Pik3ca基因突变核酸检测试剂盒的制作方法_2

文档序号:9592936阅读:来源:国知局
测试剂盒包括:PCR反应液,所述PCR反应液包括E542K突变检测反应液、E545K突变检测反 应液、E54?突变检测反应液、H1047R突变检测反应液、H1047L突变检测反应液和H1047Y 突变检测反应液,且上述6种检测反应液均包括用于靶多核苷酸扩增的上下游引物和用于 靶多核苷酸检测的探针。本发明针对6种突变(E542K、E545K、E545D、H1047R、H1047L、和 H1047Y)设计了 6种PCR反应液,可检测出PIK3CA基因的6种突变。本试剂盒操作快速、方法 简便、检测灵敏度高、检测范围宽,应用本试剂盒,可以对临床石蜡切片等样本中的PIK3CA 基因突变进行快速检测,为诊断相关肿瘤治疗提供可靠的实验依据。
[0040] 应当理解的是,以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的,并不 能限制本发明。
【附图说明】
[0041] 图1是本发明实施例中提供的阳性样本扩增曲线图;
[0042] 图2是本发明实施例中提供的阴性样本扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0043] 这里将详细地对示例性实施例进行说明,其示例表示在附图中。下面的描述涉及 附图时,除非另有表示,不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例 中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反,它们仅是与如所附 权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置的例子。
[0044] 本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述,各个实施例之间相同相似的部 分互相参见即可,每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处。
[0045] 实施例一
[0046] 本实施例提供一种PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒,所述PIK3CA基因突变核酸 检测试剂盒包括:PCR反应液,所述PCR反应液包括E542K突变检测反应液、E545K突变检测 反应液、E54?突变检测反应液、H1047R突变检测反应液、H1047L突变检测反应液和H1047Y 突变检测反应液,且上述6种检测反应液均包括用于靶多核苷酸扩增的上下游引物和用于 靶多核苷酸检测的探针。
[0047] 进一步的,所述E542K突变检测反应液包括0· 2ymol/L-O· 4ymol/L用于靶多核 苷酸扩增的上下游引物和0.2以111〇1/1-0.4以 111〇1/1用于靶多核苷酸检测的探针,其中,所 述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列为:上游引物:5'-CAATTTCTACACGAGATCC TCTCTCTA-3' ;下游引物:5' -CAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACC-3'。
[0048] 所述E545K突变检测反应液包括0· 2ymol/L-O· 4ymol/L用于靶多核苷酸扩增 的上下游引物和0.2μπι〇1/1-0.4μπι〇1/1用于靶多核苷酸检测的探针,其中,所述用于靶 多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列为:上游引物:5 '-CACGAGATCCTCTCTCTGAAATCAC ΤΑ-3' ;下游引物:5' -CAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACC-3'。
[0049] 所述Ε54?突变检测反应液包括0· 2μmol/L-0. 4μmol/L用于靶多核苷酸扩增的 上下游引物和0.2μπι〇1/1-0.4μπι〇1/1用于靶多核苷酸检测的探针,其中,所述用于靶多 核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列为:上游引物:5' -GAGATCCTCTCTCTGAAATCACTGAT-3'; 下游引物:5' -CAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACC-3'。
[0050] 所述Ε542Κ突变检测反应液、Ε545Κ突变检测反应液和Ε54?突变检测反应液中 所述用于靶多核苷酸检测的探针的碱基序列均为:5'FAM-CAGGAGAAAGATTTTCTATGGAGTCACA GGTAAGT-BHQ13'。
[0051] 所述H1047R突变检测反应液包括0· 2ymol/L-O· 4ymol/L用于靶多核苷酸扩增 的上下游引物和0.2μπι〇1/1-0.4μπι〇1/1用于靶多核苷酸检测的探针,其中,所述用于靶 多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列为:上游引物:5' -ATGAAACAAATGAATGATGCACG-3' ; 下游引物:5' -GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTTTTC-3'。
[0052] 所述H1047L突变检测反应液包括0· 2μmol/L-0. 4μmol/L用于靶多核苷酸扩增 的上下游引物和0.2μπι〇1/1-0.4μπι〇1/1用于靶多核苷酸检测的探针,其中,所述用于靶多 核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列为:上游引物:5' -TCATGAAACAAATGAATGATGCTCT-3' ; 下游引物:5' -GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTTTTC-3'。
[0053] 所述Η1047Υ突变检测反应液包括0· 2μmol/L-0. 4μmol/L用于靶多核苷酸扩增 的上下游引物和0.2μπι〇1/1-0.4μπι〇1/1用于靶多核苷酸检测的探针,其中,所述用于靶 多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列为:上游引物:5' -TCATGAAACAAATGAATGATGCAT-3'; 下游引物:5' -GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTTTTC-3'。
[0054] 所述H1047R突变检测反应液、H1047L突变检测反应液和Η1047Υ突变检测反应 液中所述用于靶多核苷酸检测的探针的碱基序列均为:5'FAM-ATGGTGGCTGGACAACAAAAATG GATT-BHQ13'。以上用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针源于 PIK3CA基因耐药突变区域的引物和探针。
[0055] 本发明针对6种突变伍5421(35451(354^)、!110471?、!110471^、和!11047¥)设计了6 种PCR反应液,可检测出PIK3CA基因的6种突变,同时,本PIK3CA基因突变核酸检测试剂 盒还增加了内标,利用内标监控DNA提取和PCR反应过程,监控反应体系是否有效,防止样 本检测假阴性。本试剂盒操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽,应用本试剂盒, 可以对临床石錯切片等样本中的PIK3CA基因突变进彳丁快速检测,为诊断相关肿瘤治疗提 供可靠的实验依据。
[0056] 进一步,所述Ε542Κ突变检测反应液、所述Ε545Κ突变检测反应液、所述Ε54?突 变检测反应液、所述H1047R突变检测反应液、所述H1047L突变检测反应液和所述Η1047Υ 突变检测反应液内均含有0. 2μmol/L-0. 4μmol/L的用于内标片段扩增的上下游引物和 0. 1ymol/L-O. 2ymol/L的用于检测内标的探针,其中,所述上下游引物和所述探针的碱基 序列分别为:上游引物:5' -GTAATTGCTGAAGCAATCAGGAAA-3';下游引物:5'-ACTTGCCCTGATA TTCTAAAACACAG-3' ;探针:5' -HEX-AACTCGAAGTATGTTGCTATCCTCTGAACAACTAA-BHQ1-3' ;所述 内标片段的碱基序列为:5'-ACCAGAACAAGTAATTGCTGAAGCAATCAGGAAAAAAACTCGAAGTATGTTGC TATCCTCTGAACAACTAAAACTCTGTGTTTTAGAATATCAGGGCAAGTATATT-3 '。
[0057] 进一步,所述E542K突变检测反应液、所述E545K突变检测反应液、所述E54?突 变检测反应液、所述H1047R突变检测反应液、所述H1047L突变检测反应液和所述H1047Y 突变检测反应液内均含有10XPCR反应缓冲液和0. 2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸,其中, 所述10XPCR反应缓冲液包括:pH为7. 5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、 30mmol/L的氯化镁溶液、500mmol/L的氯化钾溶液、体积百分比为0. 2%的曲拉通溶液和体 积百分比为10%的甲酰胺溶液;所述脱氧核糖核苷三磷酸包括:dATP、dCTP、dGTP、dUTP或 dTTP。
[0058] 进一步的,所述PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒中还包括酶混合液,所述酶混合 液中包括1U/μL-5U/μL的耐热DNA聚合酶和0. 05U/μL-0. 2U/μL尿嘧啶DNA糖基化酶。 UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能,利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预 防PCR产物污染的作用。
[0059] 更进一步的,所述PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒还包括PIK3CA阳性对照和 PIK3CA阴性对照,其中,PIK3CA阳性对照:为针对6种突变位点所在区域合成质粒的混合物 以及包含内标目的序列片段的质粒,经本公司合格的试剂盒检测,Ct值< 30 ;PIK3CA阴性 对照:以灭菌水稀释的内标目的序列片段的质粒为待测样本,经本公司合格的试剂盒检测 为阴性后作为阴性对照。
[0060] 实施例二
[0061] 将本PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒用于检测石蜡切片所提取的核酸样本中的 PIK3CA基因突变情况的操作步骤是:
[0062] -、试剂准备
[0063] 1、取出包装盒中的各组分,室温放置,待其温度平衡至室温后,混匀备用;
[0064] 2、根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量,按比例(E542K突变检测反应液反 应液43μL/人份+酶混合液2μL/人份;E545K突变检测反应液反应液43μL/人份+酶混 合液2μL/人份;Ε54?突变检测反应液反应液43μL/人份+酶混合液2μL/人份;H1047R 突变检测反应液反应液43μL/人份+酶混合液2μL/人份;H1047L突变检测反应液反应 液43μL/人份+酶混合液2μL/人份;Η1047Υ突变检测反应液反应液43μL/人份+酶混 合液2μL/人份)取相应量的PCR反应液及酶混合液,充分混匀成PCR-mix,瞬时离心后备 用。
[0065] 二、样本处理
[0066] 1、使用商业化的石蜡切片核酸提取试剂盒提取DNA。
[0067] 2、根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量,每个反应管加入45μLPCR-mix。吸 取已处理的样本DNA、阴性对照、阳性对照各5μL加入PCR-mix中,盖好管盖。
[0068] 三、荧光定
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