一种寡聚核苷酸的纯化方法及应用与流程

文档序号:11107466阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种寡聚核苷酸的纯化方法,包括以下步骤:

a、以非极性键合硅胶/弱极性键合硅胶为固定相或使用Cartridge柱OPC(oligonucletide purification cartridge,寡聚核苷酸固相萃取纯化柱)为载体,以体积比为100-80∶0-20的乙腈和水为流动相,在不使用真空泵的条件下冲洗柱子,冲洗后将柱子完全抽干以除去柱子中的残留杂质;

b、用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl)或NaCl活化柱子;

c、上样;

d、使用去离子水冲洗柱子;

e、用体积比1-50∶99-50的水:乙腈为洗脱液对固相进行洗脱;

f、收集目标寡聚核苷酸溶液。

2.根据上述权利要求任一项所述方法,其特征在于:将权利要求1所述的步骤d使用去离子水冲洗柱子替换为步骤d‘:以浓氨水溶液为A相、去离子水为B相、三氟乙酸(TFA)水溶液的C相,按照A相-B相-C相- B相的先后顺序进行洗脱纯化,其中,C%为3%-25%,A相的pH应大于7.5,不大于13;其中所述固定相为键合碳链C1、C4、C8、C18、氰基或苯基的硅胶;优选为,十八烷基硅烷键合硅胶、丁基烷基硅烷键合硅胶或氰基烷基硅烷键合硅胶。

3.根据上述权利要求任一项所述方法,其特征在于:所述的步骤a中作为流动相的乙腈和水的体积比优选为100∶0,优选使用的5ml乙腈在不使用真空泵的条件下冲洗柱子;和/或所述的B步骤中Tris-HCl或NaCl的浓度为0.5M,和/或pH为6-7,优选为pH7.5。

4.根据上述权利要求2所述的方法,其特征在于:所述步骤d’的C%为3-5%,优选为4%。

5.根据上述权利要求任一项所述方法,其特征在于:所述e步骤中水和乙腈的比为1:1。

6.根据上述权利要求任一项所述方法,其特征在于:所述e步骤中对固定相进行梯度洗脱,是用水和乙腈梯度洗脱的比例依次为:

3:1→2:1→1:1,每种比例的水和乙腈1ml,循环进行洗脱。

7.根据上述权利要求任一项所述方法,其特征在于步骤c之前还包括前处理步骤;优选的,前处理步骤为除去样品中残留的氨水;和/或在步骤f之后还包括步骤g浓缩定量;优选的,步骤g使用离心浓缩仪将步骤f获得的收集液浓缩到适当体积,并进行定量;更优选的,在进行权利要求1所述方法之前,将样品先用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturing PAGE)进行目的寡聚核苷酸的割胶分离后,再用权利要求1所述方法进行DNA的纯化。

8.一种非修饰、未带二甲氧基三苯甲基(DMT)的DNA纯化方法,其特征在于:使用权利要求3-8所述方法,直接脱盐纯化;优选的,制备柱直径为5mm-100mm;更优选的,所述寡聚核苷酸长度是5至大约50个核苷酸。

9.一种带有二甲氧基三苯甲基(DMT)的DNA纯化方法,其特征在于:以Cartridge柱OPC为载体,使用权利要求2或4-8任一项所述的方法,直接脱盐纯化;优选的,制备柱直径为5mm-100mm;更优选的,所述寡聚核苷酸长度是5至大约50个核苷酸。

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