专利名称：用作蛋白激酶抑制剂的化合物和组合物的制作方法
技术领域：
本发明提供一类新的化合物、含有这些化合物的药物组合物和使用这些化合物来治疗或预防与激酶活性异常或失调有关的疾病或病症，特别是与Abl、BCR-Abl、Bmx、CSK、TrkB、FGFR3、Fes、Lck、B-RAF、C-RAF、MKK6、SAPK2α和SAPK2β激酶异常激活有关的疾病或病症的方法。
背景技术：
蛋白激酶代表一大族蛋白质，它们在调节各种各样的细胞过程和保持对细胞功能的控制中起重要的作用。这些激酶的部分非限定性例子包括受体酪氨酸激酶如神经生长因子受体、trkB和成纤维细胞生长因子受体，FGFR3；非-受体酪氨酸激酶如Abl和融合激酶BCR-Abl、Lck、Csk、Fes、Bmx和c-src；以及丝氨酸/苏氨酸激酶如c-RAF、sgk、MAP激酶(例如，MKK4、MKK6等)、SAPK2α和SAPK2β。已经在许多疾病中观察到了异常的激酶活性，包括良性和恶性增殖性疾病以及由不合适的免疫和神经系统激活所导致的疾病。
本发明的新化合物可以抑制一种或多种蛋白激酶活性，因此预期可用于治疗激酶相关性疾病。
发明概述一方面，本发明提供式I化合物及其N-氧化物衍生物、前药衍生物、保护的衍生物、单一的异构体及其异构体混合物和这些化合物的可药用盐和溶剂化物(例如水合物) 其中W选自CH和N；Y选自C、S和S(O)；Z是二价基团，选自-Y(O)NR5-和-NR5Y(O)-；其中Y选自C、S和S(O)；并且R5选自氢和C1-12烷基；R1选自氢、卤素、羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基和-NR6R7；其中R6选自氢和C1-6烷基；R7选自C6-10芳基、C5-10杂芳基、C3-12环烷基和C3-8杂环烷基；或者R6和R7与R6和R7共同连接的氮一起形成C3-6杂环烷基或C5-10杂芳基；其中R7或R6和R7组合基团中的任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基均可以是未取代的或被1-3个选自下列的基团所取代卤素、氰基、硝基、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、卤素取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-6烷氧基、-XNR8R8、-XC(O)NR8R8、-XC(O)NR8XOR8、-XS(O)0-2NR8R8、-XS(O)0-2R8、-XNR8S(O)0-2R8、-XNR8C(O)R8、-XNR8SR8、-XP(O)NR8R8、-XCR8(OR8)R8、-XOC(O)R8、-XOR8和-XOR9；其中X是键或C1-12亚烷基，R8独立地选自氢和C1-6烷基，R9选自C6-10芳基和C5-10杂芳基。
R2选自氢和C1-6烷基；
R3选自氢、羟基、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、巯基、卤素、硝基和氰基；n为0、1或2；R4选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、C1-6烷基、卤素取代的C1-6烷基、C1-12烷氧基、卤素取代的C1-12烷氧基和-XR10；其中X为键或C1-6亚烷基，R10选自C6-10芳基、C5-10杂芳基、C3-12环烷基和C3-8杂环烷基；其中R10中的任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基是未取代的或被选自下列的基团所取代卤素、羟基、氰基、硝基、C1-6烷基、卤素取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基和卤素取代的C1-6烷氧基；m为1、2或3；并且其中苯环A和B可独立地具有最多4个由-N＝替代的-C＝基。
第二方面，本发明提供包含式I化合物或其N-氧化物衍生物、单一的异构体及异构体混合物；或其可药用盐，和一种或多种合适的赋形剂的药物组合物。
第三方面，本发明提供治疗动物、包括人的疾病的方法，其中抑制激酶活性，特别是抑制Abl、BCR-Abl、Bmx、CSK、TrkB、FGFR3、Fes、Lck、B-RAF、C-RAF、MKK6、SAPK2α和/或SAPK2β活性可预防、抑制或改善疾病的病理和/或症状，该方法包括给予动物治疗有效量的式I化合物或其N-氧化物衍生物、单一的异构体及异构体混合物或其可药用盐。
第四方面，本发明提供式I化合物在制备用于治疗动物疾病的药物中的用途，其中在所述疾病中，激酶活性，特别是Abl、BCR-Abl、Bmx、CSK、TrkB、FGFR3、Fes、Lck、B-RAF、C-RAF、MKK6、SAPK2α和/或SAPK2B活性对该疾病的病理和/或症状起作用。
第五方面，本发明提供制备式I化合物及其N-氧化物衍生物、前药衍生物、保护的衍生物、单一的异构体及异构体混合物和可药用盐的方法。
发明详述定义作为基团或其它基团，例如卤素取代的烷基和烷氧基的结构元素的“烷基”可以是直链或支链的。C1-4-烷氧基包括甲氧基、乙氧基等。卤素取代的烷基包括三氟甲基、五氟乙基等。除非另外说明，“烷基”可以任选地被-O-间断或任选地被-OH取代。
“芳基”是指含有6-10个环碳原子的单环或稠合双环芳香环。例如，芳基可以是苯基或萘基，优选苯基。
“亚芳基”是指由芳基衍生的二价基团。“杂芳基”如芳基所定义并且其中一个或多个环原子为杂原子。例如，杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯、咪唑基、苯并-咪唑基、嘧啶基、呋喃基、唑基、异唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
“环烷基”是指含有指定环原子数的饱和或部分饱和的单环、稠合的双环或桥接的多环。例如，C3-10环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
“杂环烷基”是指本申请中所定义的环烷基，条件是所述的一个或多个环碳由选自-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)2-的部分所代替，其中R为氢、C1-4烷基或氮保护基。例如，本申请中用于描述本发明化合物的C3-8杂环烷基包括吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基等。
“卤素”优选表示氯或氟，但也可以是溴或碘。
“治疗”是指减轻或缓和疾病和/或其并发症的方法。
优选的
具体实施例方式
的说明融合蛋白BCR-Abl是导致Abl原致癌基因与Bcr基因融合的相互易位的结果。因此，BCR-Abl能够通过增加促有丝分裂活性改变B-细胞。该增加导致对细胞凋亡的敏感性降低，并改变CML祖细胞的粘着力和归巢。本发明提供治疗与激酶有关的疾病，特别是与Abl、BCR-Abl、Bmx、CSK、TrkB、FGFR3、Fes、Lck、B-RAF、C-RAF、MKK6、SAPK2α和/或SAPK2β激酶有关的疾病的化合物、组合物和方法。例如，与BCR-Abl有关的白血病和其它增殖性疾病可通过抑制野生型和突变型BCR-Abl进行治疗。
在一个
具体实施例方式
中，涉及如下式I化合物，其中W为N；Y为C；Z为选自-C(O)NR5-和-NR5C(O)-的二价基团；其中R5选自氢和C1-6烷基；在另一具体实施方式
中，R1选自氢、卤素、羟基和-NR6R7；其中R6选自氢和C1-6烷基；R7选自C6-10芳基和C5-10杂芳基；或者R6和R7与R6和R7共同连接的氮一起形成C3-8杂环烷基；其中R7或R6和R7组合基团中的任何芳基、杂芳基或杂环烷基均可以是未取代的或被1-3个选自下列的基团所取代卤素、氰基、C1-6烷基、C2-6链烯基、卤素取代的C1-6烷基、卤素取代的C1-6烷氧基、-XNR8R8、-XC(O)NR8R8、-XC(O)NR8XOR8、-XS(O)2NR8R8、-XSR8、-XNR8S(O)2R8、-XNR8C(O)R8、-XOC(O)R8、-XOR8和-XOR9；其中X为键或C1-6亚烷基，R8为氢或C1-6烷基，R9为C6-10芳基；在另一具体实施方式
中，R2选自氢和C1-6烷基；R3为C1-6烷基；n为1；并且R4选自卤素、卤素取代的C1-6烷基和-XR10；其中X为键或C1-6亚烷基，R10选自C5-10杂芳基和C3-8杂环烷基；其中R10上的任一杂芳基或杂环烷基是未取代的或被C1-6烷基取代的；并且m为1、2或3。
在另一
具体实施例方式
中，Z为选自-C(O)NH-和-NHC(O)-的二价基团。
在另一
具体实施例方式
中，R1选自氢、卤素、羟基和-NHR7；其中R7选自苯基和吡啶基；或者R6和R7与R6和R7共同连接的氮一起形成吗啉-4-基；其中R7或R6和R7组合基团中的任何芳基、杂芳基或杂环烷基均可以是未取代的或被1-3个选自下列的基团所取代卤素、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、二甲基氨基、氨基、氨基羰基、甲基-氨基羰基、氨基磺酰基、1-羟基-乙基、羟基甲基、乙酰氧基-甲基、甲硫基、苯氧基、甲基-羧基-甲基、丁基-氨基-磺酰基、甲基、异丙烯基、甲氧基-乙基-氨基-羰基、1-羟基-1-甲基-乙基、甲基-磺酰基-氨基和甲基-羰基-氨基；并且R3为氢或甲基。
在另一
具体实施例方式
中，R4选自卤素、三氟甲基和-XR10；其中X为键或亚甲基；R10选自咪唑基、哌嗪基和吗啉-4-基；其中任何杂芳基或杂环烷基都是未取代的或被甲基取代的。
本发明优选的化合物选自4-(3-三氟甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[3-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺；4-(4-三氟甲基-1-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氨磺酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氨磺酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[5-(3-氟-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯基]-酰胺；4-羟基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(4-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-羟基甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；乙酸3-(7-{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基氨基甲酰基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基)-苄酯；吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(4-三氟甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[3-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺；4-(4-三氟甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[4-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺；4-(4-三氟甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[3-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺；4-(3-溴-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[3-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺；4-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-溴-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-甲硫基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(吡啶-3-基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-苯氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-羟基甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-丁基氨磺酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(4-氟-2-甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氯-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氟-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-间-甲苯基氨基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；乙酸3-(7-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基氨基甲酰基}-7H-环戊二烯并嘧啶-4-基氨基)-苄酯；4-(3-异丙烯基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-[3-(2-甲氧基-乙基氨基甲酰基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-[3-(1-羟基-1-甲基-乙基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[5-(3-氟-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯基]-酰胺；4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-羟基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-羟基甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-甲磺酰基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-乙酰基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-氨磺酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(4-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-甲基氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-乙酰基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-甲磺酰基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-吗啉-4-基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-吗啉-4-基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[5-(3-氟-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯基]-酰胺；4-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸(3-{[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-甲基}-苯基)-酰胺；和4-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-3-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺。
其它优选的式I化合物详述于下文实施例和表I中。
药理学和实用性本发明化合物调节蛋白质酪氨酸激酶活性并因此可用于治疗蛋白质酪氨酸激酶，特别是Abl、BCR-Abl、Bmx、CSK、TrkB、FGFR3、Fes、Lck、B-RAF、C-RAF、MKK6、SAPK2α和SAPK2β激酶对疾病的病理和/或症状起作用的疾病或病症。
Abelson酪氨酸激酶(即Abl、c-Abl)参与细胞周期的调节、细胞对基因毒应激的应答和在细胞环境中通过整联蛋白信号转导传递信息。总的来说，Abl蛋白质似乎是作为细胞组件起复合的作用，其整合来自各种胞外和胞内的信号并影响细胞周期和细胞凋亡的结果。Abelson酪氨酸激酶包括亚型衍生物如嵌合融合(癌基因蛋白)BCR-Abl(具有失调的酪氨酸激酶活性)或v-Abl。BCR-Abl是95％慢性骨髓性白血病(CML)和10％急性淋巴细胞白血病的致病关键。STI-571(Gleevec)是致癌性BCR-Abl酪氨酸激酶的抑制剂并用于治疗慢性骨髓性白血病(CML)。然而，CML发病危险期的一些患者由于BCR-Abl激酶的突变而对STI-571耐受。目前已报道了超过22种突变，最常见的是G250E、E255V、T315I、F317L和M351T。
本发明化合物抑制abl激酶，特别是v-abl激酶。本发明化合物也抑制野生型BCR-Abl激酶和突变的BCR-Abl激酶并因此适于治疗Bcr-abl-阳性癌症和肿瘤疾病，如白血病(特别是慢性骨髓性白血病和急性淋巴细胞白血病，尤其是发现它们是以细胞凋亡为作用机制的)，并且还显示出对白血病干细胞亚组的影响，而且也可能用于取出所述细胞(例如，骨髓取出)后体外纯化这些细胞并在清除癌细胞后再将细胞植入(例如，再植入纯化的骨髓细胞)。
Trk族的神经营养受体(trkA、trkB、trkC)促进神经和非神经组织的存活、生长和分化。TrkB蛋白在小肠和结肠的神经内分泌型细胞、胰腺的α细胞、淋巴结和脾的单核细胞和巨噬细胞以及表皮的颗粒层中表达(Shibayama和Koizumi，1996)。TrkB蛋白的表达与Wilms肿瘤和成神经细胞瘤的有害进展有关。此外，TkrB在癌性前列腺细胞中表达而不在正常细胞中表达。trk受体信号传递途径的下游包括通过Shc、激活的Ras、ERK-1和ERK-2基因激活MAPK的级联反应和PLC-γ传导途径(Sugimoto等人，2001)。
Tec族激酶Bmx是一种非-受体蛋白质-酪氨酸激酶，其控制哺乳动物上皮癌细胞的增殖。
成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)显示对骨生长的下调作用并且抑制软骨细胞增殖。致死性发育异常是由成纤维细胞生长因子受体3的不同突变引起的，其中一个突变体TDII FGFR3具有酪氨酸激酶结构活性，其激活转录因子Stat1，导致细胞周期抑制剂的表达、生长抑制和异常的骨发育(Su等人，Nature，1997，386，288-292)。FGFR3也常常表达在多发性骨髓瘤类型的癌症中。
Lck在T-细胞信号传递中起作用。缺乏Lck基因的小鼠具有弱的胸腺细胞发育能力。Lck作为T-细胞信号传递的正性激活剂的功能启示Lck抑制剂有可能用于治疗自身免疫疾病如类风湿性关节炎。
JNK，以及其它MAPK，在介导细胞对癌症、凝血酶诱导的血小板凝聚、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病、细胞死亡、过敏、骨质疏松和心脏病产生反应中起作用。与激活JNK途径相关的病症包括慢性骨髓性白血病(CML)、类风湿性关节炎、哮喘、骨关节炎、局部缺血、癌症和神经变性疾病。因为JNK激活会涉及肝疾病或肝脏局部缺血，本发明化合物也可用于治疗各种肝脏疾病。还报道了JNK在心血管疾病如心肌梗塞或充血性心力衰竭中的作用，已证实JNK可介导对各种形式的心脏应激的肥大性反应。已经表明JNK级联反应在T-细胞激活中也起作用，包括IL-2启动子的激活。因此，JNK抑制剂可能在改变病态免疫反应中有治疗价值。也建立了各种癌症中JNK激活所起的作用，启示了JNK抑制剂在癌症中的潜在用途。例如，结构激活JNK与HTLV-1介导的肿瘤发生相关[治癌基因13135-42(1996)]。JNK在卡波济氏肉瘤(KS)中也可能起作用。与KS增殖有关的其它细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6和TNFα的其它增殖作用也可通过JNK来介导。另外，与JNK活性相应的p210 BCR-ABL转化细胞中c-jun基因的调节作用启示JNK抑制剂可用于治疗慢性骨髓性白血病(CML)[Blood 922450-60(1998)]。
据信某些异常的增殖性疾病与raf表达有关，所以，相信异常的增殖性疾病会对raf表达的抑制产生反应。raf蛋白质异常高水平的表达也影响转化和异常的细胞增殖。也相信这些异常的增殖性疾病对raf表达的抑制有反应。例如，相信c-raf蛋白质表达与异常的细胞增殖有关，因为有人报道有60％的肺癌细胞系表达非常高水平的c-raf mRNA和蛋白质。异常增殖性疾病的其它例子是过度增殖性疾病如癌症、肿瘤、增生、肺纤维化、血管生成、牛皮癣、动脉硬化和血管中平滑肌细胞的增殖，如狭窄或血管成形术后的再狭窄。Raf作为一部分的细胞信号传递途径也影响以T-细胞增殖(T-细胞激活和生长)为特征的炎性疾病，如组织移植排斥、内毒素休克和肾小球肾炎。
应激激活的蛋白激酶(SAPK)是一族在信号传导途径倒数第二步中体现的蛋白激酶，其导致c-jun转录因子的激活和c-jun调节的基因的表达。具体来说，c-jun与基因的转录有关，所述基因与编码因基因毒性而受损的DNA修复相关的蛋白质。所以，抑制细胞中SAPK活性的活性剂可以防止DNA修复和使细胞对诱导DNA损伤或抑制DNA合成和诱导细胞凋亡或抑制细胞增殖的活性剂敏感。
分裂素-激活的蛋白激酶(MAPK)是保守信号传导途径中的成员，其激活转录因子、翻译因子和其它对各种胞外信号进行应答的靶分子。MAPK通过分裂素-激活的蛋白激酶激酶(MKK)在序列Thr-X-Tyr的双重磷酸化基元处进行磷酸化来激活。在高等真核细胞中，MAPK信号传导的生理作用与细胞活动如增殖、瘤形成、发展和分化有关。因此，通过这些途径(特别是通过MKK4和MKK6)来调节信号传导的能力可导致开发出用于治疗和预防性治疗与MAPK信号传导相关的人类疾病如炎性疾病、自身免疫疾病和癌症的方法。
Csk通过磷酸化Src酶C-末端中的单一酪氨酸残基来下调激酶活性(Okada等人，J.Biol.Chem.26624249-24252，1991；和Bergman等人，EMBO J.112919-2924，1992)。由于这种首要的调节功能，Csk对许多生物功能包括T细胞激活、神经发育、细胞骨架组织和细胞周期控制有直接影响。
与来自Fes族的非受体酪氨酸激酶活性相关的疾病的例子包括但不限于源于间叶细胞的肿瘤和源于造血细胞的肿瘤。
如上文所述，本发明还提供一种在需要进行治疗的个体中预防或治疗上文所述的任何疾病或病症方法，该方法包括给予所述个体治疗有效量的(参见“给药和药物组合物”，下文)式I化合物或其可药用盐。对于任何上述用途，所需剂量会根据给药方式、被治疗的特定疾病和所需的效果来进行调整。
给药和药物组合物通常，可通过本领域已知的任何常规和适宜的方式、单独或与一种或多种治疗剂一起给予治疗有效量的本发明化合物。治疗有效量可随着疾病的严重性、患者的年龄和相对健康状况、所用化合物的潜能和其它因素而改变。通常，以每日每公斤体重大约0.03-2.5mg的剂量系统给药可获得满意的结果。大的哺乳动物，例如人的每日推荐剂量在大约0.5mg-100mg的范围内，通常以例如每日最多4次的分剂量给药或以缓释剂型给药。适宜的口服给药单位剂型包含大约1-50mg活性组分。
本发明化合物可以通过任何常规给药途径以药物组合物的形式给药，特别是肠道给药，例如，以片剂或胶囊剂的形式口服给药，或非肠道给药，例如，以注射溶液或悬浮液的形式给药，局部给药，例如，以洗剂、凝胶剂、软膏剂或霜剂的形式给药，或以鼻腔给药制剂或栓剂的形式给药。含有游离形式或可药用盐形式的本发明化合物和至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物可按照常规方法，通过混合、制粒或包衣方法制备。例如，口服组合物可以是片剂或明胶胶囊剂，它含有活性组分和a)稀释剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如，二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂来说还可以含有c)粘合剂，例如，硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要还可以含有d)崩解剂，例如，淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐，或泡腾剂混合物；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。注射组合物可以是等渗水溶液或悬浮液，并且栓剂可以由脂肪乳剂或悬浮液制备。组合物可以被灭菌和/或含有辅助剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外，它们还可以含有其它有治疗价值的物质。适宜的透皮用制剂包含有效量的本发明化合物和载体。载体包括有助于通过宿主皮肤吸收的药理学上可接受的溶剂。例如，透皮吸收制剂是一种含有背衬膜、含有所述化合物并任选地含有载体和使所述化合物在较长的一段时间内以受控和预定速度释放到宿主皮肤的控速屏障的贮药库、以及确保所述透皮吸收制剂牢固地与皮肤接触的部件的绷带形式。也可以使用基质透皮制剂。合适的局部用，例如皮肤和眼睛用制剂优选为本领域公知的水溶液、软膏剂、霜剂或凝胶剂。所述制剂可包含增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
本发明化合物可以与一种或多种治疗剂(联用药物)一起以治疗有效量进行给药。例如，协同作用可与其它免疫调节剂或抗炎物质来产生，例如与环孢菌素、雷帕霉素或子囊霉素或其免疫抑制剂类似物，例如环孢菌素A(CsA)、环孢菌素G、FK-506、雷帕霉素或类似化合物、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、布喹那、来氟米特、咪唑立宾、麦考酚酸、吗替麦考酚酯、15-脱氧精胍菌素、免疫抑制剂抗体，特别是白细胞受体的单克隆抗体例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45、CD58或其配体，或其它免疫调节化合物，如CTLA41g一起使用时产生。当本发明化合物与其它治疗剂一同给药时，共同给药的化合物的剂量当然将根据一起使用的药物类型、所使用的特定药物、被治疗的疾病等情况来进行调整。
本发明还提供了一种联用药物产品，例如药盒，其包含a)游离形式或可药用盐形式的第一种活性剂，它是本文公开的本发明化合物，和b)至少一种联用的活性剂。该药盒可包含用于给药的使用说明。
本文使用的术语“联合用药”或“合并给药”等意指包括将所选择的治疗剂给予同一病人，并且旨在包括治疗剂不以相同途径或相同时间给药的治疗方案。
本文所使用的术语“联用药物产品”是指由一种以上活性组分混合或组合所形成的产品并且包括活性成分的固定组合和不固定组合。术语“固定组合”是指活性组分例如式I化合物和联用治疗剂以单一实体或剂型同时给予患者。术语“不固定组合”是指活性组分例如式I化合物和联用治疗剂各自作为实体同时、一起或没有具体时间限制地依次给予患者，其中所述给药可在患者身体中提供治疗有效水平的两个化合物。后者也用于鸡尾酒疗法，例如给予三种或三种以上的活性组分。
制备本发明化合物的方法本发明还包括制备本发明化合物的方法。在所描述的反应中，可能有必要保护在终产物中需要的反应性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、巯基或羧基，以避免它们不必要地参与反应。可按照标准实践使用常规的保护基，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts“有机化学中的保护基”，John Wiley和Sons，1999，第3版。
其中R1为-NR6R7的式I化合物可按照如下反应方案I所述进行制备
反应方案I 其中R1、R2、R3、R4、W、Y、Z、m和n如发明概述中关于式I所定义并且V表示甲基磺酰基或卤素基团，例如碘或氯，优选氯。
式I化合物可通过将式2化合物与式3化合物在适宜溶剂(例如，正丁醇、乙酸等)的存在下，在60-80℃的温度范围内反应来制备，并且可持续反应36小时直至反应结束。
其中Y为碳的式I化合物可按照如下反应方案II所述进行制备
反应方案II 其中R1、R2、R3、R4、W、Z、m和n如发明概述中关于式I所定义并且L为离去基团。
式I化合物可通过将式4化合物与式5化合物在适宜溶剂(例如THF等)的存在下，利用三光气或光气和适宜的碱(例如DIEA等)，在0℃至大约90C的温度范围进行反应来制备，并且可持续反应24小时直至反应结束。
在下文的参考例和实施例中举例说明了反应方案I和II。
制备本发明化合物的其它方法本发明化合物的可药用酸加成盐可通过将游离碱形式的化合物与可药用无机或有机酸反应来制备。或者，本发明化合物的可药用碱加成盐可通过将游离酸形式的化合物与可药用无机或有机碱反应制备。或者，盐形式的本发明化合物可利用起始材料或中间体的盐制备。
游离酸或游离碱形式的本发明化合物可分别由相应的碱加成盐或酸加成盐制备，例如酸加成盐形式的本发明化合物可通过用适宜的碱(例如，氢氧化铵溶液、氢氧化钠等)处理转化为相应的游离碱。碱加成盐形式的本发明化合物可通过用适宜的酸(例如，盐酸等)处理转化为相应的游离酸。
非氧化形式的本发明化合物可通过在适宜的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、二烷水溶液等)中，在0-80℃下，用还原剂(例如，硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氢化锂、硼氢化钠等)处理由本发明化合物的N-氧化物制备。
本发明化合物的前药衍生物可通过本领域普通技术人员已知的方法(例如，详情见Saulnier等人(1994)，Bioorganic and Medicinal ChemistryLetters，第4卷，第1985页)制备。例如，适宜的前药可通过将非衍生化的本发明化合物与适宜的氨基甲酰化试剂(例如，1，1-酰氧基烷基羰基氯(carbanochloridate)、对硝基苯基碳酸酯等)反应来制备。
本发明化合物的被保护衍生物可通过本领与普通技术人员已知的方法制备。用于产生保护基及其脱除的技术的详细描述可见于T.W.Greene，“有机化学中的保护基”，第3版，John Wiley和Sons，Inc.，1999。
在本发明化合物的制备过程中，可方便地制备或形成本发明化合物的溶剂化物(例如水合物)。本发明化合物的水合物可通过在水/有机溶剂混合物中重结晶，利用有机溶剂如二恶英、四氢呋喃或甲醇方便地制备。
本发明化合物单独的立体异构体可通过将化合物的外消旋混合物与旋光拆分剂反应形成一对非对映异构体化合物、分离非对映异构体并重新获得光学纯对映异构体来制备。此外，对映异构体还可通过用手性制备HPLC分离或利用对映体纯试剂得到。尽管对映异构体的拆分可利用本发明化合物的共价非对映异构体衍生物来进行，但可解离的复合物(例如，非对映异构体盐晶体)是优选的。非对映异构体具有不同的物理性质(例如，熔点、沸点、溶解度、反应性等)并且可以很容易地利用这些差异进行分离。非对映异构体可以通过色谱法分离，或者优选通过建立在溶解度不同基础上的分离/拆分技术进行分离。然后通过任何不会导致消旋化的实用方法重新获得光学纯的对映异构体和拆分剂。用于通过外消旋混合物拆分化合物的立体异构体的技术的更详细描述可见于Jean Jacques，Andre Collet，SamuelH.Wilen，“对映异构体、外消旋体和拆分”，John Wiley和Sons，Inc.，1981。
总之，式I化合物可通过下述方法制备，该方法包括(a)反应方案I和II中的那些方法；和(b)任选地将本发明化合物转化为可药用盐；(c)任选地将盐形式的本发明化合物转化为非盐形式；(d)任选地将非氧化形式的本发明化合物转化为可药用N-氧化物；(e)任选地将N-氧化物形式的本发明化合物转化为其非氧化物形式；(f)任选地将异构体混合物拆分为本发明化合物的独立的异构体；(g)任选地将非衍化的本发明化合物转化为可药用前药衍生物；和(h)任选地将本发明化合物的前药衍生物转化为其非衍化形式。
当本文中未对起始材料的制备进行具体描述时，则所述化合物是已知的或者可通过本领域已知的类似方法或如下文实施例所述进行制备。
本领域技术人员可以理解上述转化仅仅是制备本发明化合物方法的代表，并可类似地使用其他公知的方法。
实施例下列实施例提供了制备中间体(参考例)和代表性的本发明化合物(实施例)的详细描述，提供这些实施例的目的在于举例说明而非限制本发明。
参考例14-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[4-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺树脂 将带有4-吗啉基苯胺(1g，1mmol)的PAL-树脂(Midwest Bio-Tech)、DIEA(1.04mL，6mmol)和硝基苯甲酰氯(3mmol)在CH2Cl2(10mL)中混合并将溶液在室温下振摇16小时。过滤所得到的混合物，将树脂用DMF(3×10mL)、CH2Cl2(3×10mL)、MeOH(3×10mL)洗涤并真空干燥。树脂(10mg)用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(200μL)处理30分钟。LC-MS仅显示一个峰实测MS(M+H+)为328.1；计算MS(M+H+)为328.12。
将所得到的树脂与SnCl2·2H2O(2.26g，10mmol)在NMP(10mL)中混合并振摇48小时。将溶液过滤，树脂用NMP(3×10mL)、CH2Cl2(3×10mL)、MeOH(3×10mL)洗涤并真空干燥得到固体-承载的4-氨基-N-(4-吗啉-4-基-苯基)-苯甲酰胺。该树脂(10mg)用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(200μL)处理30分钟。LC-MS仅显示一个峰实测MS(M+H+)为298.1；计算MS(M+H+)为298.15。
将6-氯-7-脱氮嘌呤(300mg，2mmol)、三光气(290mg，1mmol)和DIEA(680μL，3.9mmol)在THF(10mL)中在0℃下搅拌2小时。THF通过蒸发除去，残余物溶解在THF(10mL)中。将溶液与4-氨基-N-(4-吗啉-4-基-苯基)-苯甲酰胺树脂混合并摇动18小时。将溶液过滤，树脂用DMF(3×10mL)、CH2Cl2(3×10mL)、MeOH(3×10mL)洗涤并真空干燥，得到4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸-4-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺树脂。将10mg树脂进一步用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(200μL)处理30分钟。LC-MS仅显示一个峰实测MS(M+H+)为477.10；计算MS(M+H+)为477.14。4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸甲基-[4-(3-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺树脂和4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[3-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺可按照类似的方法，利用适宜的起始材料制备。
参考例24-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺树脂 将4-甲基-3-硝基-苯胺PAL-树脂(5g，5mmol)、DIEA(5.34mL，20mmol)和4-(氯甲基)-苯甲酰氯(1.89g，10mmol)在CH2Cl2(50mL)中混合并在室温下振摇18小时。将溶液过滤，树脂用DMF(3×50mL)、CH2Cl2(3×50mL)、MeOH(3×50mL)洗涤然后真空干燥。该树脂(10mg)用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(200μL)处理30分钟。LC-MS显示一个主峰实测MS(M+H+)为305.0；计算MS(M+H+)为304.06。
将树脂与1-甲基哌嗪(5.56mL，49.2mmol)在DMSO(50mL)中混合并在过滤前振摇过夜，用DMF(3×50mL)、CH2Cl2(3×50mL)、MeOH(3×50mL)洗涤并真空干燥。该树脂(10mg)用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(200μL)处理30分钟。LC-MS仅显示一个峰实测MS(M+H+)为369.2；计算MS(M+H+)为369.18。
所得到的树脂与SnCl2·2H2O(11.3g，50mmol)在NMP(50mL)中混合，并振摇48小时。将溶液过滤，树脂用NMP(3×50mL)、CH2Cl2(3×50mL)、MeOH(3×50mL)洗涤并真空干燥，得到固体-承载的N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-N-甲基-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺。该树脂(10mg)用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(200μL)处理30分钟。LC-MS仅显示一个峰实测MS(M+H+)为339.2；计算MS(M+H+)为339.21。
将6-氯-7-脱氮嘌呤(1.50g，10mmol)、三光气(1.45g，5mmol)和DIEA(3.4mL，19.5mmol)在THF(50mL)中，在0℃下搅拌3小时。通过蒸发除去THF后，残余物溶解在THF(50mL)中，将溶液与N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-N-甲基-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺树脂混合并摇动18小时。将溶液过滤，树脂用DMF(3×50mL)、CH2Cl2(3×50mL)、MeOH(3×50mL)洗涤并真空干燥，得到4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺树脂。该树脂(10mg)用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(200μL)处理30分钟。LC-MS实测MS(M+H+)为518.20；计算MS(M+H+)为518.2。
参考例34-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺树脂
将PAL-树脂4-甲基-3-硝基-苯胺(5g，5mmol)、双(2-氧代-3-唑烷基)次膦酰氯(5.09g，20mmol)、DIEA(3.5mL，20mmol)和3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酸(2.71g，10.0mmol)在DMF(50mL)中混合并在室温下振摇18小时。过滤所得到的混合物，树脂用DMF(3×50mL)、CH2Cl2(3×50mL)、MeOH(3×50mL)洗涤并真空干燥。将10mg该树脂用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(200μL)处理30分钟。LC-MS仅显示一个峰实测MS(M+H+)为405.1；计算MS(M+H+)为405.11。
所得到的树脂与SnCl2·2H2O(11.3g，50mmol)在NMP(50mL)中混合并在室温下振摇48小时。将溶液过滤，树脂用NMP(3×50mL)、CH2Cl2(3×50mL)、MeOH(3×50mL)洗涤并真空干燥，得到N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰胺树脂。该树脂(10mg)用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(200μL)处理30分钟。LC-MS仅显示一个峰实测MS(M+H+)为375.1；计算MS(M+H+)为375.14。
将6-氯-7-脱氮嘌呤(1.50g，10.0mmol)、三光气(1.45g，5.00mmol)和DIEA(3.4mL，20mmol)在THF(50mL)中，在0℃下搅拌3小时。通过蒸发除去THF后，残余物溶解在THF(50mL)中，溶液与Pal N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰胺树脂混合(5g，5mmol)，并在室温下振摇18小时。将溶液过滤，树脂用DMF(3×50mL)、CH2Cl2(3×50mL)、MeOH(3×50mL)洗涤并真空干燥，得到4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺树脂。该树脂(10mg)用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(200μL)处理30分钟。LC-MS仅显示一个峰实测MS(M+H+)为554.1；计算MS(M+H+)为554.12。
参考例4参考例3的溶液相合成通过将3-硝基-4-甲基苯胺(3.00g，11.1mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(5.49g，14.4mmol)、DIEA(5.00mL，28.8mmol)和3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟-甲基-苯甲酸(2.02g，13.3mmol)在DMF(15mL)中混合并在室温下搅拌12小时获得。将水(150mL)加到溶液中，过滤出淡黄色的沉淀物，用水洗涤并真空干燥，得到4.3g产物(收率97％)。LC-MS仅显示一个峰实测MS(M+H+)为405.1；计算MS(M+H+)为405.11。
在H2下，将淡黄色的固体与10-wt％ Pd/C(600mg)一起在MeOH(50mL)中搅拌。24小时后，过滤悬浮液，Pd/C用MeOH(3×50mL)洗涤。浓缩合并的MeOH溶液并真空干燥，得到N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰胺(3.5g，收率84％)。LC-MS仅显示一个峰实测MS(M+H+)为375.1；计算MS(M+H+)为375.14。
将6-氯-7-脱氮嘌呤(3.9g，25.5mmol)、三光气(3.80g，12.8mmol)和DIEA(8.9mL，51mmol)在THF(100mL)中，在0℃下搅拌3小时。通过蒸发除去THF，残余物溶解在THF(100mL)中。将溶液与N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰胺(3.5g，9.3mmol)混合并在室温下振摇18小时。蒸发溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化(2％MeOH/CH2Cl2)，得到4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基}-苯基}-酰胺(3.4g，收率65％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.07(s，1H)，10.71(s，1H)，9.62(s，1H)，8.99(s，1H)，8.62(s，1H)，8.55(s，1H)，8.46(d，J＝4.0Hz，1H)，8.24(d，J＝4.0Hz，1H)，8.18(s，1H)，7.62(d，J＝8.0Hz，1H)，7.35(d，J＝8.0Hz，1H)，6.96(d，J＝4.0Hz，1H)，2.47(s，3H)，2.37(s，3H)；ESIMS m/z 554.1(M++1)。
实施例14-(3-三氟甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[3-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺
将如参考例1所述制备的4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[3-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺树脂(50mg，0.05mmol)在正丁醇(2mL)中与乙酰氯(17.8μL，0.25mmol)和3-三氟甲基-苯胺(31μL，0.25mmol)混合或仅与3-三氟甲基-苯胺HCl盐(50mg，0.25mmol)混合，并在80℃下振摇24小时。过滤所得到的混合物，将树脂用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(600μL)处理30分钟然后过滤并用CH2Cl2(3×2mL)、MeOH(3×2mL)洗涤。然后将洗涤液合并在一起并浓缩。残余物通过制备HPLC纯化，得到4-(3-三氟甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[3-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺(19.0mg，收率64％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.75(s，1H)，10.16(s，1H)，10.09(s，1H)，8.69(s，1H)，8.31(s，1H)，8.22(d，J＝8.3Hz，1H)，8.15(s，1H)，7.94(d，J＝8.2Hz，1H)，7.92(d，J＝3.9Hz，1H)，7.77(d，J＝7.7Hz，1H)，7.64(d，J＝8.8Hz，2H)，7.63(d，J＝6.9Hz，1H)，7.58(t，J＝8.0Hz，1H)，7.44(d，J＝7.7Hz，1H)，7.13(d，J＝4.0Hz，1H)，6.95(d，J＝9.0Hz，2H)，3.74(t，J＝4.6Hz，4H)，3.08(t，J＝4.7Hz，4H)；ESIMS m/z 602.20(M++1)。
实施例24-(4-三氟甲基-1-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺 将如参考例2所述制备的4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺树脂(50mg，0.05mmol)在正丁醇(2mL)中与乙酰氯(17.8μL，0.25mmol)和4-(三氟甲基)苯胺(31μL，0.25mmol)混合，或仅与4-三氟甲基-苯胺盐酸盐(49.4mg，0.25mmol)混合并在80℃下振摇24小时。过滤所得到的混合物，将树脂用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(600μL)处理30分钟然后过滤并用CH2Cl2(3×2mL)、MeOH(3×2mL)洗涤。然后将洗涤液合并在一起并浓缩。残余物通过制备HPLC纯化，得到4-(4-三氟甲基-1-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺(18.6mg，收率58％)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.47(s，1H)，10.34(s，1H)，10.16(s，1H)，8.67(s，1H)，8.54(s，1H)，8.15(d，J＝8.5Hz，2H)，8.03(d，J＝8.0Hz，2H)，7.93(d，J＝3.9Hz，1H)，7.76(d，J＝8.6Hz，2H)，7.59(d，J＝8.0Hz，1H)，7.56(d，J＝8.0Hz，2H)，7.30(d，J＝8.0Hz，1H)，7.17(d，J＝3.9Hz，1H)，4.01(s，2H)，3.80-3.20(m，8H)，2.83(s，3H)，2.46(s，3H)；ESIMS m/z 643.20(M++1)。
实施例34-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺 将如参考例3所述制备的4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺树脂(50mg，0.05mmol)在正丁醇(2mL)中与N，N-二甲基-1，3-苯二胺二盐酸盐(52.3mg，0.25mmol)混合或与乙酰氯(17.8μL，0.25mmol)和苯胺混合并在80℃下振摇24小时。过滤所得到的混合物，树脂用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(600μL)处理30分钟然后过滤并用CH2Cl2(3×2mL)、MeOH(3×2mL)洗涤。然后将洗涤液合并在一起并浓缩。残余物通过制备HPLC-MS纯化，得到4-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺(23.2mg，收率71％)；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.60(s，1H)，10.65(s，1H)，9.68(s，1H)，9.61(s，1H)，8.60(s，1H)，8.54(s，1H)，8.53(s，1H)，8.46(s，1H)，8.41(s，1H)，8.16(s，1H)，7.82(d，J＝3.9Hz，1H)，7.60(d，J＝8.2Hz，1H)，7.32(d，J＝3.6Hz，1H)，6.54(d，J＝8.4Hz，1H)，2.92(s，6H)，2.45(s，3H)，2.35(s，3H)；ESIMSm/z654.2(M++1)。
实施例44-(3-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺 将如参考例2所述制备的4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺树脂(50mg，0.05mmol)在正丁醇(2mL)中与乙酰氯(17.8μL，0.25mmol)和3-氨基苯甲酰胺(34mg，0.25mmol)混合并在80C下振摇24小时。过滤所得到的混合物，树脂用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(600μL)处理30分钟然后过滤并用CH2Cl2(3×2mL)、MeOH(3×2mL)洗涤。然后将洗涤液合并在一起并浓缩。残余物通过制备HPLC-MS纯化，得到4-(3-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺(18.5mg，收率60％)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.52(s，1H)，10.31(s，1H)，9.99(s，1H)，8.60(s，1H)，8.52(d，J＝1.71Hz，1H)，8.23(s，1H)，8.12(d，J＝7.59Hz，1H)，8.00(s，1H)，7.98(d，J＝8.02Hz，2H)，7.87(d，J＝3.89Hz，1H)，7.59(dd，J＝17.87，9.00Hz，2H)，7.49(d，J＝7.98Hz，2H)，7.47(s，1H)，7.38(s，1H)，7.29(d，J＝8.48Hz，1H)，7.11(d，J＝3.89Hz，1H)，3.75(s，2H)，3.43-2.79(m，8H)，2.50(s，3H)，2.49(s，3H)；ESIMS m/z 618.20(M++1)。
实施例54-(3-氨磺酰基-苯基氨基)-吡咯并[23-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺
将如参考例2所述制备的4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺树脂(50mg，0.05mmol)在正丁醇(2mL)中与乙酰氯(17.8μL，0.25mmol)和3-氨基苯磺酰胺(43mg，0.25mmol)混合并在80C下振摇24小时。过滤所得到的混合物，树脂用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(600μL)处理30分钟然后过滤并用CH2Cl2(3×2mL)、MeOH(3×2mL)洗涤。然后将洗涤液与正丁醇合并在一起并浓缩。残余物通过制备HPLC-MS纯化，得到4-(3-氨磺酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺(18.0mg，收率55％)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.45(s，1H)，10.27(s，1H)，10.09(s，1H)，8.59(s，1H)，8.49(s，1H)，8.29(s，1H)，8.17(d，J＝7.95Hz，1H)，7.95(d，J＝7.94Hz，2H)，7.87(d，J＝3.85Hz，1H)，7.54(dd，J＝7.61，15.51Hz，2H)，7.52(s，1H)，7.45(d，J＝7.88Hz，2H)，7.37(s，2H)，7.25(d，J＝8.30Hz，1H)，7.11(d，J＝3.88Hz，1H)，3.69(s，2H)，3.54-3.17(m，2H)，3.01-2.93(m，6H)，2.75(s，3H)，2.41(s，3H)；ESIMS m/z 654.20(M++1)。
实施例64-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺 将如参考例3所述制备的4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺树脂(50mg，0.05mmol)在正丁醇(2mL)中与乙酰氯(17.8μL，0.25mmol)和3-(1-羟基乙基)苯胺(34mg，0.25mmol)混合并在80℃下振摇24小时。过滤所得到的混合物，树脂用TFA/CH2Cl2/H2O(45/50/5)(600μL)处理30分钟然后过滤并用CH2Cl2(3×2mL)、MeOH(3×2mL)洗涤。然后将洗涤液与正丁醇合并在一起并浓缩。残余物通过制备HPLC-MS纯化，得到4-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺(16.6mg，收率51％)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.60(s，1H)，10.68(s，1H)，9.85(s，1H)，9.62(s，1H)，8.62(s，1H)，8.57(s，1H)，8.54(s，1H)，8.47(s，1H)，8.43(s，1H)，8.17(s，1H)，7.85(d，J＝4.1Hz，2H)，7.70(s，1H)，7.61(dd，J＝6.5，8.2Hz，1H)，7.35(d，J＝2.3Hz，1H)，7.33(t，J＝7.8Hz，1H)，7.09(s，1H)，7.08(d，J＝6.8Hz，1H)，4.75(q，J＝6.4Hz，1H)，2.47(s，3H)，2.36(s，3H)，1.36(d，J＝6.4Hz，3H)；ESIMS m/z655.2(M++1)。
实施例74-(3-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺 将如参考例3所述制备的4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺(50mg，0.09mmol)在冰乙酸(2mL)中与3-氨基苯甲酰胺(24.5mg，0.18mmol)混合并在80℃下振摇24小时。所得到的混合物直接通过制备HPLC-MS纯化，得到4-(3-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺(42.9mg，收率73％)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.54(s，1H)，10.65(s，1H)，9.96(s，1H)，9.68(s，1H)，8.59(d，J＝13.1Hz，1H)，8.51(s，1H)，8.50(s，1H)，8.45(s，1H)，8.41(s，1H)，8.19(d，J＝10.1Hz，2H)，8.09(d，J＝7.9Hz，1H)，7.94(s，1H)，7.83(d，J＝3.9Hz，1H)，7.58(d，J＝8.2Hz，1H)，7.57(d，J＝4.7Hz，1H)，7.43(t，J＝7.9Hz，1H)，7.35(s，1H)，7.30(d，J＝8.5Hz，1H)，7.08(d，J＝3.9Hz，1H)，2.43(s，3H)，2.34(s，3H)；ESIMS m/z 654.1(M++1)。
实施例84-(3-氨磺酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺 将如参考例3所述制备的4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺(50mg，0.09mmol)在冰乙酸(2mL)中与3-氨基苯磺酰胺(31mg，0.18mmol)混合并在80C下振摇24小时。所得到的混合物直接通过制备HPLC-MS纯化，得到4-(3-氨磺酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺(35.3mg，收率57％)；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.51(s，1H)，10.64(s，1H)，10.10(s，1H)，9.58(s，1H)，8.60(s，1H)，8.51(s，1H)，8.50(s，1H)，8.29(s，1H)，8.17(d，J＝8.1Hz，2H)，8.14(s，1H)，7.87(d，J＝3.9Hz，1H)，7.59(d，J＝1.8Hz，1H)，7.57(d，J＝7.6Hz，1H)，7.53(d，J＝5.9Hz，1H)，7.37(s，2H)，7.30(d，J＝8.5Hz，1H)，7.11(d，J＝3.9Hz，1H)，2.44(s，3H)，2.33(s，3H)；ESIMS m/z 690.1(M++1)。
通过重复上述实施例中描述的方法，利用适宜的起始材料，得到如表1所述的下列式I化合物。
表1
活性测定测定了与母本32D细胞相比本发明化合物选择性抑制表达BCR-Abl的32D细胞(32D-p210)的细胞增殖的能力。测试选择性抑制这些BCR-Abl转化的细胞增殖的化合物对于表达野生型或突变型BCR-Abl的Ba/F3细胞的抗增殖活性。另外还测定了化合物抑制B-RAF的能力。
抑制细胞BCR-Abl依赖性增殖(高通量方法)所使用的鼠科细胞系是用BCR-Abl cDNA转化的32D造血祖细胞系(32D-p210)。这些细胞保持在补充有青霉素50μg/mL、链霉素50μg/mL和L-谷氨酸200mM的RPMI/10％胎牛血清(RPMI/FCS)中。未转化的32D细胞保持在类似条件下并加有15％WEHI条件培养基作为IL3源。
将50μl 32D或32D-p210细胞悬浮液以每孔5000个细胞的密度涂覆到Greiner 384孔微孔板(黑色)中。在每个孔中加入50nL的试验化合物(1mM，在DMSO储备溶液中)(STI571作为阳性对照)。在37℃、5％CO2下将细胞培养72小时。在各孔中加入10μL 60％的Alamar Blue溶液(Tek诊断剂)并将细胞再培养24小时。使用AcquestTM系统(Molecular Devices)测定荧光密度(530nm处激发，580nm处发射)。
抑制细胞BCR-Abl依赖性增殖将32D-p210细胞以每孔15000个细胞的密度涂覆到96孔TC板中。向各孔中加入50μL试验化合物的两倍系列稀释液(Cmax为40μM)(STI571作为阳性对照)。将细胞在37℃、5％CO2下培养48小时后，向各孔中加入15μL的MTT(Promega)并将细胞再培养5小时。通过分光光度法测定570nm处的光密度并通过量效曲线确定50％抑制作用所需的化合物的浓度，即IC50值。
对细胞周期分布的影响将32D和32D-p210细胞以每孔2.5×106个细胞并存在于5mL培养基中的形式加入6孔TC板中并以1或10μM的浓度加入试验化合物(STI571作为对照)。然后，在37℃、5％CO2下培养细胞24或48小时。用PBS洗涤2ml细胞悬浮液，在70％EtOH中固定1小时并用PBS/EDTA/RNase A处理30分钟。加入碘化丙锭(Propidium iodide Cf＝10μg/ml)并在FACScaliburTM系统(BD Biosciences)上通过流式细胞仪测定荧光强度。本发明试验化合物显示对32D-p210细胞具有细胞凋亡作用但不诱导32D母本细胞凋亡。
对细胞BCR-Abl自磷酸化的作用使用c-abl特异性捕获抗体和抗磷酸酪氨酸抗体用捕获Elisa测定BCR-Abl的自磷酸化作用。将32D-p210细胞以每孔2×105个细胞并存在于50μL培养基中的形式加入96孔TC板中。每孔加入50μL试验化合物的两倍系列稀释液(Cmax为10μM，STI571作为阳性对照)。在37℃、5％CO2下培养细胞90分钟。然后，细胞在冰上用150μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的溶胞缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，5mM EDTA，1mM EGTA和1％NP-40)处理1小时。将50μL细胞溶解产物加到96孔光学板中，该板事先用抗-abl特异性抗体涂覆并封闭。在4℃下培养该板4小时。用TBS-吐温20缓冲液洗涤后，加入50μL碱性磷酸酶结合的抗-磷酸酪氨酸抗体并将该板在4℃下培养过夜。用TBS-吐温20缓冲液洗涤后，加入90μL发光底物并用AcquestTM系统(Molecular Devices)定量测定发光情况。所测试的本发明化合物以剂量依赖性方式抑制表达BCR-Abl的细胞的增殖并抑制细胞BCR-Abl的自磷酸化。
对表达突变型BCR-Abl的细胞增殖的影响测试本发明化合物对表达野生型或突变型BCR-Abl的Ba/F3细胞(G250E、E255V、T315I、F317L、M351T)的抗增殖作用，这些细胞对STI571耐受或对其敏感性降低。以10、3.3、1.1和0.37μM的浓度如上所述(培养基中不含IL3)测试这些化合物对表达突变型-BCR-Abl的细胞和未转化的细胞的抗增殖作用。由如上所述获得的量效曲线确定对未转化的细胞没有毒性的化合物的IC50值。
B-RAF测试本发明化合物抑制B-RAF活性的能力。在黑色壁和透明底的384孔MaxiSorp板(NUNC)中进行测定。在DPBS中稀释底物IκBα(1∶750)并在各孔中加入15μL。在4℃下将板培养过夜并在EMBLA板洗涤器上用TBST(25mM Tris，pH8.0，150mM NaCl和0.05％吐温-20)洗涤3次。在室温下，将板用Superblock(15μL/孔)封闭3小时，用TBST洗涤3次并适当干燥(pat-dried)。将含有20μM ATP(10μL)的测定缓冲液加到各孔中，然后加入100nL或500nL化合物。将B-RAF在测定缓冲液中稀释(1μL稀释至25μl)中并将10μl稀释的B-RAF加到各孔中(0.4μg/孔)。在室温下将该板培养2.5小时。通过用TBST洗涤该板6次来终止激酶反应。在Superblock中稀释Phosph-IκBα(Ser32/36)抗体(1∶10,000)并将15μL加到各孔中。将板在4℃下培养过夜并用TBST洗涤6次。在Superblock中稀释AP-结合的山羊-抗-小鼠IgG(1∶1,500)并将15μL加到各孔中。在室温下培养该板1小时并用TBST洗涤6次。在各孔中加入15μL Attophos AP底物并在室温下培养15分钟。使用荧光强度Nanxin BBT阴离子(505二色性镜)在Acquest或Analyst GT上读板。
Upstate Kinase ProfilerTM-放射-酶学过滤器结合测定法评价本发明化合物抑制各种激酶(激酶的部分非限定性例子包括BMX、CSK、TrkB、FGFR3、Fes、Lck、B-RAF、C-RAF、MKK6、SAPK2α和SAPK2β)的能力。按照常规方法以10μM的最终浓度一式两份地测试化合物。需要注意的是激酶缓冲液组合物和底物随“Upstate KinaseProfilerTM”中激酶的不同而进行变化。在置于冰上的eppendorf中混合激酶缓冲液(2.5μL，10倍浓度，需要时含有MnCl2)、活性激酶(0.001-0.01单位；2.5μL)、存在于激酶缓冲液中的特异性或多聚(Glu4-Tyr)肽(5-500μM或0.01mg/ml)以及激酶缓冲液(50μM；5μl)。加入Mg/ATP混合物(10μL；67.5(或33.75)mM MgCl2、450(或225)μM ATP和1μCi/μl[γ-32P]-ATP(3000Ci/mmol))并在约30℃下将反应产物保温约10分钟。将反应混合物(20μl)点在2cm×2cm P81(磷酸纤维素，用于带正电的肽底物)或Whatman No.1(用于多聚(Glu4-Tyr)肽底物)方形纸上。用0.75％磷酸洗涤该方形纸4次，每次5分钟，然后用丙酮洗涤一次，洗涤5分钟。将该方形纸转移到闪烁管中，加入5ml闪烁混合液并用Beckman闪烁计数器测定掺入肽底物中的32P(cpm)。计算每个反应的抑制百分数。
游离形式或可药用盐形式的式I化合物显示出有价值的药理特性，例如，如本申请体外试验所示。例如，式I化合物对野生型BCR-Abl以及G250E、E255V、T315I、F317L和M351T BCR-Abl突变型优选显示1×10-10到1×10-5M的IC50，优选小于100nM。
例如4-(3-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺(实施例7)对野生型、G250E、E255V、T315I、F317L和M351T BCR-Abl的IC50分别为5nM、47nM、31nM、115nM、9nM和5nM。10μM浓度时，化合物对Abl、BCR-Abl、Bmx、CSK、TrkB、FGFR3、Fes、Lck、B-RAF、C-RAF、MKK6、SAPK2α和SAPK2β激酶的抑制活性大于50％，优选大于75％。例如，4-(3-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺(实施例7)显示的抑制百分数为Bmx(100％)、c-Raf(99％)、CSK(100％)、Fes(98％)、FGFR3(95％)、Lck(96％)、MKK6(98％)、SAPK2α(100％)、SAPK2β(100％)和TrkB(98％)；4-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺(实施例3)对野生型、G250E、E255V、T315I、F317L和M351TBCR-Abl的IC50分别为22nM、170nM、220nM、370nM、50nM和29nM。化合物对B-Raf的IC50为32nM。10μM浓度时，化合物显示的抑制百分数为Bmx(100％)、c-Raf(83％)、CSK(90％)、Fes(82％)、Lck(95％)、SAPK2β(95％)和TrkB(100％)。
可以理解的是，本文所述的实施例和具体实施方式
仅仅是出于举例说明的目的，本领域技术人员可以据此进行各种修饰或改变，并且这些修饰和改变均包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的保护范围之内。本文中引证的所有公开出版物、专利和专利申请的全部内容均引入本文作为参考。
权利要求
1.式I化合物及其可药用盐、水合物、溶剂化物和异构体 其中W选自CH和N；Y选自C、S和S(O)；Z是二价基团，选自-Y(O)NR5-和-NR5Y(O)-；其中Y选自C、S和S(O)；并且R5选自氢和C1-12烷基；R1选自氢、卤素、羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基和-NR6R7；其中R6选自氢和C1-6烷基；R7选自C6-10芳基、C5-10杂芳基、C3-12环烷基和C3-8杂环烷基；或者R6和R7与R6和R7共同连接的氮一起形成C3-8杂环烷基或C5-10杂芳基；其中R7或R6和R7组合基团中的任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基均可以是未取代的或被1-3个选自下列的基团所取代卤素、氰基、硝基、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、卤素取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-6烷氧基、-XNR8R8、-XC(O)NR8R8、-XC(O)NR8XOR8、-XS(O)0-2NR8R8、-XS(O)0-2R8、-XNR8S(O)0-2R8、-XNR8C(O)R8、-XNR8SR8、-XP(O)NR8R8、-XCR8(OR8)R8、-XOC(O)R8、-XOR8和-XOR9；其中X是键或C1-12亚烷基，R8独立地选自氢和C1-6烷基，R9选自C6-10芳基和C5-10杂芳基；R2选自氢和C1-6烷基；R3选自氢、羟基、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、巯基、卤素、硝基和氰基；n为0、1或2；R4选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、C1-6烷基、卤素取代的C1-6烷基、C1-12烷氧基、卤素取代的C1-12烷氧基和-XR10；其中X为键或C1-6亚烷基，R10选自C6-10芳基、C5-10杂芳基、C3-12环烷基和C3-8杂环烷基；其中R10中的任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基均是未取代的或被选自下列的基团所取代卤素、羟基、氰基、硝基、C1-6烷基、卤素取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基和卤素取代的C1-6烷氧基；m为1、2或3；并且其中苯环A和B可独立地具有最多4个由-N＝替代的-C＝基。
2.权利要求1的化合物，其中W是N；Y是C；Z为选自-C(O)NR5-和-NR5C(O)-的二价基团；R5选自氢和C1-6烷基；R1选自氢、卤素、羟基和-NR6R7；其中R6选自氢和C1-6烷基；R7选自C6-10芳基和C5-10杂芳基；或者R6和R7与R6和R7共同连接的氮一起形成C3-8杂环烷基；其中R7或R6和R7组合基团中的任何芳基、杂芳基或杂环烷基均可以是未取代的或被1-3个选自下列的基团所取代卤素、氰基、C1-6烷基、C2-6链烯基、卤素取代的C1-6烷基、卤素取代的C1-6烷氧基、-XNR8R8、-XC(O)NR8R8、-XC(O)NR8XOR8、-XS(O)2NR8R8、-XSR8、-XNR8S(O)2R8、-XNR8C(O)R8、-XOC(O)R8、-XOR8和-XOR9；其中X是键或C1-6亚烷基，R8为氢或C1-6烷基，R9为C6-10芳基；R2为氢或C1-6烷基；R3为C1-6烷基；n为1；并且R4选自卤素、卤素取代的C1-6-烷基和-XR10；其中X为键或C1-6亚烷基，R10选自C5-10杂芳基和C3-8杂环烷基；其中R10中的任何杂芳基或杂环烷基均是未取代的或被C1-6烷基取代的；并且m为1、2或3。
3.权利要求2的化合物，其中Z为选自-C(O)NH-和-NHC(O)-的二价基团。
4.权利要求2的化合物，其中R1选自氢、卤素、羟基和-NHR7；其中R7选自苯基和吡啶基；或者R6和R7与R6和R7共同连接的氮一起形成吗啉-4-基；其中R7或R6和R7组合基团中的任何芳基、杂芳基或杂环烷基均可以是未取代的或被1-3个选自下列的基团所取代卤素、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、二甲基氨基、氨基、氨基羰基、甲基-氨基羰基、氨基磺酰基、1-羟基-乙基、羟基甲基、乙酰氧基-甲基、甲硫基、苯氧基、甲基-羧基-甲基、丁基-氨基-磺酰基、甲基、异丙烯基、甲氧基-乙基-氨基-羰基、1-羟基-1-甲基-乙基、甲基磺酰基-氨基和甲基-羰基-氨基；并且R3为氢或甲基。
5.权利要求2的化合物，其中R4选自卤素、三氟甲基和-XR10；其中X为键或亚甲基；R10选自咪唑基、哌嗪基和吗啉-4-基；其中任何杂芳基或杂环烷基均是未取代的或被甲基取代的。
6.权利要求1的化合物，选自4-(3-三氟甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[3-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺；4-(4-三氟甲基-1-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氨磺酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氨磺酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[5-(3-氟-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯基]-酰胺；4-羟基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(4-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-羟基甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；乙酸3-(7-{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基氨基甲酰基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基)-苄酯；吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(4-三氟甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[3-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺；4-(4-三氟甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[4-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺；4-(4-三氟甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[3-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺；4-(3-溴-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[3-(4-吗啉-4-基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺；4-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-溴-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-甲硫基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(吡啶-3-基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-苯氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-羟基甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-丁基氨磺酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(4-氟-2-甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氯-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氟-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-间-甲苯基氨基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-氰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；乙酸3-(7-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基氨基]-苯基氨基甲酰基}-7H-环戊二烯并嘧啶-4-基氨基)-苄酯；4-(3-异丙烯基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-[3-(2-甲氧基-乙基氨基甲酰基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-[3-(1-羟基-1-甲基-乙基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[5-(3-氟-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯基]-酰胺；4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-羟基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-羟基甲基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-甲磺酰基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-乙酰基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-氨磺酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(4-氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺；4-(3-甲基氨基甲酰基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-乙酰基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-(3-甲磺酰基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-吗啉-4-基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-5-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺；4-吗啉-4-基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸[5-(3-氟-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯基]-酰胺；4-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸(3-{[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-甲基}-苯基)-酰胺；和4-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-甲酸{2-甲基-3-[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酰基氨基]-苯基}-酰胺。
7.一种包含治疗有效量的权利要求1的化合物和可药用赋形剂的药物组合物。
8.一种治疗动物疾病的方法，其中抑制激酶活性可预防、抑制或改善疾病的病理和/或症状，该方法包括给予动物治疗有效量权利要求1的化合物。
9.权利要求8的方法，其中的激酶选自Abl、BCR-Abl、Bmx、CSK、TrkB、FGFR3、Fes、Lck、B-RAF、C-RAF、MKK6、SAPK2α和/或SAPK2β激酶。
10.权利要求1的化合物在制备用于治疗动物疾病的药物中的用途，其中，Abl、BCR-Abl、Bmx、CSK、TrkB、FGFR3、Fes、Lck、B-RAF、C-RAF、MKK6、SAPK2α和/或SAPK2β的激酶活性对所述疾病的病理和/或症状起作用。
全文摘要
本发明提供了一类新的化合物、含有这些化合物的药物组合物和使用这些化合物来治疗或预防与激酶活性异常或失调有关的疾病或病症，特别是与Abl、BCR－Abl、Bmx、CSK、TrkB、FGFR3、Fes、Lck、B－RAF、C－RAF、MKK6、SAPK2α和SAPK2β激酶异常激活有关的疾病或病症的方法。
文档编号C07D471/02GK1842529SQ200480024575
公开日2006年10月4日 申请日期2004年8月27日 优先权日2003年8月28日
发明者丁强, N·S·格雷, 李兵, 刘异, 宇野哲郎 申请人:Irm责任有限公司