本发明涉及微生物发酵
技术领域：
，具体而言，涉及一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法及其发酵产物和应用。
背景技术：
：蜡样芽孢杆菌是芽胞杆菌属中的一种。菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，1.0～1.2×3.0～5.0微米，产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5微米，孢囊无明显膨大，革兰氏阳性，无荚膜，运动，菌落大，表面粗糙，扁平，不规则。蜡样芽孢杆菌的菌落形态：在普通琼脂平板培养基上，37℃，培养24h，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落直径5-7mm。蜡样芽孢杆菌在M.S.P培养基上生长更旺盛，菌落直径达8-10mm，质地更软，挑起来呈丝状，培养时间稍长，菌落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素。蜡样芽孢杆菌在蛋白胨酵母膏平板上菌落为灰白色，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，菌落较大。有益蜡样芽孢杆菌是我国农业部正式批准生产生物制品的菌种，具有调节宿主微生态平衡的功能，广泛应用于饲料、农业、医药保健和食品等各领域。目前对于蜡样芽孢杆菌的发酵方式主要为液体发酵，这种发酵方式普遍存在活菌数和芽孢率偏低的问题，没有芽孢的菌体会在短时间内死亡，大大降低菌剂的活性和质量稳定性。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，该发酵方法采用高密度固体发酵培养蜡样芽孢杆菌，能促进蜡样芽孢杆菌的生长，提高蜡样芽孢杆菌的活菌数量和芽孢产率。本发明的目的之二在于提供一种所述蜡样芽孢杆菌固体发酵方法得到的蜡样芽孢杆菌固体发酵产物，该发酵产物中活菌数高、杂菌率低、芽孢率高，具有高效防治植物根结线虫的功能。本发明的目的之三在于提供一种所述的蜡样芽孢杆菌固体发酵产物在制备农业生物防治制剂和防治植物土传病害中的应用。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：将蜡样芽孢杆菌菌株经种子活化和液体种子培养后，采用固体培养基进行发酵培养，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：40～60重量份蘑菇渣、10～30重量份稻壳、15～35重量份麸皮和2～8重量份玉米浆，pH值为6.5～7.5。优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，上述蜡样芽孢杆菌固体发酵方法包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于营养琼脂斜面培养基上，培养温度37±1℃，培养时间36～48h，得到斜面种子；(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子接种于液体培养基中，培养温度37±1℃，培养时间36～48h，得到液体种子；(c)固体发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子接种于固体培养基中，培养温度37±1℃，培养时间48～72h，得到发酵产物；(d)将步骤(c)得到的发酵产物干燥后，得到干燥的发酵产物。进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(a)中营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0～7.2。进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(b)中液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0～7.2。进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(c)中液体种子的接种量为8～12％(v/w)。进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(c)中固体培养基为浅盘湿固体培养基，所述浅盘湿固体培养基为将固体培养基的组分放入浅盘内加水得到，浅盘湿固体培养基的水含量为55～65％。优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(d)中干燥具体包括：将步骤(c)得到的发酵产物烘干至含水率小于20％。优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，所述营养琼脂斜面培养基、液体培养基和固体培养基均独立地在使用前进行灭菌处理，灭菌条件为121℃、0.11MPa灭菌20～60min。优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，上述蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌20min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36～48h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0～7.2；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36～48h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0～7.2；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌60min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量60％；将步骤(b)得到的液体种子以10％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间48～72h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：50重量份蘑菇渣、20重量份稻壳、25重量份麸皮和5重量份玉米浆，pH值为6.5～7.5；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于50～80℃条件下烘干，期间取样测定水分，当含水率低于20％时，烘干结束，得到干燥的发酵产物。一种蜡样芽孢杆菌固体发酵产物，按照上述蜡样芽孢杆菌固体发酵方法得到。一种上述蜡样芽孢杆菌固体发酵产物在制备农业生物防治制剂和防治植物土传病害中的应用。与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的发酵方法是一种固体发酵培养蜡样芽孢杆菌的方法，采用该方法能显著促进蜡样芽孢杆菌的生长，提高蜡样芽孢杆菌的活菌数量和芽孢产率。此外，该发酵方法的培养基成分易得且价格低廉，全部采用农副产品，配方合理，能够满足菌种大量繁殖的需要，发酵工艺简单、发酵周期短，可有效降低企业的生产成本，且产量更高，具有较大的优势。(2)本发明的发酵产物中蜡样芽孢杆菌有效活菌数可达100亿/g，细胞密度高，杂菌率低于5％，且芽孢率高达95％以上。(3)试验表明，本发明的发酵产物中蜡样芽孢杆菌适应性强，在低营养下即可快速生长繁殖，在植物根际能够快速大量定殖，具有良好的应用前景。由该发酵产物制备的生物防治制剂可以作为生物农药，不仅能高效地防治植物根结线虫等土传病害，还能有效促进作物生长和提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。(4)固体发酵所使用的原料成本较经济，所产生的代谢物质更丰富，下游的回收纯化过程及废弃物处理通常较为简单，通常是整个基质都被使用，较液体发酵更具优势。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。根据本发明的第一个方面，提供了一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：将蜡样芽孢杆菌菌株经种子活化和液体种子培养后，采用固体培养基进行发酵培养，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：40～60重量份蘑菇渣、10～30重量份稻壳、15～35重量份麸皮和2～8重量份玉米浆，pH值为6.5～7.5。蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)是芽胞杆菌属中的一种，是从土壤中分离获得的，其具有以下生物学特性：在普通琼脂平板培养基上，37℃，培养24h，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落直径5-7mm。在M.S.P培养基上生长更旺盛，菌落直径达8-10mm，质地更软，挑起来呈丝状，培养时间稍长，菌落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素。在蛋白胨酵母膏平板上菌落为灰白色，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，菌落较大。根据申请号为201410061856.X、公开号为103937699B的中国专利文献的记载，本发明所提供的蜡样芽孢杆菌已于2014年1月6日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCCNO:M2014007，名称为：蜡样芽孢杆菌zy-1(Bacilluscereuszy-1)，20年内公众可从中国典型培养物保藏中心获取该菌种。种子活化是将保藏菌种从休眠状态转变成对数生长状态，以便菌种能很快适应扩大培养的需要，操作是接种保藏菌种于固体斜面。种子活化不仅活化菌种，也培养一定数量的斜面种子。液体种子培养是经过扩大培养，获得供发酵接种的足够数量和优质质量的种子。扩大培养可经过摇瓶和种子罐进行逐级扩大培养。固体培养基的蘑菇渣为废弃的蘑菇料渣，含有丰富的粗蛋白、粗脂肪和氮浸出物，还含有钙、磷、钾、硅等矿物质。蘑菇渣典型但非限制性的含量例如为40重量份、42重量份、44重量份、46重量份、48重量份、50重量份、52重量份、54重量份、56重量份、58重量份或60重量份。固体培养基的稻壳为稻谷外面的一层壳，稻壳富含纤维素、木质素、二氧化硅，脂肪、蛋白质的含量较低。稻壳典型但非限制性的含量例如为10重量份、12重量份、14重量份、16重量份、18重量份、20重量份、22重量份、24重量份、26重量份、28重量份或30重量份。固体培养基的麸皮为小麦最外层的表皮。麸皮典型但非限制性的含量例如为15重量份、16重量份、17重量份、18重量份、19重量份、20重量份、21重量份、22重量份、23重量份、24重量份、25重量份、26重量份、27重量份、28重量份、29重量份、30重量份、31重量份、32重量份、33重量份、34重量份或35重量份。固体培养基的玉米浆是制玉米淀粉的副产物。制造玉米淀粉须将玉米粒先用亚硫酸浸泡，浸泡液浓缩即制成黄褐色的液体，即玉米浆。玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，含大约40％～50％固体物质。玉米浆典型但非限制性的含量例如为2重量份、3重量份、4重量份、5重量份、6重量份、7重量份或8重量份。固体培养基的pH值为6.5～7.5，例如6.5、7.0或7.5。该培养基全部采用农副产品，成本低，配方合理，通过一定量的蘑菇渣、稻壳、麸皮和玉米浆配合，能够满足菌种大量繁殖需要。传统的蜡样芽孢杆菌的发酵方式主要为液体发酵，存在活菌数和芽孢率偏低的问题，大大降低菌剂的活性和质量稳定性。本发明采用固体发酵法生产蜡样芽孢杆菌，工艺简单、易于实施，通过采用该方法能够显著促进蜡样芽孢杆菌的生长，提高蜡样芽孢杆菌的活菌数量和芽孢产率。高密度固体发酵一般指发酵产物中细胞密度超过常规培养的生长状态，目前市场上的蜡样芽孢杆菌发酵品中菌数基本在30～60亿/g，而本发明发酵产物中菌数可达100亿/g，属于一种高密度的固体发酵产物。本发明所述的“主要由”，意指其除所述组份外，还可以包括其他组份，这些其他组份赋予所述复合肥不同的特性。除此之外，本发明所述的“主要由”，还可以替换为封闭式的“为”或“由……组成”。在一种优选的实施方式中，蜡样芽孢杆菌固体发酵方法包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于营养琼脂斜面培养基上，培养温度37±1℃，培养时间36～48h，得到斜面种子；(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子接种于液体培养基中，培养温度37±1℃，培养时间36～48h，得到液体种子；(c)固体发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子接种于固体培养基中，培养温度37±1℃，培养时间48～72h，得到发酵产物；(d)将步骤(c)得到的发酵产物干燥后，得到干燥的发酵产物。步骤(a)中，斜面培养基是固体培养基的一种形式，制作时应趁热定量分装于试管内，并凝固成斜面的称为斜面培养基，用于菌种扩大转管及菌种保藏。营养琼脂斜面培养基采用牛肉膏、蛋白胨等营养基质配制而成。将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于营养琼脂斜面培养基，对蜡样芽孢杆菌种子进行活化，典型但非限制性的培养温度为36℃、37℃或38℃，典型但非限制性的培养时间为36h、40h、44h或48h，得到斜面种子。步骤(b)中，液体培养基为液体发酵罐物料，例如1000L液体发酵罐物料，液体发酵罐物料为采用牛肉膏、蛋白胨等营养基质与水配制而成的液体培养基，将斜面种子接种于液体发酵罐物料中进行种子扩大培养，典型但非限制性的培养温度为36℃、37℃或38℃，典型但非限制性的培养时间为36h、40h、44h或48h，得到液体种子。步骤(c)中，将液体种子接种于固体培养基中进行发酵培养，典型但非限制性的培养温度为36℃、37℃或38℃，典型但非限制性的培养时间为48h、54h、60h、66h或72h，得到发酵产物。最后对发酵产物进行干燥。在一种优选的实施方式中，步骤(a)中营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0～7.2。在一种优选的实施方式中，步骤(b)中液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0～7.2。牛肉膏、蛋白胨和氯化钠是菌种的基础营养物质，通过各组分之间的合理配比关系，可满足蜡样芽孢杆菌菌种的生长需要。适宜生长的pH值为7.0、7.1或7.2。在一种优选的实施方式中，步骤(c)中液体种子的接种量为8～12％(v/w)。接种量是指移入的种子液体积和接种后固体培养基质量的百分比。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前到来。典型但非限制性的接种量例如为8％、9％、10％、11％或12％。在一种优选的实施方式中，步骤(c)中固体培养基为浅盘湿固体培养基，所述浅盘湿固体培养基为将固体培养基的组分放入浅盘内加水得到，浅盘湿固体培养基的水含量为55～65％。浅盘发酵是在一定的温度和湿度环境中在底面开孔或不开孔的浅盘中利用固态培养基培养微生物以生产微生物菌体或其代谢产物。由于固态发酵培养基的湿度(体现在水份含量上)对微生物生产繁殖及代谢有很大关系，上述水含量百分数为质量百分数。对蜡样芽孢杆菌进行浅盘发酵时典型但非限制性的水分含量例如为55％、60％或65％，通过浅盘湿固体培养基的培养，使蜡样芽孢杆菌的生长达到最佳水平。在一种优选的实施方式中，步骤(d)中干燥具体包括：将步骤(c)得到的发酵产物烘干至含水率小于20％。发酵后烘干主要是为了迅速降低发酵产生的大量水分，避免与空气接触感染变质。优选地，将步骤(c)得到的发酵产物置于50～80℃条件下烘干，期间取样测定水分，当含水率低于20％时，烘干结束。典型但非限制性的烘干温度例如为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一种优选的实施方式中，所述营养琼脂斜面培养基、液体培养基和固体培养基在使用前进行灭菌处理，灭菌条件为121℃、0.11MPa灭菌20～60min。典型但非限制性的灭菌时间例如为20min、30min、40min、50min或60min。优选地，采用高压蒸汽灭菌。培养基在制备过程中容易混入各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少应在24h内完成灭菌。优选地，一种典型的蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌20min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36～48h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0～7.2；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36～48h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0～7.2；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌60min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量60％；将步骤(b)得到的液体种子以10％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间48～72h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：50重量份蘑菇渣、20重量份稻壳、25重量份麸皮和5重量份玉米浆，pH值为6.5～7.5；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于50～80℃条件下烘干，期间取样测定水分，当含水率低于20％时，烘干结束，得到干燥的发酵产物。根据本发明的第二个方面，提供了一种蜡样芽孢杆菌固体发酵产物，该产物按照上述蜡样芽孢杆菌固体发酵方法得到。通过上述高密度固体发酵方法制得的发酵产物中蜡样芽孢杆菌有效活菌数高，可达100亿/g，杂菌率低，小于5％，且芽孢率高，达95％以上。此外，蜡样芽孢杆菌适应性强，在低营养下即可快速生长繁殖，在植物根际能够快速大量定殖，具有良好的应用前景。根据本发明的第三个方面，提供了一种上述蜡样芽孢杆菌固体发酵产物在制备农业生物防治制剂和防治植物土传病害中的应用。利用该发酵产物可制备生物制剂或生物农药，起到防治植物根结线虫等土传病害的目的，还能有效提高作物产量，可应用于农业生物防治领域。为了进一步了解本发明，下面结合具体实施例对本发明的方法及效果作进一步详细的说明。实施例1一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌20min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌60min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量60％；将步骤(b)得到的液体种子以10％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间60h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：50重量份蘑菇渣、20重量份稻壳、25重量份麸皮和5重量份玉米浆，pH值为7.0；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于65℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。实施例2一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌60min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度36℃，培养时间40h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.2；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌60min的液体培养基中，培养温度36℃，培养时间48h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.2；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌30min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量55％；将步骤(b)得到的液体种子以8％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度36℃，培养时间48h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：40重量份蘑菇渣、30重量份稻壳、15重量份麸皮和8重量份玉米浆，pH值为6.5；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于50℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。实施例3一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌30min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度38℃，培养时间48h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.1；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌40min的液体培养基中，培养温度38℃，培养时间40h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.1；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌50min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量65％；将步骤(b)得到的液体种子以12％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度38℃，培养时间72h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：60重量份蘑菇渣、10重量份稻壳、35重量份麸皮和2重量份玉米浆，pH值为7.5；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于80℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。实施例4一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌50min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌40min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.2；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌30min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量58％；将步骤(b)得到的液体种子以11％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间48h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：45重量份蘑菇渣、25重量份稻壳、20重量份麸皮和6重量份玉米浆，pH值为6.8；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于60℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。实施例5一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌25min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间48h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.2；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间48h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌60min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量62％；将步骤(b)得到的液体种子以9％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间60h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：55重量份蘑菇渣、15重量份稻壳、30重量份麸皮和4重量份玉米浆，pH值为7.2；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于70℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。实施例6一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌20min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌60min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量60％；将步骤(b)得到的液体种子以5％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间60h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：50重量份蘑菇渣、20重量份稻壳、25重量份麸皮和5重量份玉米浆，pH值为7.0；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于65℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。实施例7一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌20min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌60min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量45％；将步骤(b)得到的液体种子以10％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间60h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：50重量份蘑菇渣、20重量份稻壳、25重量份麸皮和5重量份玉米浆，pH值为7.0；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于65℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。实施例8一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌20min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌60min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量70％；将步骤(b)得到的液体种子以10％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间60h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：50重量份蘑菇渣、20重量份稻壳、25重量份麸皮和5重量份玉米浆，pH值为7.0；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于65℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。对比例1一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌20min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0；(c)液体发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子以10％(v/v)的接种量接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌60min的发酵培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间60h，得到发酵产物；所述发酵培养基的组分包括：5重量份牛肉膏、9重量份蛋白胨、5重量份氯化钠、12重量份葡萄糖、1重量份MnSO4·H2O、2重量份KH2PO4、0.5重量份MgSO4·7H2O和65.5重量份水，pH值为7.0；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于65℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。对比例2一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌20min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌60min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量60％；将步骤(b)得到的液体种子以10％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间60h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：30重量份稻壳、35重量份麸皮和35重量份玉米浆，pH值为7.0；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于65℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。对比例3一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌20min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌60min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量60％；将步骤(b)得到的液体种子以10％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间60h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：50重量份蘑菇渣、25重量份麸皮和25重量份玉米浆，pH值为7.0；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于65℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。对比例4一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌20min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌60min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量60％；将步骤(b)得到的液体种子以10％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间60h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：50重量份蘑菇渣、30重量份稻壳和20重量份玉米浆，pH值为7.0；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于65℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。对比例5一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌20min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌60min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量60％；将步骤(b)得到的液体种子以10％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间60h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：70重量份蘑菇渣、5重量份稻壳、40重量份麸皮和10重量份玉米浆，pH值为7.0；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于65℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。对比例6一种蜡样芽孢杆菌固体发酵方法，包括以下步骤：(a)斜面种子活化：将蜡样芽孢杆菌菌株在无菌条件下接种于经121℃、0.11MPa灭菌20min的营养琼脂斜面培养基上，培养温度37℃，培养时间36h，得到斜面种子；所述营养琼脂斜面培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠和20g/L琼脂，pH值为7.0；(b)液体种子培养：挑取步骤(a)得到的斜面种子两环接种于1000L液体发酵罐中的经121℃、0.11MPa灭菌30min的液体培养基中，培养温度37℃，培养时间36h，得到液体种子；所述液体培养基的组分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠，pH值为7.0；(c)固体发酵培养：将经121℃、0.11MPa灭菌60min的固体培养基的组分放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量60％；将步骤(b)得到的液体种子以10％(v/w)的接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度37℃，培养时间60h，得到发酵产物；所述固体培养基的组分包括：30重量份蘑菇渣、40重量份稻壳、10重量份麸皮和5重量份玉米浆，pH值为7.0；(d)将步骤(c)得到的发酵产物置于65℃条件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的发酵产物。效果例1发酵产物活菌和芽孢计数对各实施例和各对比例得到的发酵产物进行活菌和芽孢计数。活菌计数：以平板涂布法进行计数。芽孢计数：将样品在80℃水浴中处理15min后进行平板涂布计数。具体包括：准确称取粉碎后发酵物料10g，放入盛有90mL无菌生理盐水的三角瓶中制成菌悬液，80℃水浴15min杀死营养体，然后将菌悬液稀释至10-7～10-8，取100μL均匀涂布到LB平板上，于37℃倒置培养24h，进行菌落计数。芽孢率＝芽孢数/活菌数×100％。试验结果如表1所示。表1发酵产物活菌和芽孢计数结果由表1可以看出，本发明的发酵产物中蜡样芽孢杆菌有效活菌数可达100亿/g，杂菌率低于5％，且芽孢率高达95％以上。实施例1～实施例5得到的发酵产物中蜡样芽孢杆菌的有效活菌数>100亿/g，芽孢数>97亿/g，芽孢率>95％，且杂菌数少，杂菌率<5％。实施例6与实施例1相比，液体种子的接种量小，抑制了菌种在发酵罐中生长繁殖，有效活菌数和芽孢数有所降低。实施例7，8与实施例1相比，有效活菌数和芽孢数也有所降低，可见浅盘湿固体培养基水含量过少或过多，都不利于菌种的发酵及代谢。对比例1～对比例6的有效活菌数和芽孢数与实施例相比有显著降低，杂菌也有所增加。对比例1采用传统的液体发酵法，有效活菌数和芽孢率偏低；对比例2～对比例4采用的浅盘湿固体培养基中缺少部分营养成分，不能使蜡样芽孢杆菌得到有效生长繁殖，对比例5～对比例6采用的浅盘湿固体培养基中的营养成分配比与本发明不同，也不能获得较好的发酵效果。效果例2田间药效试验1)供试药剂蜡样芽孢杆菌菌株发酵产物(实施例一和对比例一中制备)；噻唑膦10％颗粒剂(市售)；阿维菌素1.8％乳油(市售)。2)供试作物与防治对象：供试作物为黄瓜；品种为中农1101；防治对象：根结线虫。3)试验地情况、试验设计及安排试验地设在山东省济南市济阳县董家村黄瓜大棚，土壤为粘土地，往年根结线虫病害发生严重。试验地栽培条件均匀一致。田间试验共设6个不同的处理：处理1为实施例一蜡样芽孢杆菌发酵产物加蒸馏水稀释10倍，施药剂量为150L/hm2；处理2为实施例一蜡样芽孢杆菌发酵产物加蒸馏水稀释10倍，施药剂量为400L/hm2；处理3为噻唑膦10％颗粒剂，施药剂量为30kg/hm2；处理4为阿维菌素1.8％乳油500倍液，施药剂量为15L/hm2；处理5为对比例一蜡样芽孢杆菌发酵产物加蒸馏水稀释10倍，施药剂量为400L/hm2；处理6为无菌水空白对照(CK)，共6个处理，每处理0.1hm2，灌根黄瓜幼苗。在田间大棚培养2月后缓慢取出黄瓜植株根系，调查根结线虫病情况，记录数据，结果如表2所示。表2不同药剂对黄瓜根结线虫病害防治效果处理处理株数发病率(％)病情指数防治效果(％)处理150059.82％10.4670.24％处理250062.53％8.3575.87％处理350070.15％9.1274.32％处理450085.63％20.5464.58％处理550064.16％15.5666.37％处理6500100％89.82—其中：病情指数＝普遍率×严重度×100由表2可以看出，蜡质芽孢杆菌发酵产物在400L/hm2大剂量使用时防治效果最好，达到75.87％，显著高于阿维菌素1.8％乳油的64.58％，略高于小剂量使用后的70.24％，与噻唑膦10％颗粒剂74.32％的防治效果相近。可见，该发酵产物可用于制备生物药剂，作为生物农药，植物根结线虫等土传病害有较好的防治效果。处理5与处理2相比，防治效果降低近10个百分点，可见采用液体发酵法得到的发酵产物中由于活菌数较少，对植物根结线虫病不能起到较好的防治效果。效果例3蜡样芽孢杆菌发酵产物对农作物促生作用的田间试验1)供试药剂蜡样芽孢杆菌菌株发酵产物(实施例一和对比例一中制备)。2)供试作物：供试作物为小麦、玉米和油菜。3)试验设计田间试验共设6个不同的处理：处理1为实施例一蜡样芽孢杆菌发酵产物加蒸馏水稀释100倍，制成菌悬液，浸种24h；处理2为实施例一蜡样芽孢杆菌发酵产物加蒸馏水稀释100倍，制成菌悬液，浸种24h并进行灌根；处理3为实施例一蜡样芽孢杆菌发酵产物加蒸馏水稀释100倍，制成菌悬液，浸种24h、灌根并喷洒叶面；处理4为对比例一蜡样芽孢杆菌发酵产物加蒸馏水稀释100倍，制成菌悬液，浸种24h；处理5为无菌水空白对照(CK)，浸种24h。每小区长7m，宽3m，2次重复，用常规的栽培方式进行肥水管理。40d后，采样测量株高、干鲜重，每个小区采样50株。记录鲜重、干重和株高。结果表明，处理1～处理4都能增加小麦植株干重和鲜重，与对照相比，鲜重增加了2％～15％，干重增加了2％～15％。处理1～处理3的增长幅度明显比处理4的增长幅度大，处理1～处理3与对照相比，干、鲜重增加了9～15％，处理4与对照相比，干、鲜重增加了2～6％。可见，采用液体发酵后的发酵产物在对作物的促生长作用上较本发明效果差。此外，处理1～处理3较对照的增长幅度越来越大，通过多方面施用，可以进一步增加其促生长效果。处理后，小麦株高除处理4与对照基本相当外，其他几个处理的小麦株高与对照相比都有所增加，增加幅度为2％～5％。经过处理1～处理3处理过的小麦都较对照明显健壮。按上述方法处理玉米和油菜，处理1～处理3都较对照明显健壮，其鲜重和干重的增加均在6％～20％。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页1 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