eruginosa)T1-3,筛选到的诘抗效果显著的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)Tl-3再针对其他真菌病原菌进行诘抗试验（见图1)，进行诘抗效果评估。由 图1可知，在铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)Tl_3目标病原菌几乎无生长，铜绿 假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)Tl_3对玉米大斑病、玉米圆斑病、玉米莖基腐病、玉 米纹枯病、包菜叶腐病、班豆锈病、辣椒叶腐病、京葱锈病、京葱叶斑病病原菌具有显著的抑 制作用。
[0035] 铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)T1-3对不同病原真菌均有不同程度的 抑制作用，具体结果如表1。
[0036] 表IT1-3对不同病原真菌抑制作用
[0037]
[0038] 铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)T1-3的生理活性特征如下：
[0039] 其在LB培养基上菌落呈圆形，表面有小点状凸起，表面湿润，培养前期为黄绿色、 后期呈红褐色，产生可溶性色素。
[0040] 其在PDA培养基上菌落为突起高低不平状，表面湿润，表面粗糙而边缘光滑，淡黄 色，无金属光泽，培养时间增加产生墨绿色，有可溶性色素产生。
[0041] 其可在41°C下生长，而在4°C下不生长。
[0042]C)将铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)T1-3菌株委托上海生工生物工程 股份有限公司进行16SrDNA测序，在NCBI网址中进行BLST比对。结果显示与登录号GB_ KJ819583的Pseudomonasaeruginosa的16SrDNA序列相似度达到99%，结合该菌株的形 态特征和生理生化分析，将该菌株鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)。
[0043]D)铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)T1-3生理生化试分析，结果见表2和 图2。其可产生脲酶、蛋白粉酶、淀粉酶以及嗜铁素等[0044]表2 T1-3菌株的生理生化试验结果
[0047] 注：+为阳性，-为阴性
[0048] 实施例2T1-3菌株在液体培养下对豇豆锈病原菌生长影响
[0049] 液体培养基制备方法：玉米粉10g，黄豆粉5g，葡萄糖5g，蛋白胨2g，NaCllg， K2HPO4Ig,MgSO4 ? 7H20 0? 2g，定容至 1L，自然pH〇
[0050] 马丁氏平板培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，K2HP04lg，MgSO4 ? 7H20 0? 5g，定容至 1L，自然pH，加1%孟加拉红水溶液3. 3mL。使用时每IOOmL培养基加1%链霉素液0. 3mL， 制成平板培养基。
[0051] 试验方法：
[0052] (1)液体培养基中培养：将铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)T1-3接种于 液体培养基中，30°C，摇床转速150r/min，48h;对照组接种3个豇豆锈病菌碟，处理组同时 接种3个5工豆锈病菌碟和包括铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)T1-3的液体培养 液IOOuL;结果见图3 ;
[0053] 液体拮抗试验表明：豇豆锈病菌在液体培养基中正常生长，生长2-3d菌丝量不断 增加至粘稠状，而加入诘抗菌铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)T1-3菌液后，豆工豆 锈病菌丝明显减少，培养液依然较澄清。
[0054] (2)马丁氏平板培养基上培养：将对照组和处理组分别接种于不同的200mL三角 瓶液体培养基中，30°C，150r/min培养48-72h，分别进行梯度稀释涂布于10 2, 10 3, 10 4马 丁氏平板培养基上28°C48-72h，观察真菌生长情况；结果见图4。
[0055] 在马丁氏培养基上培养，未加拮抗菌的豇豆锈病病原菌大量生长，而加了拮抗菌 后，拮抗菌大量繁殖，平板上未有正常菌丝进行生长。说明在此液体培养条件下，拮抗菌 T1-3可以很好抑制豇豆锈病病原菌的菌丝生长。
[0056] 实施例3T1-3菌株菌剂的制备
[0057] 绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)T1-3接种到LB液体培养基中，在30°C， 130r/min下震荡培养24h，形成种子液。
[0058] 再将种子液按1:400的体积比例接种到发酵罐中的培养料中进行发酵生产，发酵 罐的基本工作参数为：温度：30-35°C，搅拌速度：130r/min，pH:6. 8-7. 2,溶解氧：30%，罐 压：0. 04MPa。24小时后终止发酵，然后6000r/min离心lOmin，取沉淀物用无菌水稀释制成 菌剂。检测得菌剂中活菌的浓度为IXIO9-IXK^CFU/mL。
[0059] 制成的菌剂可以用于对玉米常见病害及豇豆锈病等病害的生物防治。
【主权项】
1. 一种铜绿假单胞菌，其分类命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa) Tl-3， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I 号院3号中国科学院微生物研究所，邮编为100101，保藏编号为：CGMCC No. 10433,保藏日 期为2015年01月23日。2. 权利要求1所述的铜绿假单胞菌在防治玉米大斑病中的应用。3. 权利要求1所述的铜绿假单胞菌在防治玉米圆斑病中的应用。4. 权利要求1所述的铜绿假单胞菌在防治玉米茎基腐病中的应用。5. 权利要求1所述的铜绿假单胞菌在防治玉米纹枯病中的应用。6. 权利要求1所述的铜绿假单胞菌在防治包菜叶腐病中的应用。7. 权利要求1所述的铜绿假单胞菌在防治豇豆锈病中的应用。8. 权利要求1所述的铜绿假单胞菌在防治辣椒叶腐病中的应用。9. 权利要求1所述的铜绿假单胞菌在防治京葱锈病中的应用。10. 权利要求1所述的铜绿假单胞菌在防治京葱叶斑病中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种铜绿假单胞菌，其分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas？aeruginosa)T1-3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编为100101，保藏编号为：CGMCC？No.10433，保藏日期为2015年01月23日。该铜绿假单胞菌对玉米、豇豆、辣椒、包菜和京葱等多种植物病害有很好的防治效果，抑菌谱广；该菌繁殖速度快，可人工培育，培养条件简单，抗逆性强，利于生产应用；该菌对人畜无致病性，安全有效，具有良好的开发前景。CGMCC No.1043320150123
【IPC分类】C12R1/385, C12N1/20, A01P3/00
【公开号】CN105087428
【申请号】CN201510400702
【发明人】刘立鹤, 韦祥银, 王哲, 周哲, 张炳如
【申请人】标优美生态工程股份有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年7月9日