上涂板，37°C 倒置培养15h左右至膜上有较小的菌落形成。再转移至LB/Amp"IPTG+培养基，37。C倒置 培养3 4h，至菌落生长到正常大小，转至染色琼脂培养基(苔酚蓝0.0005%，溴酚蓝0.0005 %，琼脂0.4%)，染色10min左右，染色。同时与未经IPTG诱导培养的作对照(菌落都 为白色)。用灭菌牙签挑取蓝色菌落(之所以呈蓝色是因为该菌落中昆虫源基因表达的蛋白/肽能使SOLR菌死亡，死亡的细胞被苔酚兰染色成蓝色，否则为白色)，于100 pi的 LB/Amp+ (含20%甘油)培养液中，一7(TC贮存。 具体关键技术方案如图2所示具有抗菌作用基因的质粒转化入SOLR菌后，在诱导剂IPTG的诱导下基因表达后产 生抗菌的蛋白/肽，致使菌体的细胞膜收到破坏，从而允许染料分子进入细菌细胞，发生显 色反应，即观察发现蓝色的克隆。所以，这些被染成蓝色的克隆就是含有抗菌基因的克隆。 将它们挑出后测序，就可得到相应的基因序列。该发明一方面可免除传统方法(途径1)大量复杂的昆虫材料中抗菌物质的制备与纯 化，及抗菌活性的逐一验证；另方面，可避免传统方法(途径2)限于已有抗菌蛋白/肽基 因而设计引物进行基因扩增、克隆与表达的局限性，即仅挖掘一些相关的基因，而难发现 新抗菌蛋白/肽基因。相比之下，本技术不仅能够直接、快速、有效地筛选昆虫体内的具抗 菌活性的蛋白/肽，而且即可知道其对应的基因，为通过基因工程手段规范化大量表达目的 基因奠定了良好的技术关键。


下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。 图l是抗菌蛋白/肽及其基因筛选克隆的传统途径示意图；图2是本发明的基于cDNA表达性文库的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的高效克隆筛选技术 方案示意图；图3是本发明的筛选时滤膜上的S0LR菌菌落图； 此图中在大量白色菌落中有形状较小的蓝色菌落，即是包含具潜在抗菌活性的目的 基因；图4是本发明的具有抗菌作用的基因表达产物(蛋白/肽)对SOLR菌的抑制效果图； 此图中S0LR菌对照细菌生长快，菌液混浊；含抗菌蛋白/肽基因的S0LR菌细菌生长受抑制，菌液相对透明；图5是用纸片法测试抗菌蛋白/肽基因表达物对S0LR菌的抑制效果图；此图中"1"代表卡那霉素阳性对照(浓度lmg); "2"代表克隆1表达物；"3"代表 克隆2表达物；"4"代表克隆3表达物；"5"代表克隆4表达物；"6"代表克隆5表达物;"7"代表克隆6表达物。
具体实施方式
实施例l、 一种昆虫源抗菌蛋白/肽基因文库的构建及筛选方法，依次进行以下步骤1. cDNA表达性文库的构建在提取昆虫mRNA的基础上，根据相应试剂盒的操作指南所规定的步骤进行。 自昆虫(种类可选择)的整体或特定器官(组织)分离总RNA，以纯化mRNA试剂 盒获得poly(A)+RNA。再采用cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA 合成试剂盒和 ZAP-cDNA Gigapack III克隆试剂盒，参照试剂盒操作说明进行各步操作，即构建得cDNA 表达性文库。(试剂盒可从各生物公司购得)2. cDNA文库的筛选(1) SOLR菌液准备接菌环在酒精灯上灼烧至红，冷却后蘸取少量大肠杆菌SOLR甘油菌于含Kan+的LB 平板上划线，37。C倒置培养12h。挑取单菌落于50ml的LB丰富培养基(LB营养琼脂) 中，37°C， 200rpm培养12h左右。转移至50ml离心管中，1000g ， 4"C离心10min。去 上清液，再用10mM的MgSO4悬浮沉淀，调解OD,值为1.0。(2) LB/Amp+滤膜平板的准备制备含100 pg/ml的Amp+的LB平板若干。LB/Amp+滤膜平板的制备方法如下 按照下列配方配制LB培养基琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸馏水1升；均匀混合后，12(TC高温高压(0.4Mpa)灭菌后冷却至5(TC左右，加入100毫克/毫升的氨苄青霉素母液1毫升；摇匀后倒于培养皿中，等其冷却凝固后在培养基表面放上高温灭菌过的孔径为0.45微米的微孔滤膜，即得LB/Amp+滤膜平板；即取已灭菌的滤膜(孔径0.45pm)铺于LB/Amp+平板上，注意膜与平板之间无气泡。(3) 转化将原噬茵体文库(即步骤l所构建的cDNA表达性文库)加双蒸水稀释50倍，分别取 稀释过的菌液1 pl于上述步骤(1)所得的200 plSOLR菌液中，37'C温育15 min;取100 W在LB/Amp+滤膜平板上涂板，用三角棒(在酒精灯上灼烧并冷却)涂幵，正面向上放置 20 min后37"C倒置培养12 h。査看细菌生长情况，从而决定转化反应体系中原噬粒文库的稀释倍数，由于稀释50 倍及100倍后转化效果不好，从而不稀释。取100pl的PP噬粒(原噬菌体文库)于上述步骤(1)所得的2ml的S0LR菌液中， 37。C温育15 min，取100 pl在LB/Amp+滤膜平板上涂板，用三角棒(在酒精灯上灼烧并冷却)涂开，正面向上放置20min后37'C倒置培养12h，査看结合效果。将上步所得的PP 噬粒与SOLR的结合产物2ml置于LB培养液50ml中，37°C， 200 rpm振荡培养4~5 h， 至稠，再取100pl在LB/Amp+滤膜平板上涂板，37'C倒置培养12h，测定效价。将上述转化所得的50ml菌液按20X的体积比例加入甘油，摇匀后分装成lml/管，于 一7(TC贮存备用。按100倍、1000倍和10000倍的比例稀释上述菌液后，各取100 (xl在LB/Amp+滤膜 平板上涂板，正面向上放置20 min后37'C倒置培养12 h。观察膜上菌落生长情况以找出 最佳倍数。通过测定效价和最佳稀释倍数。找出最佳反应菌液体积，即100^1/板，培养后每块LB 滤膜平板上有几千个菌落。(4) 铺板、染色取一70。C贮存的已转化的SOLR菌液100 pi在LB/Amp+滤膜平板上涂板，正面向上放 置20 min后，于37。C倒置培养15 h左右至膜上有较小(一般为0.1 0.5mm)的菌落形成。 再转移至13^\1!^+/^10+培养基，37'C倒置培养3~4 h，至菌落生长到正常大小(一般为 0.9 1.1mm)，转至染色琼脂培养基，染色10min左右，仔细观察后用灭菌牙签挑取蓝色 菌落(见图3)于100 pl的LB/Amp+ (含20%甘油)培养液中，并记录挑取的菌落大小及 染色深浅情况，涡旋振荡混匀后分别分成两管，在两管上标上相同的号码，如PPla， 一70'C 贮存。上述染色琼脂培养基的制作方法如下称取0.5g苔酚蓝和0.5g溴酚蓝，分别溶解于 9.5克水中，从而分别配成5%的苔酚蓝母液和溴酚蓝母液；另称取4克琼脂溶于1L水中， 加热使其彻底溶解，再加入1毫升苔酚蓝母液和1毫升溴酚蓝母液，混匀后放置半小时使 其冷却凝固即可。即所得染色琼脂培养基为苔酚蓝0.0005%，溴酚蓝0.0005%，琼脂0.4%。上述LB/Amp7lPTG+培养基的制备方法如下按照下列配方配制LB培养基琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物 5克、蒸馏水l升；均匀混合后，120。C高温高压灭菌后冷却至5(TC左右，加入100毫克/ 毫升的氨苄青霉素母液1毫升，0.5摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷母液1毫升，摇匀后倒 于培养皿中，等其冷却凝固后，即得1^^1^+/:^10+培养基。(5) 涂板法验证取第一次挑出的菌液样品(步骤(4)中铺板染色后挑出的蓝色克隆样品)，置于冰上。吸取5 nl涂于LB/Amp+ZIPTG—及LB/Amp+ZIPTG+滤膜平板，正面向上放置10 min后37°C倒置培养12 h。LB/Amp7lPTG—滤膜平板的制备方法如下按照下列配方配制LB培养基琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物 5克、蒸馏水l升；均匀混合后，120'C高温0.4Mpa灭菌后冷却至5(TC左右，加入100毫 克/毫升的氨苄青霉素母液1毫升；摇匀后倒于培养皿中，等其冷却凝固后在培养基表面 放上高温灭菌过的孔径为0. 45微米的微孔滤膜，即得LB/Amp7lPTG-滤膜平板。LB/Amp7lPTG+滤膜平板的制备方法如下按照下列配方配制LB培养基琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物 5克、蒸馏水l升；均匀混合后，120'C高温高压灭菌后冷却至5CrC左右，加入100毫克/ 毫升的氨苄青霉素母液1毫升，0. 5摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷母液1毫升，摇匀后倒 于培养皿中，等其冷却凝固后在培养基表面放上高温灭菌过的孔径为0.45微米的微孔滤 膜，即得LB/Amp7lPTG+滤膜平板。将膜取下置于染色琼脂培养基上染色，比较膜上同一样品菌落生长的大小、密度、着 色度及在1^/八11^+/1 丁0+滤膜平板上的菌落是否呈现统一颜色的情况，将详细情况进行记 录。根据染色的不同情况，作出不同的处理；将新挑出的菌落保存于的LB/Amp+ (含 20%甘油)培养液中，涡旋振荡混匀后分别分成两管，在两管上标上与原样品相同的号码， 如PPlb(b表示是涂板法验证后重新挑取的菌液样品)，一70。C贮存。①如果两张膜上的菌落均不被染成蓝色，则说明此样品不含杀菌作用的基因，可丢 弃该样品。② 如果菌落在1^/八11^+/1 10+滤膜上被部分染成蓝色，而在1^^!1^+/1 丁0-上不染 色，说明挑取的样品具有杀菌作用的基因，但此样品混合了其他不含杀菌作用基因的克隆， 则挑取1^/八11^+/1 丁0+滤膜上被染成蓝色的单菌落于100 ^的1^/八11^+ (含20%甘油) 培养液中，涡旋振荡混匀后分成两管，在两管上标上与原样品相同的号码，如PPlb(b表示 是划线法验证后重新挑取的菌液样品)，一70'C贮存。③ 如果菌落在LB/AmpVlPTG+滤膜上被全部染成蓝色，而在LB/Amp+ZIPTff上不染 色，说明挑取的样品具有杀菌作用的基因，且此样品只含有该种克隆，则挑取 !^/紐 +/1 丁0—上的无色单菌落于100的^LB/Amp+ (含20%甘油)培养液中，涡旋振荡混匀后分成两管，在两管上标上与原样品相同的号码，如PP2b， 一70。C贮存。 如果菌落在1^^^1^+/1 10+滤膜上被部分染成蓝色，而在LB/Amp+ZIPTff膜上也有 部分被染成蓝色，说明挑取的样品含有杀菌作用的基因，且该基因在没有IPTG诱导的情 况下也能表达从而产生杀菌效果；但此样品混合了其他不含杀菌作用基因的克隆，处理方 法同②。⑤如果菌落在LB/Amp+/IPTG+及1^/八11^+/1 丁&两张滤膜上全部被染成蓝色，说明 挑取的样品含有杀菌作用的基因，且该基因在没有IPTG诱导的情况下也能表达从而产生 杀菌效果，且此样品只含有该种克隆，因此只需保存原先保存的样品，不用再挑取新的菌 落。对于还没有纯化的样品如情况②和④还需进行再次涂板，直至在LB/Amp+ZIPTG+滤膜 平板上呈现统一的蓝色为止。 3.抗菌活性验证 (1)液体抑菌实验①取保存的菌液样品(经步骤(5)验证后保存的菌液)涂于LB/Amp"7lPTG-及 1^/八11^+朋丁0+滤膜平板，培养过夜后转至染色琼脂培养基染色，如果+IPTG板上的克隆 全部染色，则挑取-ITPG板上白克隆5-10个;如果+IPTG板上的克隆不是全部染色的话，说 明菌样在保存后经过多次操作，可能已经不纯，则挑取+IPTG板上的染色克隆5-10个。② 将挑取的克隆接入5mlLB/Amp+培养液，37°C、 200卬m震荡培养10小时左右，使 细菌的OD600达到1.0左右。③ 取上述步骤②的菌液(即OD,达到1.0左右的菌液)30pJ于3ml的LB/Amp+培 养液(AMP新鲜加入)中，(每个样品接4管,2管+ITPG,2管-ITPG)。分别培养2,3,4小 时后测OD,(经常观察，当一IPTG的菌液的OD600值大致在0.5左右时测其值)。测 定前目测观察细菌培养液，注意是否有沉淀状物出现。(2)抑菌圈实验 ①抗菌蛋白的制备1.取保存的样品甘油菌(即经步骤(5)验证后保存的菌液)涂于LB/Amp+/IPTGtl 膜平板，37t正面向上放置lOmi.n后，倒置培养过夜，转于LB/AMP+/IPTG+平板再培养3 小时。2. 取膜于染色琼脂培养基上染色，挑取蓝色单菌落悬浮于50(^1 LB/ Amp+培养液，分别取200nl上述菌液涂布于两块LB/Amp7IPTG—滤膜平板(直径15厘米)，37'C正面向上 放置10min后，倒置培养过夜，至有菌落生成。3. 将其中一块LB/Amp7IPTG—滤膜平板上的膜转于LB/AMP7IPTG+平板，另一块保持 原样，两块平板37T:倒置继续培养3 4h。4. 从上述两块LB/AMP7IPTG+滤膜平板及LB/Amp7IPTff滤膜平板上的膜切下l 2cm2的小块于染色琼脂培养基上染色，如LB/Amp7IPTG—滤膜上的菌落呈现一致的无色(有 少数样品可能也会呈现一致的蓝色)而LB/AMP7IPTG+滤膜上的菌落呈现一致的蓝色，说 明染色反应正常，可进行抗菌蛋白的提取。5. 取两个已经灭菌的1.5ml离心管，写上编号(以PP7号样品为例)7a、 7b，将如 LB/Amp7IPTGtl膜平板上的菌落用灭菌的刀片刮到7a管中，而LB/AMP7IPTG+滤膜平板 上的菌落用灭菌的刀片刮到7b管中，记录菌的体积并保存于-2(TC。6. 用相同的操作方法收集所有菌液。7. 取搜集的菌落样品加相同体积的裂解液(20mM HEPES, pH7.6, 500mM NaCl, 10% glycerol, lmM EDTA, lmM PMSF, 5ug/ml leupeptine, 1% v/v Aprotinin, 0.1% NP40)，涡旋混匀后将样品置于液氮中冷却，3"水浴解冻，重复上述操作5次，使细胞完全破碎， 4"C12000rpm离心10min后取上清至1.5ml离心管，编上相同编号，记录上清液的体积并 于-2(TC贮存，这就是粗提的待测的"抗菌"蛋白。8. 为了得到较多量的"抗菌"蛋白，可在步骤2中增加培养基的数量，操作方法相 同，只需将同以样品的菌体刮在同一离心管中，使得最终得到的菌量达到500nl左右。② 试验菌液的制备为了排除抑菌作用由AMP引起的可能性，应使用带质粒的SOLR菌；将菌液培养到 OD值为0.5左右时放置于4。C保存。③ 滤纸片的制备取新华l号定性滤纸，用打孔机打成6mm的小纸片，灭菌烘干备用。
等所有东西准备完之后，按照配方(琼脂l%w/v，蛋白胴l%w/v，酵母提取物0.5% w/v，氯化钠0.05% w/v)配置琼脂糖培养基，将pH调至7.0后灭菌，倒板等其冷却后， 取用LB液体培养基稀释100倍的上述试验菌液200nl均匀涂板，等菌液吸收10min钟后 将三层滤纸片放置于培养基上(放三层纸片是为了增大加样量)。然后将提取的蛋白20^1加在滤纸片上，用卡那霉素做阳性对照，正面向上吸收完全后倒置培养过夜。观察抑菌圈， 测其大小。4测序筛选所得并经过验证的含抗菌蛋白/肽的质粒的菌液样品送至测序公司进行测序；测序 结果用 Genebank ( http:ASvww.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST ) 禾B AMP 数据库 (http:〃aps.unmc.edu/AP/main.php; http:〃reseach.izr.astar.edu.sg/Templar/DB/ANTIMIC)进行相似物和同源物的检索。通过序列比对判断所筛选的基因是否系新基因。为了证明本发明的优点，发明人作了以下的对比实验 对比实验l、将家蚕、家蝇、天蚕按照实施例l所示的方法和途径1所示的方法， 进行抗菌蛋白/肽基因文库的构建及筛选，筛选得到的克隆经测序公司测序后所得的结果 与已经报道的己知抗菌肽的序列(GENEBANK公布)完全一致。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明 不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1、一种昆虫源抗菌蛋白/肽基因文库的构建及筛选方法，其特征在于包括以下步骤(1)昆虫源抗菌蛋白/肽基因的cDNA表达性文库的构建自昆虫分离总RNA，提取poly(A)+RNA，克隆构建得昆虫源抗菌蛋白/肽基因的cDNA表达性文库；(2)cDNA表达性文库的筛选a、制备SOLR菌液；b、将原噬菌体文库转化入制备好的SOLR菌液中并测定效价；c、制备LB/Amp+滤膜平板；d、取已转化的SOLR菌液铺板，先在0.45mm的LB/Amp+微孔滤膜平板上涂板，37℃倒置培养15小时左右至膜上有0.1～0.5mm的菌落形成；再转移至LB/Amp+/IPTG+培养基，37℃倒置培养3～4小时，至菌落生长到0.9～1.1毫米，转至染色琼脂培养基，染色10～15分钟；同时与未经IPTG诱导培养的作对照；挑取蓝色菌落，于100微升含20％甘油的LB/Amp+培养液中，-70℃贮存，得昆虫源抗菌蛋白/肽基因。
2、 根据权利要求1所述的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法，其特征在于所 述步骤(1)中总RNA自昆虫的整体或特定器官分离得到。
3、 根据权利要求l或2所述的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法，其特征在于 所述步骤(1)采用纯化mRNA试剂盒获得poly(A)+RNA。
4、 根据权利要求3所述的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法，其特征在于所 述步骤(1)采用cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA合成试剂盒和ZAP-cDNA Gigapack III克隆试剂 盒构建得cDNA表达性文库。
5、 根据权利要求4所述的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法，其特征在于所 述步骤(2) d中的染色琼脂培养基按照如下方法配制称取0. 5g苔酚蓝和0. 5g溴酚蓝，分 别溶解于9. 5克水中，从而分别配成5%的苔酚蓝母液和溴酚蓝母液；另称取4克琼脂溶于 1L水中，加热使其彻底溶解，再加入1毫升苔酚蓝母液和1毫升溴酚蓝母液，混匀后放置半 小时使其冷却凝固即可。
6、 根据权利要求5所述的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法，其特征在于所 述步骤(2) d中的SOLR菌液是cDNA合成试剂盒中自带SOLR菌液。
7、根据权利要求6所述的昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法，其特征在于所 述步骤(2)的原噬笛体文库即步骤(1)中所构建的cDNA表达性文库； LB/Amp+滤膜平板的制备方法如下按照下列配方配制LB培养基琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物5 克、蒸馏水l升；均匀混合后，12(TC高温高压灭菌后冷却至50'C左右，加入100毫克/毫升 的氨苄青霉素母液1毫升；摇匀后倒于培养皿中，等其冷却凝固后在培养基表面放上高温灭 菌过的孔径为0. 45微米的微孔滤膜，即得LB/Amp+滤膜平板；1^#1^+/1 10+培养基的制备方法如下按照下列配方配制LB培养基琼脂20克、氯化钠10克、蛋白胨10克、酵母提取物5 克、蒸馏水l升；均匀混合后，120'C高温高压灭菌后冷却至50'C左右，加入100毫克/毫升 的氨节青霉素母液1毫升，0. 5摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷母液1毫升，摇匀后倒于培养皿中，等其冷却凝固后，即得1^〃1!^+/1 16+培养基。
全文摘要
本发明公开了一种昆虫源抗菌蛋白/肽基因文库的构建及筛选方法，包括以下步骤(1)昆虫源抗菌蛋白/肽基因的cDNA表达性文库的构建；(2)cDNA表达性文库的筛选a.制备SOLR菌液；b.将原噬菌体文库转化入制备好的SOLR菌液中并测定效价；c.制备LB/Amp⁺滤膜平板；d.取已转化的SOLR菌液铺板，经培养直至菌落生长到0.9～1.1毫米，转至染色琼脂培养基，染色；同时与未经IPTG诱导培养的作对照；挑取蓝色菌落，于100微升含20％甘油的LB/Amp⁺培养液中，-70℃贮存，得昆虫源抗菌蛋白/肽基因。采用本发明的方法构建及筛选昆虫源抗菌蛋白/肽基因文库，能大大提高筛选的针对性与效率。
文档编号C40B50/06GK101328616SQ20081012014
公开日2008年12月24日 申请日期2008年7月24日 优先权日2008年7月24日
发明者叶恭银, 吴珏靖, 慎小晶, 成雄鹰 申请人:浙江大学