海南风吹楠ISSR-PCR分子标记方法及其专用引物与流程

本发明属于生物分子标记领域，具体说是一种海南风吹楠issr-pcr分子标记方法及其专用引物。

背景技术：

海南风吹楠(horsfieldiahainanensismerr.)隶属肉豆蔻科(myristacaceae)，风吹楠属(horsfieldiawilld.)，为中国狭域分布的特有常绿高大乔木。其种子含油率高，具较高开发利用价值，木材鲜红色，可作高端家具，装饰等用途。现在主要分布在广西、云南以及海南等地区，多处于中国与缅甸、越南的交界处海拔400~450m的丘陵、山谷的荫湿密林中。海南风吹楠为湿润热带雨林的标识性物种，对研究热带雨林区系构成、地理分布、生态习性以及热带雨林地区濒危植物保护生物学具有重要价值。近年来，由于人为破坏和盗伐，海南风吹楠天然资源日渐减少，残存母树不多，已被中国列为二级重点保护植物，濒危树种。

随着分子标记技术的快速发展。目前应用于植物中的dna分子标记主要有扩增酶切片段长度多态性(aflp)、限制性片段长度多态性(rflp)、随机扩增多态性dna(rapd)、序列标志位点(sts)、简单序列重复区间多态性(issr)和简单序列重复长度多态性(ssr)等。issr分子标记试验操作简单、快速、高效，引物的开发费用低。较ssr分子标记，issr引物具通用性和重复性，且issr的产物多态性丰富度远高于ssr和rapd，精确度与rflp相媲美。因此，issr分子标记已广泛应用于植物遗传多样性、分类演化和亲缘关系等方面的研究。

近年来，issr分子标记在研究濒危植物种群遗传多样性和遗传结构中广泛应用。如：张杰等采用issr分子标记技术对蒙古扁桃(prunusmongolica)6个天然种群进行遗传多样性分析；徐刚标等采用issr分子标记技术揭示了伯乐树(bretschneiderasinensis)15个天然种群的遗传多样性和遗传结构；eduado等采用issr分子标记技术研究了ranunculuscabrerensis天然种群的遗传多样性等。但目前国内外关于海南风吹楠的遗传信息匮乏，其天然种群遗传多样性及遗传结构的研究仍处于空白。

因此，对海南风吹楠天然种群遗传信息的研究迫在眉睫，建立一个科学合理的issr-pcr反应体系，探寻最佳处理组合，可为后续的研究提供科学的依据和指导。

技术实现要素：

本发明提供一种海南风吹楠issr-pcr分子标记方法及其专用引物，填补目前利用海南风吹楠issr-pcr分子标记获得种群遗传信息的空白。

本发明是通过这样实现的：一种海南风吹楠issr-pcr分子标记专用引物，其特征在于，所述的专用引物为sedidno.1~9中的任意一条。

一种利用上述所述专用引物的海南风吹楠issr-pcr分子标记方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：1）提取海南风吹楠基因组dna；2）以步骤1）提取的基因组dna为模板，sedidno.1~9中的任意一条为引物，通过issr-pcr扩增反应，获得海南风吹楠天然种群遗传信息。

作为海南风吹楠issr-pcr分子标记方法进一步限定，所述的issr-pcr扩增反应体系为：20μl反应体系中10×pcr缓冲液2μl，mg²⁺浓度为1.5mmol/l，模板dna40ng，dntp为0.4mmol/l，引物浓度为0.7mmol/l，taq酶为0.5u。

作为海南风吹楠issr-pcr分子标记方法进一步限定，

1）当所述的引物选自seqidno.1时，步骤（2）进行issr-pcr扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s，53.6℃退火45s，72℃延伸90s，25-45个循环，72℃总延伸5min；

2）当所述的引物选自seqidno.2时，步骤（2）进行issr-pcr扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s，51.8℃退火45s，72℃延伸90s，25-45个循环，72℃总延伸5min；

3）当所述的引物选自seqidno.3时，步骤（2）进行issr-pcr扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s，47.1℃退火45s，72℃延伸90s，25-45个循环，72℃总延伸5min；

4）当所述的引物选自seqidno.4时，步骤（2）进行issr-pcr扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s，49.2℃退火45s，72℃延伸90s，25-45个循环，72℃总延伸5min；

5）当所述的引物选自seqidno.5时，步骤（2）进行issr-pcr扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s，51.2℃退火45s，72℃延伸90s，25-45个循环，72℃总延伸5min；

6）当所述的引物选自seqidno.6时，步骤（2）进行issr-pcr扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s，52.9℃退火45s，72℃延伸90s，25-45个循环，72℃总延伸5min；

7）当所述的引物选自seqidno.7时，步骤（2）进行issr-pcr扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s，50.5℃退火45s，72℃延伸90s，25-45个循环，72℃总延伸5min；

8）当所述的引物选自seqidno.8时，步骤（2）进行issr-pcr扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s，52.8℃退火45s，72℃延伸90s，25-45个循环，72℃总延伸5min；

9）当所述的引物选自seqidno.9时，步骤（2）进行issr-pcr扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s，40.8℃退火45s，72℃延伸90s，25-45个循环，72℃总延伸5min。

作为海南风吹楠issr-pcr分子标记方法进一步限定，所述的issr-pcr扩增反应条件中循化数优选为30或35。

本发明具备以下良好效果：

本发明较细致地进行了海南风吹楠issr-pcr反应体系的建立与优化，确定了海南风吹楠issr-pcr最佳反应体系。通过建立和优化的海南风吹楠issr-pcr反应体系扩增出的条带清晰度高，稳定性强，多态性丰富的特点。弥补了海南风吹楠遗传多样性的不足，发明成果可应用于海南风吹楠遗传关系、分子辅助育种以及生物地理学等方面，具有很大的科学和应用价值。

附图说明

图1为issr-pcr扩增单因素试验图。其中图1-1为模板mg²⁺浓度对issr-pcr扩增的影响；图1-2为dna浓度对issr-pcr扩增的影响；图1-3为dntps浓度对issr-pcr扩增的影响；图1-4为引物浓度对issr-pcr扩增的影响；图1-5为taq酶浓度对issr-pcr扩增的影响；m表示dl2000marker；1-9为处理组合1-9。

图2为issr-pcr正交试验图。其中m表示dl2000marker；1-16为处理组合1-16。

图3为筛选出适合海南风吹楠issr-pcr扩增的引物扩增结果。其中m表示dl2000marker；1为ubc808，2为ubc809，3为ubc812，4为ubc825，5为ubc826，6为ubc834，7为ubc836，8为ubc840，9为ubc872。

图4为引物ubc808最佳退火温度的确定。其中m表示dl2000marker；1为51.0℃，2为51.2℃，3为51.8℃，4为52.6℃，5为53.6℃，6为54.6℃，7为55.6℃，8为56.6℃，9为57.6℃，10为58.4℃，11为59.0℃，12为59.2℃。

图5为issr-pcr扩增反应体系中不同循环次数的扩增结果。其中1-4分别为循环数25、30、35、40、45；m表示dl2000marker；引物为ubc808。

具体实施方式

以下结合实施例描述本发明一种海南风吹楠issr-pcr分子标记方法及其专用引物，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。

实施例1：海南风吹楠基因组dna提取。

（1）称取海南风吹楠新鲜叶片1g，洗净擦干后剪碎放入研钵，倒入液氮研磨。

（2）将研磨后的粉末装入冷冻的1.5ml离心管，加入65℃水浴后的3×ctab提取液1000μl和32μlβ-巯基乙醇，混匀后置于65℃水浴1h。

（3）将混匀液置于离心机中18℃10000rpm离心12min。后取上清液至另一个离心管中，加入1/10体积的5mnacl轻轻混匀，静置5~10min。

（4）在离心管中加入等体积的氯仿/异戊醇（体积比24：1），混匀后18℃10000rpm离心10min。

（5）取上清液至另一个离心管中，加入1倍体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱中20~30min。

（6）取出样品，4℃10000rpm离心10min。弃上清，留沉淀，用75%酒精清洗，然后4℃10000rpm离心5～6min，室温干燥1h后，加入50mlte缓冲液溶解，4℃保存备用。

实施例2issr-pcr扩增反应体系（20μl）的建立与优化。

根据单因素试验原理，采用梯度试验的方法对issr-pcr反应反应体系中的5个因素（taq酶、dntps、mg²⁺、模板dna及引物浓度）进行筛选和优化，改变初步选择的反应体系中的某一个组分的浓度，其它组分保持不变，单因素筛选各因素的变化值见表1；再根据单因素试验结果，采用l16(4⁵)正交设计对issr-pcr反应的5个因素，即mg²⁺、模板dna、dntps、引物浓度及taq酶在4个水平上进行试验，正交设计见表2，试验设3次重复。反应体系为20μl，除表中所列因素外，每管含有10×pcrbuffer2μl，试验所选引物为ubc808。issr-pcr扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，72℃总延伸5min，4℃保存。

2.1issr-pcr反应体系的单因素实验设计（见表1）。

表1issr-pcr反应体系的单因素试验设计

单因素试验结果见图1，由图1-1可知，当mg²⁺浓度为1.3~1.6mm时，扩增效果最佳；由图1-2可知，当dna浓度为40~60ng时，扩增效果最佳；由图1-3可知，当dntp浓度为0.3~0.4mm时，扩增效果最佳；由图1-4可知，当引物ubc808浓度为0.4~0.8μm时，扩增效果最佳；由图1-5可知，当taq酶为0.4~0.8u时，扩增效果最佳。

2.2issr-pcr反应体系的正交试验设计（见表2）。

表2issr-pcr反应体系的正交试验设计l16(4⁵)

正交试验结果见图2，由图2可知，16个处理均扩增出条带，但1-7号和11-16号处理条带模糊，且条带不多，说明重复性不高。8-9号处理条带清晰，但条带较少。10号处理扩增出的条带明亮清晰，且条带数最多，因此，10号处处理为最佳组合。

实施例3引物筛选及最佳退火温度的确定。

本试验issr-pcr扩增反应引物采用加拿大哥伦比亚大学（ubc）提供的100条通用引物序列，由上海生工合成。

采用建立和优化的issr-pcr扩增反应体系，通过梯度pcr仪进行引物筛选和最佳退火温度确定。筛选出的引物及其最佳退火温度见表3。表3中y代表c和t的简并。

表3筛选出的引物及其最佳退火温度

引物筛选见图3。结果表明以上9条引物扩增出的条带稳定性强，清晰度高，多态性好，适合海南风吹楠issr-pcr反应。

以引物ubc808为例，由图4看出，当引物退火温度低于53.6℃时，issr-pcr扩增条带模糊不清，扩增特异性不好；当引物退火温度高于53.6℃时，issp-pcr扩增的条带较少且弱，扩增效率不高。当退火温度为53.6℃时，issr-pcr扩增的条带多且清晰。因此，引物ubc808的最佳退火温度为53.6℃。同理，其它引物按此原则确定最佳退火温度。

实施例4最佳循环数的确定

根据建立和优化的扩增反应体系以及引物最佳退火温度，进行issr-pcr扩增反应循环数的确定。循环数设定为：25，30，35，40，45。每个循环设置2个重复。

从图5可以看出，当循环数为25，30时出现条带，但暗淡；当循环数为35时条清晰明亮，重复性高；当循环数为40和45时条带虽然清晰，但条带数较少，重复性不高，因此，选择循环数为35比较合适。

本发明是经过海南风吹楠多位研究人员多年的辛勤劳动所得。通过单因素试验和正交试验设计，从模板dna浓度、mg²⁺浓度、taq酶浓度、dntp浓度和引物浓度5因素4水平，对海南风吹楠issr-pcr的扩增反应体系进行优化，并在此基础上确定引物最佳退火温度和pcr扩增循环数。结果表明：20μl反应体系中含有10×pcr缓冲液2μl，mg²⁺浓度为1.5mmol/l，模板dna40ng，dntp为0.4mmol/l，引物浓度为0.7mmol/l，taq酶为0.5u时，且pcr扩增循环数为35，退火温度为最佳退火温度时，扩增效果最好。为海南吹楠遗传多样性的进一步研究奠定理论和技术基础。

　　序列表

<110>广西壮族自治区林业科学研究院

<120>一种海南风吹楠issr-pcr分子标记方法

<130>2017

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agagagagagagagagc17

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agagagagagagagagg17

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gagagagagagagagaa17

<210>4

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

acacacacacacacact17

<210>5

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

acacacacacacacacc17

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

agagagagagagagagctt19

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agagagagagagagagcta19

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

gagagagagagagagayct19

<210>9

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

gatagatagatagata16