专利名称：蛋白酶抑制剂BmSPI39及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及ー种蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
家蚕是ー种具有很高经济价值的产丝昆虫。然而，家蚕易受各种病原微生物和其它外界因素影响，产生疾病。昆虫致病性真菌，如绿僵菌、球孢白僵菌、黄曲霉菌和米曲霉菌，都可引发高传染性蚕病。一旦这些致病性真菌在桑蚕区传播开来，将对茧丝产量和质量造成重大损失，甚至导致整个桑蚕行业的失败。所以，采取有效措施控制家蚕真菌疾病非常重要。超微结构和组织化学证据表明，昆虫致病性真菌主要通过机械压カ和酶解双重作用来穿透昆虫体壁，进而入侵昆虫。其中，体壁降解蛋白酶在孢子萌发时分泌于昆虫体壁， 參与宿主表皮穿透过程，是重要的毒力因子。例如，绿僵菌分泌的体壁降解蛋白酶Prl可以激活烟草天蛾的酚氧化酶系统，増加Prl基因拷贝数，从而显著提高绿僵菌的毒力；球孢白僵菌分泌的体壁降解蛋白酶CDEP-I能够加速孢子萌发和体壁穿透过程，从而显著提高球孢白僵菌的毒力。蛋白酶抑制剂广泛存在于各种生物中，它们通过结合蛋白酶或介导蛋白酶受体清除信号来消除不需要的蛋白水解过程。目前，在自然界中共发现了四种蛋白酶抑制剂抑制胰蛋白酶、膜凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等的巯基蛋白酶抑制剂，抑制胶原酶、氨肽酶等的金属蛋白酶抑制剂和抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶D等的羧基蛋白酶抑制剂。其中，丝氨酸蛋白酶抑制剂的种类最多。根据序列同源性、 半胱氨酸数目和分子中二硫键与作用位点之间的拓扑学关系，丝氨酸蛋白酶抑制剂又分为 Kunitz、Kazal> Bowman-Birk> Serpin、TIL (trypsin inhibitor like cysteine rich domain)等几个家族。目前，在家蚕的血液和丝腺等组织中发现的蛋白酶抑制剂主要以胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂为主。蛋白酶抑制剂在许多生理过程例如消化、凝血、纤溶、补体级联反应、酚氧化酶级联反应、细胞迁移，激素或多肽释放等过程中起着重要的调控作用，但其作用的具体机理目前尚不清楚。近年来研究发现，家蚕血液中的蛋白酶抑制剂在抵御微生物入侵过程中起着重要作用。例如，家蚕C124品种的真菌蛋白酶抑制剂-F (FPI-F)可以抑制白僵菌孢子的萌发和萌芽管的生长，能够强烈抑制枯草杆菌蛋白酶、蜂蜜曲霉蛋白酶以及白僵菌分泌到培养基中的蛋白酶粗提物。因此，可以从家蚕蛋白酶抑制剂中寻找能够有效对抗致病性真菌入侵的分子，以提高家蚕抗真菌能力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于从家蚕蛋白酶抑制剂中寻找能够对抗致病性真菌入侵的分子，阐明其对抗致病性真菌入侵的机理，并提供其制备方法以及在生物学方面的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案
I、蛋白酶抑制剂BmSPI39，由SEQ ID No. 2中第25位至第98位氨基酸组成。进ー步，所述蛋白酶抑制剂BmSPI39在N末端还有信号肽序列，所述信号肽序列由 SEQ ID No. 2中第I位至第24位氨基酸组成。2、编码蛋白酶抑制剂BmSPI39的基因。进一歩，由SEQ ID No. I中第96位至第320位核苷酸组成。进ー步，所述基因在5’末端还有信号肽编码序列，由SEQ ID No. I中第24位至第 95位核苷酸组成。进ー步，所述基因cDNA全长序列由SEQ ID No. I中第I位至第440位核苷酸组成。3、含有上述基因的重组表达载体。进ー步,所述重组表达载体以p28质粒作为基础载体,所述p28质粒由pET28a质粒删减部分多克隆位点后获得，删减后的多克隆位点序列如SEQ ID No. 10所示。4、含有上述重组表达载体的工程菌。进ー步，所述工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)菌株为宿主菌。5、蛋白酶抑制剂BmSPI39的制备方法，包括以下步骤将由SEQ ID No. I中第 96位至第320位核苷酸组成的基因克隆入p28质粒的多克隆位点，获得重组表达载体 BmSPI39-p28，再将重组表达载体BmSPI39_p28转入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，获得工程菌 BmSPI39-p28-BL21 (DE3)，再用终浓度为0. 2mM的异丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷于37°C 诱导表达5小吋，收集诱导表达后的菌体，超声破碎，离心，收集上清，用Ni2+-NTA亲和层析纯化，即制得蛋白酶抑制剂BmSPI39 ;所述p28质粒由pET28a质粒删减部分多克隆位点后获得，删减后的多克隆位点序列如SEQ ID No. 10所示。6、蛋白酶抑制剂BmSPI39及其基因在制备枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶抑制剂中的应用。进ー步，所述枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶。7、蛋白酶抑制剂BmSPI39及其基因在制备球孢白僵菌体壁降解蛋白酶⑶EP-I诱导的杀虫性黑化反应阻断剂中的应用。进ー步，所述⑶EP-I诱导的杀虫性黑化反应为⑶EP-I诱导的家蚕黑化反应。8、编码蛋白酶抑制剂BmSPI39的基因在培育具有致病真菌抗性的家蚕品系中的应用。本发明的有益效果在于本发明克隆和表达了ー个家蚕的TIL类蛋白酶抑制剂 BmSPI39，研究结果显示，BmSPI39对温度和pH非常稳定，不仅能够强烈抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶的活性，并能够阻断球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I诱导的家蚕的过度、有害黑化，可以用于制备枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶抑制剂，也可以用于制备球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I诱导的杀虫性黑化反应的阻断剂，还可以用于具有致病真菌抗性的家蚕品系的培育，有助于提高家蚕抗致病性真菌入侵的能力。此外，本发明的BmSPI39原核表达方法操作简单，表达量高。
图I为BmSPI39 cDNA全长序列及其编码的氨基酸序列，其中单下划线部分为起始密码子(ATG)和終止密码子(TAA)，双下划线部分为可能的多腺苷酸化信号(ATTAAA)，灰色背景部分为信号肽序列。图2为BmSPI39与TIL家族其它成员的序列比对，其中保守和非保守的半胱氨酸残基分别用大写的“c”和小写的“C”标出，箭头所示为pi-Pr反应位点的酶切位点。图3为BmSPI39的原核表达及SDS - PAGE检测，其中泳道M为蛋白质分子量标准，泳道I和2分别为非诱导的BmSPI39-p28-BL21 (DE3)菌体沉淀和上清，泳道3和 4分别为16 V诱导20小时的BmSPI39-p28-BL21 (DE3)菌体沉淀和上清，泳道5和6分别为37 °C诱导5小时的BmSPI39-p28-BL21 (DE3)菌体沉淀和上清，泳道7和8分别为非诱导的BmSPI39- p28-Rosetta菌体沉淀和上清，泳道9和10分别为16°C诱导20小时的BmSPI39-p28-Rosetta菌体沉淀和上清，泳道11和12分别为37°C诱导5小时的 BmSPI39-p28-Rosetta菌体沉淀和上清,箭头所示为重组BmSPI39的ニ聚体。图4为重组BmSP139的ニ聚体的纯化。图5为重组BmSPI39对地衣芽孢杆菌分泌的枯草杆菌蛋白酶的抑制剂活性染色， 其中泳道I和2分别为非诱导和诱导的BmSPI39-p28-BL21 (DE3)上清。图6为重组BmSPI39对林伯氏白色念球菌分泌的蛋白酶K的抑制剂活性染色，其中泳道I为五龄幼虫血液(阳性对照)，泳道2和泳道3分别为非诱导和诱导的 BmSPI39-p28-BL21 (DE3)上清，泳道 4 为纯化的重组 BmSPI39。图7为重组BmSPI39对不同蛋白酶的抑制活性比较，其中“ + ”或“一”表示加或不加重组BmSP139, “**，，和表示与对照(不加重组BmSP139)相比p〈0. 001和p〈0. 01，误差棒表不平均值的标准误(n=3)。图8为温度对重组BmSPI39抑制活性的影响。图9为pH对重组BmSPI39抑制活性的影响。图10为重组BmSPI39对球孢白僵菌体壁降解蛋白酶⑶EP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶的抑制活性，其中“ + ”或“ 一”表示加或不加重组BmSPI39，“**”表示与对照(不加重组 BmSP139)相比p〈0. 001，误差棒表示平均值的标准误(n=3)。图11为球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CEDP-I诱导的家蚕黑化及BmSPI39对黑化的阻断。图12为注射球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CEDP-I或CEDP-I与BmSPI39的混合物后家蚕血液的变化。图13为注射球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CEDP-I或CEDP-I与BmSPI39的混合物
后家蚕体壁的变化。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一歩的详细描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。实施例中使用的家蚕品种为大造，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。家蚕用桑叶或人工饲料饲养，饲养条件为温度25°C，相対湿度为75% 土 5%，光周期为12小时光照+12小时黑暗。收集化蛹第2天的家蚕样品，用液氮冷冻后，置-800C保存，用于提取RNA。-,BmSP139 cDNA的克隆和序列分析
用 TRIzol 试剂(Invitrogen)提取蛹第 2 天的总 RNA。用 GeneRacerTM Kit (Invitrogen)进行3’ -和5’ -RACE PCR,按照试剂盒说明书操作。根据已知的BmSPI39 EST序列，设计并合成3’ -和5’ -RACE的基因特异性引物 (GSPs)如下反向 GSP :5，-atggaaacagttgacgcactcactc-3’ (SEQ ID No. 4)； 反向巢式 GSP :5，-acgaactgttactggctatgagagc-3’ (SEQ ID No.5)；正向 GSP :5，-ggctctcatagccagtaacagttcgt-3，(SEQ ID No.6);正向巢式 GSP: 5，-gagtgagtgcgtcaactgtttccat_3，(SEQ ID No. 7)。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳分离， 用胶回收试剂盒(Watson)纯化目的片段，再克隆入pEASY-Tl Simple质粒(TransGen),测序。克隆片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列见图1，可见BmSPI39 cDNA序列全长440nt (SEQ ID No. I第I 440位核苷酸)，开放阅读框(ORF)长297nt (SEQ ID No. I第 24 320位核苷酸)，共编码98个氨基酸(SEQ ID No. 2第I 98位氨基酸)，其中包含ー个由 24个氨基酸残基组成的信号肽(SEQ ID No. 2第广24位氨基酸)，预测编码蛋白的分子量为 10758. 28Da，等电点为4. 74，含有8个半胱氨酸(Cys)，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂中的TIL 家族。利用BLAST 程序将 BmSP139 与 TIL 家族的其它成员(BSTI、SI-7、VWF、Prlnh6、 Ixodidin、AMCI、AsC/E-l、ATI、FPI-F)进行序列比对。结果见图2，与TIL类蛋白酶抑制剂多含有10个半胱氨酸，共形成5对ニ硫键(1-7、2-6、3-5、4-10和8-9)不同，BmSP139有两个Cys发生了替换；而且，基于以前对TIL类蛋白酶抑制剂反应位点Pl残基的研究(Bania et al. , 1999; Pham et al. , 1996)，预测BmSPI39 反应位点的Pl - Pl ’残基为 Ala和 Ala， 这也与TIL家族的其它成员不同。根据上述保守的半胱氨酸数目和独特的反应位点，推測本发明所述BmSPI39为TIL家族的新成员。ニ、BmSPI39的原核表达和纯化
对去除信号肽序列的BmSPI39基因编码区(SEQ ID No. I中第96 320位核苷酸)进行 PCR 扩增。引物序列如下IH向引物5’ -CRCCatatRtttRaaaaaRattRtCCtR-S' (SEQ ID No. 8),下划线部分为 Nde I 酶切位点；反向引物5’-atttg￡gg￡￡g^ttatgactgttgtttatgg-3’(SEQ ID No. 9)，下划线部分为Not I酶切位点。以家蚕品种大造五龄第三天中部丝腺的 cDNA为模板，扩增条件为94°C预变性4分钟；然后94°C变性40秒，59°C退火30秒，72°C延伸45秒，共30个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒(Watson)纯化目的片段，用限制性内切酶Nde I和Not I进行双酶切，再与经同样双酶切的P28质粒在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，获得重组质粒BmSPI39-p28。p28质粒由中国科技大学的周丛照将pET28a质粒删减部分多克隆位点后获得，删减后的多克隆曰、序列为5’ -CatRRRacaccatcaccatcaccatatRRccaaaaaRRccRcRRccRCRRCCtttttRRCCat atggtgatggtgatgg-tgtcc_3’( SEQ ID No. 10,下划线部分分别为Nde I 和Not I 酶切位点)。 此外，p28质粒带有N-6His标签，从而使表达的重组BmSPI39 (氨基酸序列如SEQ ID No. 3 所示)在N末端带有融合标签序列MGHHHHHHM。将重组质粒BmSPI39_p28分别转化大肠杆菌 BL21(DE3)菌株和 Rosetta 菌株(Invitrogen)，获得工程菌 BmSPI39-p28-BL21(DE3)和 BmSPI39-p28-Rosetta，用终浓度为0. 2mM的异丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。收集诱导表达后的菌体，用结合缓冲液(20mM Tris-Cl，500mM NaCl, pH 8.0) 重悬，超声破碎，离心，分别收集菌体沉淀和上清，用15% SDS-PAGE进行检測。结果见图3， 用IPTG于37°C诱导表达5小时，大肠杆菌BL21(DE3)菌株可以高量表达重组BmSPI39。之后利用两次Ni2+-NTA亲和层析(Merck)对重组BmSPI39进行纯化，结果见图
4,纯化获得了重组BmSPI39的ニ聚体。后续活性试验中所述重组BmSPI39都指的是重组 BmSPI39的ニ聚体。采用Bradford Assay试剂盒(Tiangen)进行蛋白质浓度測定。三、BmSP139对不同蛋白酶的抑制剂活性
I、抑制剂活性染色检测BmSPI39对不同蛋白酶的抑制剂活性
采用Uriel and Berges报道的方法对重组BmSPI39进行抑制剂活性染色。染色原理为底物被蛋白酶水解后生成的产物能被染色液染成红色，而蛋白酶被抑制剂抑制后不具有水解活性，则无抑制剂的区域被染成红色，而有抑制剂的区域不会被染色而出现白色条带。染色方法为样品经10%的碱性Native-PAGE分离后，将电泳完毕的凝胶置于0. 07% 的蛋白酶液(0. I M Tris-Cl, IOmM CaCl2, pH7. 5, 0. 07% 的蛋白酶)中，37°C孵育 15 分钟，之后除去蛋白酶液，用单蒸水洗胶两次，室温静置15分钟，再将凝胶置于底物(20mg N-こ酰-D，L-苯丙氨酸-￠-萘酯溶于IOml N，N’ - ニ甲基甲酰胺)和染色液(IOOmg固蓝B盐溶于IOOml 0. IM磷酸盐溶液，pH 8. 0)的混合液(体积比1:10)中，37°C孵育20 分钟，之后除去底物与染色液的混合液，用单蒸水洗胶，終止反应。结果见图5飞，诱导的 BmSPI39-p28-BL21 (DE3)上清和纯化的重组BmSPI39对来自地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶以及来自林伯氏白色念球菌的蛋白酶K均有強烈的抑制活性。,BmSP139对不同蛋白酶的抑制活性比较
通过将蛋白酶与重组BmSPI39孵育，再測定蛋白酶的剩余水解活性来评估重组 BmSP139的抑制剂活性将IOOng蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K或木瓜蛋白酶)与500ng重组BmSPI39溶于IOOii I Fluoro Assay缓冲液(IOOmM Tris-HCl, pH 8.0，20 mM CaCl2)中，37°C孵育 30 分钟，再加入 100 y I 溶于 Fluoro Assay缓冲液的FITC标记的酪蛋白，37 °C避光孵育I小时，測定荧光强度(485nm激发， 535nm发射)，计算剩余酶活。结果见图7，重组BmSPI39可以强烈地抑制枯草杆菌蛋白酶和蛋白酶K的活性，但对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶无抑制活性，对木瓜蛋白酶有较弱的抑制活性。四、BmSPI39的热稳定性和酸碱稳定性
将重组BmSPI39分别在温度37、40、50、60、70、80、90、99°C处理15分钟后，与枯草杆菌蛋白酶孵育，测定剩余酶活。结果见图8，可见重组BmSPI39对热相当稳定，随着温度升高， 其蛋白酶抑制剂活性变化不大。将重组BmSPI39 分别用 pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、11. 8 的 Britton-Robinson 缓冲液于室温下处理24小时后，与枯草杆菌蛋白酶孵育，测定剩余酶活。结果见图9，可见重组BmSPI39在pH 2 11. 8范围内均相当稳定，在pH 11. 8时仍能保持67%的抑制剂活性。五、BmSP139对真菌蛋白酶的抑制剂活性
将重组BmSPI39分别与球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶孵育后，测定剩余酶活。结果见图10，可见重组BmSPI39能够强烈抑制球孢白僵菌体壁降解蛋白酶 CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶的活性，说明BmSPI39通过抑制病原真菌的体壁降解蛋白酶，从而抑制其穿透家蚕体壁和获取营养物质。六、BmSPI39对球孢白僵菌体壁降解蛋白酶OTEP-I诱导的黑化反应的抑制
黑化反应是昆虫用于抵御创伤和感染的重要的免疫反应，其取决于氧化还原酶类和酚氧化酶的活性。但是，由于活性半醌类和其他有毒副产物的过量产生对昆虫有害，所以酚氧化酶是受到严格控制的。给蚕蛹分别注射10 ill用0. 9% NaCl溶液溶解的2. 5 ii g⑶EP-I、 0. 5u g CDEP-1、0. 5 u g BSA 以及 0. 5 y g CDEP-1 与 2. 5 y g 重组 BmSPI39 的混合物。注射后第20小时，从蛹腹部节间膜收集血液，并解剖蛹皮进行观察。结果见图If 13，可见注射
2.5iig和0. 5iig⑶EP-I的蚕蛹在20小时后发生黑化，其血液也发生黑化(图12)，黑化的蚕蛹表皮中出现黑色包囊，而注射0. 5 ii g⑶EP-I与2. g重组BmSPI39的混合物的蚕蛹在20小时后未出现黑化，说明球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I可以激活家蚕的黑化反应，而BmSPI39能够阻断⑶EP-I诱导的过度的有害黑化。综合上述研究結果，(l)BmSPI39能够强烈抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶的活性，而枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶都属于枯草杆菌蛋白酶家族(subtilase family),因此，推测BmSPI39可以用于制备枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶抑制剂；(2) BmSP139 能够阻断球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I诱导的家蚕的过度、有害黑化，而家蚕是鳞翅目昆虫的典型代表和理想的生物学模型，因此，推測BmSPI39可以用于制备球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I诱导的杀虫性黑化反应的阻断剂；(3) BmSPI39不仅可以强烈抑制球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I的水解活性，而且可以阻断CDEP-I诱导的家蚕过度、有害的黑化反应，有助于提高家蚕抵抗致病性真菌入侵的能力，可以用于具有致病真菌抗性的家蚕品系的培育，例如，利用昆虫转基因载体如PiggyBac转座子等，将BmSPI39外源基因转入家蚕中进行超量表达，即可能获得具有致病真菌抗性的家蚕品系。 此外，鉴于BmSP139对蛋白酶K、球孢白僵菌体壁降解蛋白酶⑶EP-1和蜂蜜曲霉蛋白酶具有強烈的抑制剂活性，而类枯草杆菌蛋白酶之间具有较高的序列相似性，如球孢白僵菌体壁降解蛋白酶⑶EP-I (GenBank ID: AAK70804. I)与食线虫真菌刀孢轮枝菌的碱性丝氨酸蛋白酶verl 12 (GenBank ID: Q68GV9)的序列一致性为79. 3%,与林伯氏白色念球菌的蛋白酶K(GenBank ID: P06873)的序列一致性为62. 4%，与绿僵菌的体壁降解蛋白酶Prl (GenBank ID: P29138)的序列一致性为64. 9%，与球孢菌属的类枯草杆菌蛋白酶(GenBank ID: C5PCX1)的序列一致性为45. 2%，与地衣芽孢杆菌的角蛋白溶解蛋白酶KerA (GenBank ID: AAG10033)的序列一致性为30. 3%，BmSPI39可能在生物防治中应用于昆虫病原微生物的改良，也有助于控制传播人类和动物疾病的媒介昆虫。粗球孢子菌是球孢子菌病的致病因子，可以感染人类和各种动物，引起全身性真菌病。粗球孢子菌在菌丝形成过程中会分泌蛋白酶到胞外环境中，其中分泌的类枯草杆菌蛋白酶具有角蛋白水解活性，有助于增强球孢子菌属的致病性。鉴于BmSPI39对来自地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶和林伯氏白色念球菌的蛋白酶K具有強烈的抑制剂活性，而枯草杆菌蛋白酶类之间相似性很高，说明BmSPI39也可能有助于人类真菌病的治疗。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过參照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.蛋白酶抑制剂BmSPI39，由SEQID No. 2中第25位至第98位氨基酸组成。
2.根据权利要求I所述的蛋白酶抑制剂BmSPI39，其特征在于，在N末端还有信号肽序列，所述信号肽序列由SEQ ID No. 2中第I位至第24位氨基酸组成。
3.编码权利要求I所述蛋白酶抑制剂BmSPI39的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，由SEQID No. I中第96位至第320位核苷酸组成。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，在5’末端还有信号肽编码序列，由SEQID No. I中第24位至第95位核苷酸组成。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，其cDNA全长序列由SEQID No. I中第I 位至第440位核苷酸组成。
7.含有权利要求3至6任一项所述基因的重组表达载体。
8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于，以p28质粒作为基础载体，所述 P28质粒由pET28a质粒删减部分多克隆位点后获得，删减后的多克隆位点序列如SEQ ID No. 10所示。
9.含有权利要求7或8所述重组表达载体的工程菌。
10.根据权利要求9所述的工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)菌株为宿主菌。
11.权利要求I所述蛋白酶抑制剂BmSPI39的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 将由SEQ ID No. I中第96位至第320位核苷酸组成的基因克隆入p28质粒的多克隆位点， 获得重组表达载体BmSPI39-p28，再将重组表达载体BmSPI39-p28转入大肠杆菌BL21 (DE3) 菌株，获得工程菌BmSPI39-p28-BL21 (DE3)，再用终浓度为O. 2mM的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷于37°C诱导表达5小时，收集诱导表达后的菌体，超声破碎，离心，收集上清，用 Ni2+-NTA亲和层析纯化，即制得蛋白酶抑制剂BmSPI39 ;所述p28质粒由pET28a质粒删减部分多克隆位点后获得，删减后的多克隆位点序列如SEQ ID No. 10所示。
12.权利要求I所述的蛋白酶抑制剂BmSPI39和权利要求3所述的基因在制备枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶抑制剂中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶。
14.权利要求I所述的蛋白酶抑制剂BmSPI39和权利要求3所述的基因在制备球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-I诱导的杀虫性黑化反应阻断剂中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述CDEP-I诱导的杀虫性黑化反应为 ⑶EP-I诱导的家蚕黑化反应。
16.权利要求3所述的基因在培育具有致病真菌抗性的家蚕品系中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个蛋白酶抑制剂BmSPI39，由SEQIDNo.2中第24位至第98位氨基酸组成，BmSPI39对温度和pH非常稳定，不仅能够强烈抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-1和蜂蜜曲霉蛋白酶的活性，并且能够阻断CDEP-1诱导的家蚕的过度、有害黑化，可用于制备枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶抑制剂，也可用于制备CDEP-1诱导的杀虫性黑化反应的阻断剂，还可用于培育具有致病真菌抗性的家蚕品系，提高家蚕抵抗致病性真菌入侵的能力；此外，本发明的BmSPI39原核表达方法操作简单，表达量高。
文档编号C07K14/81GK102584987SQ20121006327
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者向仲怀, 夏庆友, 李游山, 赵萍 申请人:西南大学