Cd33特异性嵌合抗原受体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及编码CD33特异性嵌合抗原受体的核酸和表达嵌合抗原受体的T细胞， 可用于急性髓系白血病的过继细胞治疗药物（adoptive cell therapy, ACT)领域。
【背景技术】
[0002] 嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor, CAR)是人工合成的T细胞受体，由 胞外靶向连接区（由单链抗体或配体），以及T细胞的激活信号结构域（铰链区、跨膜区、胞 内信号转导区）组成。胞外靶向连接区由单链抗体或配体构成，具有特异性结合靶抗原的 功能。铰链区往往采用CD8、CD4或IgG4分子的铰链区。跨膜区由亲脂性的氨基酸序列组 成，往往采用⑶8、⑶28的跨膜区段。胞内信号转导区由⑶3 ζ链或Fc ε R I γ链以及共 刺激信号分子 CD28、CD137(4-1BB)、CD134(0X40)、CD27、IC0S、CD244 等构成。仅含有 CD3 ζ 链或Fe ε R I γ链为第一代CAR，包含1个共刺激信号分子为第二代CAR，含有2个及以上 共刺激信号分子的CAR被划分为第三代。CAR修饰的T细胞通过胞外靶向连接区识别肿瘤 表面抗原，然后通过胞内信号转导区将识别信号传递到细胞内，激活T细胞并发挥杀伤肿 瘤细胞作用。
[0003] CAR能够识别细胞表面未经加工处理的蛋白，不受MHC限制；且CAR与配体之间的 结合力较正常T细胞受体与肽-MHC间的结合力更大；CAR的识别也不受共刺激分子协同表 达的限制。因此，CAR修饰T细胞过继治疗可较好地克服肿瘤细胞的下调MHC分子或者减 少共刺激因子表达等免疫逃避机制。
[0004] 0)33是髓系分化抗原，在85~98 %的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML)细胞中高表达，在正常髓系祖细胞、髓系细胞中低表达。因此，⑶33是AML 有针对性的肿瘤靶抗原。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种CD33特异性嵌合抗原受体及其应用，所 述CAR特异性结合到靶抗原上，并发挥针对AML的细胞毒效应。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种CD33特异性嵌合抗原受 体，嵌合抗原受体由小鼠抗人CD33的单链抗体scFv、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内信号 结构域及CD3 ζ的胞内信号结构串联构成；嵌合抗原受体含有CD33特异性的单链抗体，其 氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示；嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列 如SEQ ID NO. 4所示；嵌合抗原受体的轻链和重链之间由氨基酸序列为Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 的连接肽连接而成。
[0007] 所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 所述嵌合抗原受体以CD8 α铰链区及CD28、CD3 ζ的胞内信号结构域串联而成的 结构域为T细胞刺激信号传导结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0010] 所述的CD33特异性嵌合抗原受体在急性髓系白血病治疗中的应用。
[0011] 本发明的有益效果是：本发明从分泌⑶33杂交瘤细胞中提取RNA，逆转成cDNA，经 通用小鼠 Fab框架区引物扩增出轻链、重链可变区片段，并经重叠延伸PCR技术加入linker 形成⑶33特异性scFv。并将构建的scFv片段克隆到含有信号肽和⑶8-⑶28-⑶3 ζ的慢 病毒表达载体中，包装成携带scFv⑶33-⑶8-⑶28-⑶3 ζ编码基因的慢病毒载体。利用慢 病毒感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。通过流式细胞术、LDH细胞毒性分析实验、 以及ELISA检测T细胞分泌的细胞因子，证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达⑶33的 AML具有特异杀伤作用。因此本发明所述的嵌合抗原受体scFv⑶33-⑶8-⑶28-⑶3 ζ可在 AML治疗中应用。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明所述的⑶33单抗的轻链可变区（VJ、重链可变区（Vh)、以及两者连 接后的单链抗体片段的PCR扩增电泳图（1泳道：2kb核酸分子量标准；2泳道：';3泳道： VH;4 泳道：CD33scFv)。
[0013] 图2是本发明所述慢病毒表达载体scFv⑶33-⑶8-⑶28-⑶3 ζ限制性内切 酶酶切片段电泳鉴定图。其中，1泳道：15kb核酸分子量标记；2泳道：用核酸内切酶 BamH I和Not I双酶切慢病毒表达质粒scFv⑶33-⑶8-⑶28-⑶3 ζ所得到的编码scFv CD33-CD8-CD28-CD3G的DNA片段（Hllbp)和载体片段（7309bp) ;3泳道：未酶切的CAR 载体。
[0014] 图3是本发明所述的慢病毒表达载体示意图，其中逆时针序列是正向基因片段， 顺时针为反向基因片段。
[0015] 图4是流式细胞术检测本发明构建的scFv⑶33-⑶8-⑶28-⑶3 ζ修饰T细胞中 CAR分子的表达。其中，A为未转染的T细胞；B转染CAR的T细胞。
[0016] 图 5 是流式细胞术检测 AML 细胞系 HL-60、THP-I、U937、Kasumi-1、KG-I、KG-la、 K562细胞中CD33靶抗原分子的中位荧光强度。
[0017] 图6是本发明所述的scFv⑶33-⑶8-⑶28-⑶3 ζ修饰T细胞与⑶33阳性的 U937细胞系按效靶比1 :2共培养6小时、72小时后残留的U937细胞其中，CAR为scFv ⑶33-⑶8-⑶28-⑶3 ζ修饰T细胞的实验组；NTD为不加修饰T细胞的对照组。
[0018] 图7是本发明所述的scFv⑶33-⑶8-⑶28-⑶3 ζ修饰T细胞对U937细胞系（效 靶比1 :2)杀伤作用的LDH释放检测。其中，CAR-T为scFv⑶33-⑶8-⑶28-⑶3 ζ修饰T 细胞的实验组；NTD-T为不加修饰的T细胞的对照组。
[0019] 图 8 是本发明所述的 scFv CD33-CD8-CD28-CD3 ζ 修饰 T 细胞与 HL-60、ΤΗΡ-1、 U937、Kasumi-1、KG-1、KG-la、Κ562细胞系按效靶比1 :1共培养12小时后，T细胞释放的 细胞因子IFN-γ (图中A)、IL-2(图中B)、TNF-α (图中C)水平。其中，CD33CAR为scFv ⑶33-⑶8-⑶28-⑶3 ζ修饰T细胞的实验组；NTD-T为不加修饰的T细胞的对照组。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明：
[0021] 本发明的CD33特异性嵌合抗原受体，嵌合抗原受体由小鼠抗人CD33的单链抗体 scFv、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内信号结构域及CD3 ζ的胞内信号结构串联构成；嵌合 抗原受体含有CD33特异性的单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示；嵌合抗原受体 的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示；嵌合抗原受体的轻链和 重链之间由氨基酸序列为 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (如SEQ ID NO. 6所示）的连接肽连接而成。
[0022] 所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0023] 所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0024] 所述嵌合抗原受体以CD8a铰链区及CD28跨膜区和胞内信号结构域、CD3G的胞 内信号结构域串联而成的结构域为T细胞刺激信号传导结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 5 所示。
[0025] 所述的CD33特异性嵌合抗原受体在抗急性髓系白血病药物中的应用。本发明提 供了 CD33特异性的嵌合抗原受体，所述CAR特异性结合到靶抗原上，并发挥针对AML的细 胞毒效应。该嵌合抗原受体以CD33特异性单链抗体、CD8hinge区及CD28跨膜区和胞内信 号结构域、CD3 ζ胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如序列 表中SEQ ID NO. 1所示；其编码的基因序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。
[0026] 所述的嵌合抗原受体⑶33scFv-⑶8-⑶28-⑶3 ζ用于AML肿瘤治疗。该嵌合抗原 受体采用慢病毒感染T细胞，制备嵌合抗原受体修饰的T细胞（CAR-T)，用于AML的细胞免 疫治疗。
[0027] 实施例1 :嵌合抗原受体CD33特异性单链抗体的构建
[0028] 本发明以分泌抗CD33单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系（余鸣等，1994,单克隆抗 体通讯，10 :3,18 - 21)的Fab序列设计合成的抗⑶33scFv。
[0029] (一）提取分泌⑶33单抗杂交瘤细胞系的总RNA :5 X IO6杂交瘤细胞团块中加入 RNA iso Plus (Takara) lmL，吹打混匀。加入200 μ 1三氯甲烷，上下颠倒、涡旋振荡混匀。 4°C，12000rpm，离心5分钟。吸取上清至I. 5ml EP管，加入同体积异丙醇，轻轻上下颠倒混 匀。4°C，12500rpm，离心15分钟。4°C预冷75%乙醇沉淀RNA 2次后，50μ1 DEPC水溶解 总 RNA0
[0030] (二）逆转录合成cDNA第一链：配制PCR反应体系（20 μ 1)如下：01igo d (T) 15Primers: 2 μ I ；M-MLV (200u/ μ I) : I μ I ；dNTP (each 2. 5mM) : I μ I ；DTT (0. 1M) : 2 μ I ； Firststrandbuffer(5X):4μl;CD33-RNA:2μg;DEPC水：补足至20μl。反应条件 ： 37°C，60 分钟，70°C 10 分钟。
[0031] (三）PCR扩增CD33单克隆抗体VL、Vh的基因片段：
[0032] Pl :5' GAC ATT GTG CTC ACC CAG WCT SMH 3'
[0033] P2 :5' CCG TTA GTA CTC CAR BTT KGT SCS 3'
[0034] P3 :5' CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG 3'
[0035] P4 :5, TGA GGA GAC KGT GAC HGT GGT SCC 3，
[0036] 配制 VL、Vh PCR 反应体系（20 μ 1)如下：2XTaq PCR Master MixCTianGen 公 司）：10μ1 ;10μΜ Pl(VL)/P3(VH):lyl ;10μΜ P2(VL)/P4(VH):lyl ;cDNA:lyl ;ddH20:补 足至20 μ 1。反应条件：94°C预变性5分钟；重复如下循环33次：94°C 30秒，52°C 30秒， 72°C 1分钟；最后，72°C延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳分离并回收'、Vh片段。将回收后 的Vi^Vh片段与PMD19-T (simple)载体（Takara公司）通过T4连接酶（Takara公司）进行 连接，送检测序，保留测序正确克隆。连接反应体系及反应条件如下PCR产物/Vh PCR产 物各50叩4]\?19-1'(8；[115)16)载体14 1，301111:;[0111连接反应液5 4 1;(1(1!120补足至10 4 1， 16°C连接过夜。连接产物转化入E. coli DH5a感受态细菌中，37°C过夜培养后，挑取单个 菌落，扩大培养后，用质粒提取试剂盒（Takara公司）提取阳性克隆质粒，经酶切和测序检 测，将正确的质粒名称分别命名为L和H。
[0037] (四）构建 VL-linker-VH方向 anti_CD33scFv 片段
[0038] P5:5' GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CCA 3'<