一种化合物及其在DNA端基修饰中的应用的制作方法与工艺

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种化合物及其在DNA端基修饰中的应用。

背景技术：
随着DNA技术的发展，端基修饰的DNA在分子生物学、分子检测以及生物材料的构建等领域扮演着越来越重要的角色。除了已经较为成熟的DNA氨基和巯基方法，人们在不断开发新的DNA端基化修饰技术和端基化修饰试剂，来满足日益增长的科研及商业需求。上世纪90年代以来，人们开始关注以呋喃作为DNA的端基/碱基修饰单元，呋喃可与马来酰亚胺在室温下高效地发生Diels-Alder环合反应，为DNA的端基化修饰和负载提供了一种新的选择；此外，呋喃在特定氧化剂的存在下可被氧化为二醛，在研究DNA双链交联中有着重要的应用。但是目前在DNA端基中引入呋喃的方法多局限于使用含有呋喃的羧酸与DNA端基的氨基反应，操作繁琐而且成本居高不下；在糖环或碱基上引入呋喃单元则需要进行大量的有机合成工作，极大提高了使用成本。

技术实现要素：
本发明针对现有技术中的不足，本发明提供一种新型的呋喃基亚膦酰亚胺酯，可直接应用于DNA合成仪，实现了简单高效地在DNA5’端引入呋喃单元的目的。本发明的技术方案是：本发明公开式(1)化合物获其药物上可接受的盐，式(1)化合物为：式(1)化合物的制备方法以2-呋喃丙酸为起始原料，首先将其通过氢化铝锂还原为2-呋喃丙醇，并进一步将其与2-氰乙基-N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺反应得到2-氰乙基-二异丙基-呋喃丙醇亚磷酰胺酯。按照如下反应路线和反应条件进行：其中，a.氢化铝锂，四氢呋喃，80℃；b.2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，三乙胺，0℃。具体的步骤如下：步骤a：将2-呋喃丙酸于加入到含有0.004g/mL氢化铝锂的无水四氢呋喃中的溶液，反应液在80℃搅拌下回流1小时，反应结束后，向冷却的反应液中滴加饱和氯化铵溶液，待气泡结束后滴加饱和碳酸钾溶液至沉淀完全，滤除不溶物，滤饼用四氢呋喃洗涤，有机相以无水硫酸钠干燥，旋转蒸发有机相，得到呋喃丙醇；步骤b：将同等质量的呋喃丙醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下，滴加2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，反应于室温下搅拌2小时，滤除不溶物，滤液以饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机相无水硫酸钠干燥，得到2-氰乙基-N，N-二异丙基-呋喃丙醇亚磷酰胺酯。本发明的另一个目的在于公开式(1)化合物在DNA端基修饰中的应用。本发明的第三个目的在于公开一种呋喃基DNA端基修饰试剂，其特征在于，所述修饰试剂的有效成为式(1)化合物获其药物上可接受的盐，式(1)化合物为：本发明的第四个目的在于公开上述呋喃基DNA端基修饰试剂的应用的方法，其特征在于，步骤1：将式(1)化合物溶于无水乙腈中，氮气保护下转移至DNA合成仪的端基修饰位试剂瓶中，输入DNA序列，执行合成。步骤2：合成完毕后将固相载体取出，分散在1毫升23％氨水中，55℃下密闭加热2小时，离心去除不溶物，溶液浓缩即得到新合成的DNA序列。本发明的有益效果是：1、本发明设计合成的化合物(1)可以通过简单的有机单元反应制备得到，合成步骤中没有副反应出现；并且可以直接用于DNA合成仪上，极大简化了修饰步骤；操作简便，成本低廉，具有较好的底物适应性。2、本发明所述的DNA端基修饰试剂具有较高的反应活性和良好的底物适应性，是一类很有市场前景的核酸端基修饰试剂。附图说明附图1为式(1)化合物的核磁共振氢谱；附图2为式(1)化合物的核磁共振碳谱；附图3为式(1)化合物的质谱图；附图4为未修饰的DNA质谱图；附图5为5’端修饰有呋喃基团的DNA质谱；附图6为未修饰DNA的HPLC谱图；附图7为5’端修饰有呋喃基团的HPLC谱图。具体实施方式本发明的具体实施方式如下：1、式(1)化合物合成：a.氢化铝锂，四氢呋喃，80℃；b.2-氰乙基-N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺，三乙胺，0℃。步骤a：0.8克氢化铝锂溶于200毫升无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下一次性加入2.8克2-呋喃丙酸于20毫升无水四氢呋喃中的溶液，反应液在80℃搅拌下回流1小时。反应结束后，向冷却的反应液中滴加4毫升饱和氯化铵溶液，待气泡结束后滴加饱和碳酸钾溶液至沉淀完全，滤除不溶物，滤饼用50毫升四氢呋喃洗涤，有机相以无水硫酸钠干燥。旋转蒸发有机相，得到2.4克呋喃丙醇(淡黄色油状液体)，收率94％；步骤b：1.2克呋喃丙醇和1.2克无水三乙胺溶于50毫升无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2.4克2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。反应于室温下搅拌2小时，滤除不溶物，滤液以饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相无水硫酸钠干燥。得到2.0克2-氰乙基-N,N-二异丙基-呋喃丙醇亚磷酰胺酯(式1化合物)(黄色粘稠液体)，收率66％。本发明的对得到的化合物进行了结构鉴定，其检测结果见图1-3，核磁共振氢谱，碳谱及质谱图。1H-NMR(CDCl3),400MHz:7.30(s,1H,ArH),6.27(s,1H,ArH),6.00(d,1H,ArH),3.84-3.86(m,2H,CH2OP),3.84-3.86(m,4H,CH2O+CHN),3.64-3.67(t,J＝4.0Hz,2H,CH2O),2.70-2.74(t,J＝8.0Hz,2H,ArCH2),2.60-2.63(t,J＝8.0Hz,2H,CH2CN),1.95-1.97(t,J＝4.0Hz,2H,CH2),1.17-1.26(m,12H,CH3)13C-NMR(CDCl3),100MHz:155.47,140.97,111.62,110.12,105.19,62.63,62.28,58.40,58.21,43.09,42.96,29.63,24.58,20.24.ESI-MS:ChemicalFormula:C16H27N2O3P,calc326.1759,detec326.1920(M+H+),345.20(M+H++NH4+)综合以上分析，最终将式1化合物的结构鉴定为2-氰乙基-N,N-二异丙基-呋喃丙醇亚磷酰胺酯，结构如式(1)所示，为一个新的含有呋喃基团亚膦酰亚胺酯。ChemicalFormula:C16H27N2O3PExactMass:326.1759MolecularWeight:326.37092、式(1)化合物在DNA端基修饰中的应用步骤1：540毫克式(1)化合物溶于10毫升无水乙腈中，氮气保护下转移至ABI3400DNA合成仪的端基修饰位试剂瓶中。输入DNA序列：5’CCTAGATTCAGTTCAACTTG3’，执行1μmol量级的合成。步骤2：合成完毕后将固相载体取出，分散在1毫升23％氨水中，55℃下密闭加热2小时，离心去除不溶物，溶液浓缩即得到粗产物。目标产物通过高效液相分离，并通过ESI-MS进行结构信息表征。表1.式(1)化合物在DNA端基修饰中的应用样品计算分子量(g/mole)实测分子量(g/mole)DNA质谱图DNA60676065附图4Furan-Modified-DNA62546253附图5所有有机分子的结构和纯度均由核磁共振氢谱来确定，DNA的结构信息由电喷雾解离质谱来确定，反应效率由高效液相色谱来确定。核磁型号为BrukerAMX400Spectrometer(500MHz)，质谱型号为Agilent6510Q-TOF，高效液相色谱型号为Waters2695，检测柱型号为XBriageOligonucleotidesBEHC18(2.1mm×50mm；Column2.5um)，淋洗条件如下：如图6所示，未修饰DNA的HPLC谱图，出峰时间为10.317分钟；如图7所示，经过本发明的式(1)化合物修饰后的DNA的HPLC谱图，出峰时间为14.245分钟。综上可知，式(1)化合物应用于DNA的5’端修饰中，取得了良好的效果。实验表明该DNA端基修饰试剂具有较高的反应活性和良好的底物适应性，是一类很有市场前景的核酸端基修饰试剂。