专利名称：三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因及其编码蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因及其编码蛋白和应用。
背景技术：
丝氨酸蛋白酶抑制剂是对丝氨酸蛋白酶有抑制活性的一类蛋白质，其通过与靶酶相互结合形成稳定的复合体，来防止机体内丝氨酸蛋白酶的有害水解激活，是生物体内免疫系统的重要组成部分。根据序列特征、拓扑结构和功能的相似性，丝氨酸蛋白酶抑制剂可以被分为74个家族，但在虾蟹等甲壳动物中其结构和功能的报道较少。 Pacifastin是一类新的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，最初是1987年在淡水螯虾Pacifastus Ieniusculus的血淋巴中被发现。研究表明该基因只存在于节肢动物中，目前已经在多种昆虫中发现Pacifastin相关基因，但在甲壳动物中只在淡水螯虾和中华绒螯蟹中发现。淡水螯虾的Pacifastin由两条肽链构成，重链和轻链，其中轻链含有一个典型的半胱；氛酸排列模式 Cys-Xaa9_12-Cys-Asn-Xaa_Cys-Xaa-Cys-Xaa2_3-Gly-Xaa3_4_Cys-Thr-Xaa3_Cys (Pacifastin light chain domain, PLD) PLD 结构域对 Pacifastin 的结构和功能至关重要。三抚梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我国重要的海水养殖品种,但随着养殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不断提高，由细菌、真菌和病毒等引起的各种病害日趋严重，给三疣梭子蟹养殖业造成巨大损失。因此，开展三疣梭子蟹免疫防疫基础研究，为蟹病的防治寻找更科学有效的途径，通过提高蟹自身免疫抵抗力来防止和减少蟹病的发生，是实现其健康养殖的可靠保障。到目前为止，未有关于三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂的报道。因此，研究免疫因子一 Pacifastin对理解三疣梭子蟹的免疫防御机制和进行病害防治无疑具有十分重要的理论与实践意义，同时将有助于开发天然药物用于人类疾病的治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因及其编码蛋白和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因，三疣梭子蟹PtPLC基因为序列表SEQ ID No.1中的喊基序列所不。三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因编码蛋白，所述三疣梭子蟹PtPLC基因编码蛋白为序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示。三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因的应用，所述三疣梭子蟹PtPLC基因编码蛋白的重组表达产物用于制备蛋白酶的抑制剂药物、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。所述蛋白酶的抑制剂为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的抑制剂。本发明所具有的优点本发明利用表达序列标签技术(EST)、RACE技术从三疣梭子蟹中克隆到Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因cDNA全长序列，通过PCR技术扩增编码PtPLC成熟肽的基因片段并将其克隆到pEASY -El表达载体中，在大肠杆菌BL21 (DE3)实现体外重组表达。重组蛋白经TALON柱纯化和透析后，对牛胰蛋白酶和牛α-胰凝乳蛋白酶具有显著的抑制活性。当重组蛋白PtPLC浓度为I μ Μ、2 μ Μ、3 μ M时，对牛胰蛋白酶的抑制活性分别为88. 73%、90. 73%和97. 18% ;当重组蛋白浓度为2 μ Μ、3 μ M时，对牛α-胰凝乳蛋白酶的抑制活性达到31. 1%和99. 69%。本发明基因及其重组蛋白可作为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶类抑制剂药物的生产， 应用于人类相关疾病的治疗，或用于饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂的生产等，另外还可以为进一步研究三疣梭子蟹免疫防御机制提供基础，并为三疣梭子蟹的病害防治和基因辅助选育提供参考。
图1为本发明实例提供的诱导和纯化的三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC重组蛋白电泳图(其中1:蛋白marker，2 :未诱导菌体中表达的蛋白，3 :1PTG诱导后表达的蛋白；4 :纯化的重组蛋白)。图2为本发明实例提供的三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC重组蛋白对牛胰蛋白酶和牛α -胰凝乳蛋白酶的抑制作用图(AEBSF为阳性对照)。
具体实施例方式下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。本发明中的三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC的cDNA序列克隆包括下列步骤a)三疣梭子蟹总RNA的提取及mRNA的纯化；b)三疣梭子蟹cDNA文库构建；c)三疣梭子蟹cDNA文库EST序列的大规模测定；d)三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及PtPLC基因片段的筛选；e) RACE扩增获得PtPLC的全序列以及全序列的验证。实施例1.三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因为SEQ ID No.1中所不的喊基序列。序列表SEQ ID No.1 为:ggacttgcgg gcctgattct ccagagggtc gac atg aag get caa gtggtg ctg ctc ctg ctg ggg get get gtg acg gcg gca acc agtccg cct ttt gtg gaa ctc cct agt gat cct gat get cct gagtgt gag gga cgc cca ctg gtt gac cgc tgg agg aag gac tgc
权利要求
1.一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因，其特征在于三疣梭子蟹PtPLC基因为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。
2.—种权利要求1所述的三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因编码蛋白，其特征在于所述三疣梭子蟹PtPLC基因编码蛋白为序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示。
3.—种按权利要求1所述的三抚梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因的应用，其特征在于所述三疣梭子蟹PtPLC基因编码蛋白的重组表达产物用于制备蛋白酶的抑制剂药物、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。
4.按权利要求3所述的三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因的应用，其特征在于所述蛋白酶的抑制剂为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的抑制剂。
全文摘要
本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因及其编码蛋白和应用。三疣梭子蟹PtPLC基因为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。重组的PtPLC蛋白对牛胰蛋白酶和牛α-胰凝乳蛋白酶具有显著的抑制活性。当重组蛋白PtPLC浓度为1μM、2μM、3μM时，对牛胰蛋白酶的抑制活性分别为88.73％、90.73％和97.18％；当重组蛋白浓度为2μM、3μM时，对牛α-胰凝乳蛋白酶的抑制活性达到31.1％和99.69％。本发明在药物开发和饲料添加剂生产等方面具有潜在的应用价值，为三疣梭子蟹的病害防治和基因辅助选育奠定基础。
文档编号C07K14/81GK103014013SQ201210494670
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者崔朝霞, 刘媛, 王双艳 申请人:中国科学院海洋研究所