含激酶抑制剂的培养基及其应用的制作方法

专利名称：：含激酶抑制剂的培养基及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及多能干细胞内自我更新型的维持。所提供的方法和组分适于培养和分离多能干细胞，例如胚胎干(ES)细胞，特别是包括大鼠、小鼠、牛、绵羊、猪和人的哺乳动物的干细胞。特别地，本发明涉及大鼠、小鼠和人的多能细胞的自我更新培养基以及其配置方法和组成。技术背景在包含血清和白血病抑制因子(LIF)的培养基的基础上如何配制和维持体外多能干细胞培养基已众所周知(Smith等1988，Nature336:688-90)。这些方法曾用于维持来自经许多次传代的"受纳"菌株的多能胚胎干细胞(ES)。如该干细胞通常是在小鼠成纤维细胞的饲养层细胞及其提取物存在下培养，则还支持多能干细胞培养基的维持和自我更新。在这些条件下，将人ES细胞在培养基中经许多次传代维持在多能状态下是可行的。在许多实例中，只可以或最好使用包含血清或血清提取物的培养基维持ES细胞，但是这里不确定，或使用细胞培养条件维持，该细胞培养条件需要其它细胞存在，例如用于维持人ES细胞的成纤维细胞饲养层细胞。但无论是在该培养基中或通过例如饲养层细胞生产的任何不确定的组分都会潜在地干扰或阻碍对ES细胞增殖和细胞分化的研究。这阻碍了ES细胞及其后代的治疗和其它应用的药品好的生产实施的改善。一些确定的ES细胞培养基是已知的，但首选改善过的替代的确定培养基还是需要的。在本申请人以前的申请W0-A-03/095628和在后仍未公布的申请中，在包括(1)gpl30的拮抗剂(例如LIF)和(2)TGF-P超家族的拮抗剂(例如BMP4)或Id信号通道的无血清培养基中培养例如ES细胞的多能干细胞以促进干细胞自我更新用以多次传代。在gpl30信号存在下，TGF-P超家族的拮抗剂或该Id信号通路令人惊奇地提供了自我更新刺激，而不是增殖分化(pro-differentiation)信号。因此，一直需要将多能细胞维持在自我更新状态下的改善效率和用以将多能细胞由饲养层细胞或饲养层条件培养基迁移出的培养基。SatoN等在Nat.Med.2004，Jan10(1)pp55-63描述了糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂和6-溴靛红-3'-月亏(6-b環oindirubin-3'-oxime)对包含培养基的血清中的小鼠和人ES细胞的效果。然而，仅在很短期限观察到了这些效果，时间短得难以得出确定的结论，并且在该研究中使用的不确定培养基中的未知因子的影响可能很明显。本发明的发明者曾尝试，但未能重复出这些结果，事实上却发现了与之相反的效果。制备ES细胞培养基需要尽可能纯的单个培养基组分。然而，大多数培养基组分是细胞因子，其纯度因在细胞系统中制备，还受到由该产品的培养基流体除去潜在的杂质的影响。一些细胞因子的其它问题是它们有效且无毒的浓度范围很窄。具有较宽范围和/或在较高浓度下毒性较小的培养基组分的用处是很大的。细胞因子在储存时具有有限稳定性，因此还在寻找更稳定的培养基组分。本发明的目标是克服或至少改善本领域的一些问题，首选替代的，更首选的是改善了的适于多能干细胞的培养方法和培养基，该培养方法和培养基能够支持所述干细胞的多次传代的自我更新。本发明的另一个目标是提供替代的培养系统，该系统允许细胞分化前体外多能干细胞培养基的维持通过可控制的方式引导。本发明的另一个目标是提供方法和组分，该方法和组分增强了多能干细胞的衍生和分离，且有助于它们由有机难溶物治愈处衍生分离至ES细胞分离，或由仍未分离的多能干细胞衍生分离。
发明内容根据本发明，如ES细胞的多能干细胞培养在培养基中培养，该培养基首选无血清，包括MEK抑制剂与GSK3抑制剂，或MEK抑制剂与FGF受体拮抗剂。首选地，该培养基包括MEK抑制剂、GSK3抑制剂和FGF受体拮抗剂(例如，小分子MEK抑制剂和小分子GSK3抑制剂以及小分子FGFR拮抗剂)。由此促进该干细胞的多代自我更新。因此多能细胞中的GSK3和MEK的抑制作用、MEK和FGF受体信号发送的抑制作用、或GSK3、MEK和FGF受体信号发送的抑制作用提供了自我更新刺激。本发明可应用在许多方面。GSK3与MEK、MEK与FGFR或GSK3，MEK与FGFR的抑制作用的组合可用于生长多能细胞，特别是ES细胞，并且如果它们曾在饲养层上衍生和生长，则用以使多能细胞，特别是ES细胞适应不需要饲养层细胞，通常称作饲养层或饲养层细胞的饲养层细胞层的生长。在培养基中扩增干细胞的方法包括在GSK3抑制剂和MEK抑制剂的存在下，在MEK抑制剂和FGF受体拮抗剂的存在下，或首选在GSK3抑制剂、MEK抑制剂和FGF受体拮抗剂的存在下培养该细胞。制备的培养基可包含一种或多种GSK3抑制剂和MEK抑制剂、一种或多种MEK抑制剂和FGF受体拮抗剂，且可选地，一种或多种GSK3抑制剂、MEK抑制剂和FGFR拮抗剂。可使用GSK3抑制剂和MEK抑制剂、使用MEK抑制剂和FGFR拮抗剂，或使用GSK3抑制剂、MEK抑制剂和FGFR拮抗剂衍生ES细胞。根据本发明的第一方面，在多能细胞中使用的GSK3和MEK的抑制作用，首选所有GSK3、MEK和FGF受体的抑制作用促进该细胞的自我更新。对多能细胞的参考包括但不限于对胚胎干细胞(ES)的参考。包括ES细胞的多能细胞的特性，包括与多能发育阶段相关的多基因表达、分化为代表源动物中存在的所有任何组织类型的细胞的能力，对嵌合体(chimeras)的贡献能力，特别是对嵌合体种系的贡献能力。例如，真多功能细胞，例如ES细胞，表达许多的，或大部分的多能性相关基因Nanog、Oct4、FGF4，Sox-2和碱性磷酸酶。特别地，广泛地将Nanog、Oct4和Sox-2的表达认作提供了明确的初始指示细胞为ES细胞。还广泛地将嵌合体中的种系传递和生成包括自所有三个原胚层(例如内胚层、中胚层和外胚层)的分化细胞的畸胎瘤或畸胎癌的能力认作细胞是ES细胞的明确指示。对于GSK3抑制参考指的是一种或多种GSK3酶的抑制作用。因此GSK3抑制剂可以抑制GSK3酶家族的一种、多种或所有的酶。众所周知，GSK3酶家族包括但不限于GSK3-a和GSK3-(3。曾描述过许多变异体(例如Schaffer等；Gene2003;302(1-2):73-81)。在具体的GSK3-(3受抑制的实施方案中，GSK3-ct抑制剂也是适用的，并且本发明所用抑制剂可抑制两者。很多GSK3抑制剂是己知的，例如抑制剂CHIR98014、CHIR99021、AR-A0144-18、TDZD-8、SB216763禾BSB415286。其它的抑制剂也是己知的并且适用于本发明。另外，曾表征过GSK3-p的活性部位的结构，并且鉴别了与特异性的和非特异性抑制剂相互作用的关键残基(Bertrand等；JMolBiol.2003;333(2):393-407)。可以利用该结构特征轻松鉴别附加的GSK抑制剂。某些实施方案的抑制剂对GSK3-cx和GSK3-(3具有特异性，基本不抑制erk2和cdc2。优选地，该抑制剂具有对人GSK3高于对小鼠erk2禾口/或人cdc2，至少100倍，更优选至少200倍，很优选至少400倍的选择性，测定IC5。值的比率；在此，参考GSK3IC5。值指的是针对人GSK3-a和GSK3-卩的平均值。通过CHIR99021禾BCHIR98014曾得到过好的结果，它们都对GSK3具有特异性。在BennettC等，J.Biol.Chem.，277巻，第34，2002年9月23日，30998-31004页禾P在RingDB等，Diabetes,52巻，2003年3月，588-595页中，描述了GSK3抑制剂实例。CHIR99021的适宜使用浓度为0.01至100，优选O.l至20，更优选0.3至IO微摩尔。还可使用RNA介导干扰(RNAi)方便地抑制GSK3。通常，将与GSK3基因全部或部分互补的双链RNA分子引入多能细胞，由此促进GSK3编码mRNA分子的特异性降解。该转录后机制导致减少或破坏了靶向GSK3基因的表达。已知使用RNAi抑制GSK3的合适技术和方案。参考MEK抑制剂在本说明中指的是通常的MEK抑制剂。因此参考MEK抑制剂指的是蛋白激酶的MEK家族的包括MEK1、MEK2禾nMEK3的任何成员的抑制剂。MEK抑制剂可以抑制MEK激酶家族一种、多种或所有。已为本领域所知的合适的MEK抑制剂实例包括但不限于MEK1抑制剂PD184352和PD98059、MEK1和MEK2的抑制剂U0126和SL327，和那些在Davies等(2000)中讨论的(DaviesSP,ReddyH3CaivanoM,CohenP.Specificityandmechanismofactionofsomecommonlyusedproteinkinaseinhibitors.BiochemJ.351,95-105)。特别地，曾发现当与其它已知MEK抑制剂相比较时，PD184352具有高度特异性和潜能。其它MEK抑制剂和MEK抑制剂类别在Zhang等(2000)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters;10:2825-2828中有描述。还可使用RNA介导干扰(RNAi)方便地获得MEK激酶的抑制作用。通常，将与MEK基因全部或部分互补的双链RNA分子引入多能细胞，由此促进MEK编码mRNA分子的特异性降解。该后转录机理导致减少和破坏了耙向MEK基因的表达。已知使用RNAi获得MEK抑制作用的合适技术和方案。已知许多识别包括GSK3抑制剂和MEK抑制剂的激酶抑制剂的实验。例如Davies等(2000)描述了激酶实验，激酶在多肽底物和放射性标记ATP存在下培育。通过该激酶该底物的磷酸化导致该标记并入该底物中。保持磷酸纤维纸上的每个反应试样量不变，并在磷酸中清洗以除去游离的ATP。随后测定培育后的该底物的活性，且提供激酶活性指示。利用该实验可容易地确定在选用的激酶抑制剂存在和不存在下该激酶的相对活性。Downey等.(1996)JBiolChem.;271(35):21005-21011也描述了用于识别激酶抑制剂的激酶活性实验。参考成纤维细胞生长因子(FGF)受体(FGFR)拮抗剂指的是FGF受体的多肽或小分子或其它拮抗剂，通常抑制FGFR1和/或FGFR2。因此，FGF受体拮抗剂可为FGF受体家族中的一种、多种或全部的拮抗剂，该FGF受体家族包括但不限于FGFR1、FGFR2、FGFR3禾卩FGFR4。FGF受体家族成员通常包括三个类免疫球蛋白辖区，并代表酸性氨基酸区(酸性单元—theacidicbox)，该区可参与FGF家族成员与FGF受体的结合。在一些例子中，仅包括两个类免疫球蛋白辖区的分子也可起到FGF受体的功能。己知许多FGFR拮抗体，包括但不限于SU5402和PD173074。已知许多FGFR拮抗体，例如SU5402和PD173074。SU5402的适合浓度在微摩尔范围内，例如0.1-20pM，优选0.5-10pM，特别地1-5pM。我们曾发现PD173074可代替SU5402，并且在低约1/100的浓度下达到全效，与其对FGF受体较高亲合性相一致。因此，PD173074的适宜浓度为1-200nM,优选5-100nM，特别地为10-50nM。还知道通过显性失活突变体FGR受体的转基因抑制FGR受体发送信号。然而，在本发明的实施方案中，优选使用小分子拮抗剂，而非转基因基拮抗作用。已知识别FGF受体拮抗剂的合适实验。例如在通过FGF受体发送信号激活报告基因的细胞系可用于评价潜在的拮抗剂的活性。曾发现MEK抑制剂与GSK3抑制剂，且还优选FGF受体拮抗剂的组合体的使用改善ES细胞的增殖是有优势的。在优选实施方案中，使用约0.1pM至约25pM的MEK抑制剂。还优选使用约O.lpM至约5jiM的MEK抑制剂，更优选0.2|iM至2jiM。根据本发明特别优选的培养基包括0.8pMPD184352、3pMCHIR99021和/或3^MSU5402。特别优选的培养基包括0.8pMPD184352、3|xMCHIR99021和3jiMSU5402，优选在N2B27培养基中。可优化SU5402的浓度以适合不同的多能细胞系，通常为l-5)iM(例如2pM)。在下面的例子中，我们在GSK3抑制剂，连同MEK抑制剂和在特别实施例中，FGF受体拮抗剂的存在下培养了小鼠ES细胞以促进自我更新。在其它具体实施例中，促进培养基中的小鼠多能细胞自我更新的方法包括抑制GSK3和MEK，或抑制GSK3、MEK和FGF受体。可选地，还可采用激活gpl30下游信号发送，通过抑制GSK3和MEK以进一步促进自我更新。激活gpl30下游信号发送的分子通常指的是gpl30活化剂或gpl30拮抗剂。一个或多个gpl30下游信号发送通路的激活可使用通过作用于gpl30的细胞因子获得，例如细胞因子或其它LIF受体拮抗剂。能够通过作用于gpl30，并因此能够激活gpl30信号转导的细胞因子包括，但不限于LIF、睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养素、抑瘤素M(oncostatinM)、IL画6与sIL-6(IL-6plussIL-6)受体、hyperIL-6和IL画ll。合适的细胞因子包括可结合和/或激活通过gp130的信号发送的模仿剂、融合蛋白或嵌合体。在血清存在下很好地确立了通过作用于gpl30的细胞因子的角色，但那些细胞因子在不存在血清下维持未分化细胞的能力是有限的。本发明的优势是在GSK3抑制剂、MEK抑制剂和可选地，FGF受体拮抗剂的存在下，多能细胞可以在确定的培养基中生长。与使用GSK3抑制剂、MEK抑制剂和FGF受体拮抗剂的组合体相关的特别优势是不需要包含例如胰岛素、N2B27或gpl30拮抗剂(例如LIF)的其它生长因子的培养基。本发明因此使替代或改善ES细胞在无血清、血清提取物、饲养层细胞和饲养层细胞提取物的培养基中的培养成为可能。曾报道过所述胚胎干细胞来自许多哺乳动物源，包括小鼠(Bradley等1984，Nature309:255-56)、美洲水貂(MoIReprodDev1992，Dec;33(4):418-31)、猪和羊(JReprodFertilSuppl1991;43:255-60)、仓鼠(DevBiol1988，May;127(1):224-7)和牛(RouxArchDevBiol1992;201:134-141)。本文中的具体实施例使用原初生长产物(primaryoutgrowth)的小鼠和人ES细胞以及大鼠细胞。将认识到本发明的方法和组分适应于培养其它哺乳动物多能细胞培养基，因此包括特别是人的灵长类、特别是小鼠和大鼠的啮齿动物，以及禽类的特别是ES细胞的多能干细胞。本发明的第二方面提供培养多能细胞，特别ES细胞，以便促进自我更新的方法，包括将细胞维持在包括如下的培养基中(1)GSK3抑制剂；和(2)MEK抑制剂。优选地，该方法包括将细胞维持在包含如下的培养基中(1)GSK3抑制剂；(2)MEK抑制剂；和(3)FGF受体的拮抗剂。本发明的方法通常用于生长多能细胞，包括在无血清和无血清提取物的培养基中生长ES细胞，该细胞之前已经在血清或血清提取物存在下传代。优选地，该方法还在无饲养层细胞和/或饲养层细胞提取物存在下实施。例如实施的ES细胞培养包括如下步骤-维持ES细胞在培养基，或在饲养层上保持多能状态；-使ES细胞传代至少一次；-由该培养基提取该血清或该血清提取物并提取该词养层(如果存在)，以便该培养基无饲养层、血清和血清提取物；和-随后在GSK3抑制剂、MEK抑制剂和可选地，FGFR拮抗剂存在下，维持ES细胞处于多能状态。另外优选地，该细胞可在MEK抑制剂、GSK3抑制剂和gpl30下游信号发送通路活化剂的存在下维持在多能状态下。本发明还提供了得到ES细胞的转染群体的方法，包括-转染具有编码选择性标记的结构的ES细胞。-将ES细胞放在培养板上；-在GSK3抑制剂、MEK抑制剂和可选的FGFR拮抗剂存在下培养ES细胞；和-选择表达选择性标记的细胞。另外优选地，该细胞可在MEK抑制剂、GSK3抑制剂和gpl30下游信号发送通路活化剂的存在下培养。选择性标记会编码抗生素抗性、细胞表面标记或例如在EP-A-0695351描述的其它选择性标记，并且优选地包括核苷酸序列，该核苷酸序列编码有效地链接到优先在所需细胞中表达该选择性标记的促进剂的选择性标记。在另一实施方案中，本发明提供培养多能的细胞(尤指ES)的方法，该方法包括将单个细胞转移至培养皿，例如培养板上的单个孔，并在MEK抑制剂、GSK3抑制剂，和优选地FGFR拮抗剂存在下培养该细胞，以便到多能细胞(尤指ES)无性群体，它们中所有的都是单个细胞的后代。可选地，还可在gpl30下游信号发送通路活化剂存在下培养该细胞。一旦得到稳定均质的ES细胞培养基，可改变培养基条件以指引该细胞分化为选自外胚层、中胚层或内胚层的细胞命运的一种或多种细胞类型。添加或提取细胞因子和信号发送因子使特异性分化细胞群体高效衍生成为可能。通过在通过作用于gp130的细胞因子、MEK抑制剂和GSK3抑制剂存在下维持ES细胞，随后提取该细胞因子，同时维持GSK3抑制剂和MEK抑制剂和/或添加另外的能够指引分化的信号发送分子，获得细胞向非神经外胚层命运的分化。替代地，可在MEK抑制剂和GSK3抑制剂存在下维持细胞，并随后通过提取一种或两种抑制剂和/或添加能够指引发化的信号发送分子指引分化。如上所述的方法全部可选地包括得到和/或分离该方法的产品的分化细胞。本发明的另外方面提供细胞培养基。一种用于多能，特别是ES细胞的自我更新的培养基，该培养基包括GSK3抑制剂、MEK抑制剂和可选地，FGFR拮抗剂。该培养基还可选地gpl30下游信号发送通路的活化剂。本发明的另一种培养基是干细胞培养基，包括GSK3抑制剂、MEK抑制剂和可选地，FGFR拮抗剂。所有培养基优选地还包括基础培养基。在一些优选实施方案中，所有培养基不含gpl30拮抗剂，因此优选不含LIF。本发明提供无血清和血清提取物的培养基，这样的培养基包括-基础培养基；-MEK抑制剂；-GSK3抑制剂；禾口-铁转运体；该培养基可选地无血清和血清提取物。该培养基优选地还包括FGFR拮抗剂。该培养基还可选地包括gp130下游信号发送通路的活化剂。多能干细胞，特别是大鼠或小鼠细胞用优选培养基可不含血清和不含gp130拮抗剂，并且包括MEK抑制剂、GSK3抑制剂，和FGF受体拮抗剂。可如本文所描述的制作培养基组分替代物。基础培养基是提供细胞用碳和/或维生素和/或矿物质的基本源的培养基。基础培养基通常不含蛋白质并且不能支持细胞的自我更新。铁转运体提供铁源或提供由培养基吸收铁的能力。适宜的铁转运体包括铁传递蛋白和脱铁运铁蛋白(apotransferrin)。优选该培养基还包括一种或多种胰岛素或类胰岛素生长因子和清蛋白(优选重组体)或清蛋白替代物，并且不含饲养层细胞和饲养层层细胞提取物。该培养基还包括凋亡抑制剂或任何促进多能细胞在培养基中的维持的其它组分。本发明的特别培养基包括MEK抑制剂、GSK3抑制剂、胰岛素、清蛋白和铁传递蛋白，具有或不具有另外的基础培养基。在该培养基中，可可选地包括LIF，并用其它的gpl30信号发送活化剂替代，尽管优选的培养基包括结合细胞因子的gpl30受体LIF，但其适合的浓度通常为10U/ml至1000U/ml，更优选地为50U/ml至500U/ml，最好是在100U/ml左右。下文中更详细地描述GSK3和MEK抑制剂。本发明还提供由胚泡衍生多能细胞的方法，包括(1)获得胚泡；(2)在MEK抑制剂、GSK3抑制剂和可选地，FGF受体拮抗剂存在下，培养胚泡，以得到内细胞群；(3)分离该内细胞群；(4)由分离的内细胞群分离一种或多种细胞；禾口(5)在MEK抑制剂、GSK3抑制剂和可选地，FGF受体拮抗剂存在下，培养该分离的一种或多种细胞。可选地，该分离细胞可在MEK抑制剂、GSK3抑制剂和gpl30下游信号发送活化剂存在下培养，也可存在FGF受体拮抗剂。优选地，该方法包括在LIF中培养胚泡，更优选地为2至4天的期间。该分离的细胞优选在无血清培养基中培养。通常，作块状再培养这些细胞。该胚泡也优选在无血清培养基中培养，可选地不存在BMP受体拮抗剂。另外根据本发明优选地，在贴壁培养基中培养细胞，可通过在培养基底物上加入细胞粘附蛋白来促进。还优选根据本发明在单层培养基中培养多能细胞，尽管细胞在悬浮培养基中生长，或作为前代细胞聚合体生长是任选的；细胞还可在珠或在例如膜或其它3维结构的其它适合的储料支架上生长。本发明的实例中使用的培养基优选地还包括血清白蛋白。这可以纯化的或优选重组形式使用，并且如果以重组形式，这具有不含潜在污染因子，细胞因子等的优势。该培养基不需要包含血清白蛋白，并且该组分可忽略，或用其它批量的蛋白，或用如Wiles等所述的合成聚合物(聚乙烯醇)替代。本发明的特别优选培养基为完全确定的一种。该培养基不包含任何未确定的组分，即含量未知或可能包含未确定的或非特异性的变化因子。使用完全确定的培养基的优势是可得到高效且-致的培养和随后操作多能细胞的方案。另外，发现通过较高的效率和更大的可预测性，维持细胞在多能状态下是可获得的，并且当使用响应分化信号的确定培养基在培养的细胞内引入分化时，比当使用未确定培养基时更为均质。本发明还提供作为培养基用添加剂的浓缩物和成套组分，用于培养基的制备，所得培养基符合本发明。本发明的.套组分包括第一和第二组合体(container),第一组合体包含MEK抑制剂，第二组合体包含GSK3抑制剂。优选地，该成套材料包括含FGF受体拮抗剂的第三组合体。该成套材料还，可选地，包括含gpl30下游信号发送活化剂的另一个组合体。优选配制成套材料，由此将每一种组合体的内容物加到培养基，以便得到本发明的培养基。这些成套材料优选包含它们各自组分浓縮的原液。本发明的方法还包括得到分化的细胞的方法，该方法包括培养所述多能细胞，并且允许或引起该细胞分化，该细胞包含选择性标记，比较其它细胞类型，该标记能够在所需的包括多能干细胞的分化细胞内差异性表达，由此选择性标记的差异表达导致所需分化细胞的优先分离和/或残存和/或分裂。选择性标记可在所需的分化细胞屮表达，但不在其它细胞类型中表达，或表达水平会在所需分化细胞和其它细胞类型之间有所区别，由此允许对该选择性标记的表达进行选择。该分化细胞可以是组织干细胞或祖细胞，并且可以是终末分化细胞。通常本发明还延伸到通过本文所述的任何方法得到的细胞。可在毒品发现实验中使用本发明的细胞。本发明的细胞还用于细胞疗法，因此本发明的方法包括使用MEK抑制作用和GSK3抑制作用，可选地，FGF发送拮抗剂信号的组合体，以衍生和/或维持多能细胞，由此衍生用于细胞疗法的细胞，并在细胞疗法中使用。可选地，在不存在gpl30下游信号发送活化剂时使用该组分。本发明的另一些方面涉及使用MEK和FGF受体的抑制作用，可选地与GSK3抑制作用组合体用以促进多能细胞的自我更新。我们曾发现MEK抑制剂和FGF受体拮抗剂的组合体在不存在添加的细胞因子或生长因子时，有效地支持多能细胞在无血清培养基中的生长。因此，本发明的另一个方面提供包括MEK抑制剂和FGF受体拮抗剂和培养基。MEK抑制剂和FGF受体拮抗体与本发明的其它方面所述相关。类似地，该培养基还包括与本发明其它方面相关的附加组分或因子。本发明的另一个方面提供使用MEK抑制剂和FGF受体拮抗体制作多能细胞用培养基。本发明还提供培养多能细胞和得到多能细胞转染群体的方法，该方法可方便地如所述实施用于本发明的其它方面。因此，本发明的另一个方面提供培养多能细胞以促进自我更新的方法，包括在含MEK抑制剂和FGF受体拮抗体的培养基中维持细胞。本发明提供培养多能细胞的相关方法，包括如下步骤-使ES细胞在培养基中维持多能状态，可选地培养基有饲养层；-使ES细胞传代至少一次；-自培养基提取血清或血清提取物(如果存在)并提取该饲养层(如果存在)，以便该培养基不含饲养基、血清和血清提取物；以及-随后在MEK抑制剂和FGF受体拮抗体存在下使ES细胞维持在多能状态。本发明的另一方面包括得到ES细胞转染群体的方法，包括-转染具有编码选择怀标记的结构的ES细胞；-将ES细胞放在培养板上；-在MEK抑制剂和FGF受体拮抗体存在下培养ES细胞和-选择表达选择性标记的细胞。还提供不含血清和血清提取物的细胞培养基和包括-基础培养基；-MEK抑制剂；-FGF受体拮抗体；和-铁转运体。MEK抑制剂和FGF受体拮抗剂的组合体还用于衍生新的多能细胞系。因此，本发明的另一个方面提供由胚泡衍生多能细胞的方法，包括(1)得到胚泡；(2)在MEK抑制剂和FGF受体拮抗体的存在下培养胚泡，以得到内细胞群；(3)分离该内细胞群；(4)分离自该分离的内细胞群的寸或多个细胞；和(5)在MEK抑制剂和FGF受体坫抗体存在下培养该分离的细胞。本发明还包括含第一和第二组合体的成套材料，第一组合体包含MEK抑制剂，第二组合体包含FGF受体拈抗体。该成套材料还可包括如本文所述的其它组合体和/或组分。本发明的其它方面提供了MEK抑制剂和FGF受体拮抗体在促进多能干细胞，特别是表达Nanog的多能千细胞的自我更新中的用途。相关方面提供扩增干细胞群的方法，包括在MEK抑制剂和FGF受体拮抗体存在下培养干细胞。本发明的许多优势可参考上文或足VL而易见的。细胞培养基组分可以确定是相对来说无毒性，并有渗透性。特别地，即与蛋白细胞因子的纯化相比较，用于本发明的具体实施方案的该MEK抑制剂、GSK3抑制剂和FGFR拮抗体更容易纯化。制作重组蛋白成本很高，因此生产具有更宽的有效浓度范围的小分子培养基组分成本更低，储藏更稳定。如下陈述的具体实施方案在无血沽的完全确定的培养基中使用CHIR99021、PD184352和可选SU5402的组合休，并使很少分化的小鼠ES细胞自我更新。偶尔会报道在BMP存在下培养ES细胞时有一些神经形成。是在本发明的具体实施例中却未发现。现本发明在具体实施例中进一歩通过下图例证性描述图1:在多能ES-NS杂种群生成的PD184352的效果分析。针对RHxNSTGFP融合的红和绿荧光的(A-C)-FACS分析。(A)PEG处理后融合混合24小时；(B)对控制(gate)在A内的FACS分类杂种的纯度检查；(C)将A内的分类杂种放于培养皿，将所形成的群记录为群百分比/培养杂种。这些记录考虑了FACS分类细胞的纯投；(D)数据汇总。(E)杂种群形态实例。图2:根据本发明衍生和维持的小鼠ES细胞，表明通过这些ES细胞的嵌合体贡献的高效率；图3:根据本发明生长的传代4次的小鼠细胞；图4:根据本发明生长的小鼠ES细胞为Oct4阳性。在实施例中，术语2i培养基或2i川于表明包括MEK抑制剂和FGF受体拮抗体的培养基。术语3i培养基或3i川于农明包括MEK抑制剂、GSK3抑制剂和FGF受体拮抗体的培养基。具体实施例方式GSK-3(3抑制剂、MEJC抑制剂、培养站和LiS细胞自我更新小鼠和人ES细胞在许多条件下生长，除另有声明外使用N2B27培养基，无论有无GSK-3P抑制剂、CHIR99021、AR-AO144-18、SB216763和SB415286以及MEK抑制剂PD184352的存在。制备N2B27培养基N2100x原液。10ml:将lml鹏岛素(W终浓度2.5mg/ml)与lml转铁蛋白(最终浓度10mg/ml)、0.67mlBSAC设终浓度5mg/ml)、33jil孕酮(最终浓度2pg/ml)、100jil腐胺(最终浓度1.6mg/ml)、10pl亚硒酸钠(最终浓度3jxM)和7.187mlDMEM/F12混合。在4。C下储存并在一个月内使用。DMEM/F12-N2培养基将lmlN2100x原液加至100mlDMEM/F12。DMEM/F12培养基中的N2的每一种组分的最终浓度胰岛素，25pg/ml;转铁蛋白，100|_ig/ml;孕酮，16ng/ml;腐胺，16(ig/mh亚硒酸钠，30nM;BSA，50吗/ml。在4"C下储存并在一个月内使用。Neurolbasal/B27培养基将2mlB27禾U0.5-lmI的200mML-谷氨酰胺加入lOOmlNeurolbasal(TM)培养站。在4。C下储存并在一个月内使用。N2B27培养基按1:1比率将DM1':M/F12-N2培养基与Neurolbasal/B27培养基混合。加(3-巯基乙醇，至0.1M原液达O.lmM的最终浓度。在4。C下储存并在一个月内使用。实施例1在无血清培养基中，MEK抑制剂加GSK-3卩抑制剂足以支持小鼠ES细胞都在(1)N2B27培养基和(2)完企确定的培养基中的自我更新一数据未显示。在包含MEK抑制剂、GSK-3[3抑制剂和LIF(数据未显示)的培养基中进一步改善ES细胞的自我史新。实施例2PD184352(MEK抑制剂)增加了ES细胞内的Nanog级别(数据未显示)。另夕卜，用PD184352处理的Nanog-/-ES细胞不能表现出增强了ES细胞的自我更新。事实上，这些细胞分化了(数据未显示)。这表明通过PD184352增强ES自我更新表型是迪过Nanog介导的。PD184352在重编程中的作用还g^i过在细胞融合情况下确定NS细胞向多能性转换来研究的。融合基本上表达dsRed荧光蛋白和潮霉素抗体的RHES细胞为胎儿衍生神经系统干细胞(NSTGFP)，该NSTGFP表达了融合蛋白TauGFP经IRES链接到嘌呤霉素抗体。在一种融合中，RH细胞在融合前和融合后用3pMPD184352处理3天。在该控制中，不添加PD184352。经处理过和未处理过的原杂种在融合后24小时分类，并随后放于培养皿(图IA-C)。3天后向ES培养基添加潮霉素和嘌呤霉素选择。记录表达dsRed2和GFP荧光性并且显示ES细胞形态的群(图1D和E)。结果表明PD184352增强了45倍的ES-NS杂种群形成。另人感兴趣的是，在经PD184352处理的RH细胞内，对应培养杂种形成的杂种群百分比，与Nanog过表达ES细胞相比较刚好低了一半(2.25%比4%)。该结果表明PD184352不仅增强了ES细胞自我更新，还增强了该细胞融合情况下的重编程。该作用可能是通过处理过的RH细胞内Nanog级别的增加而介导的。因此，如果内源性地表达Nanog，则随后MEK抑制剂可用于上调Nanog并获得例如增强重编程的关联作用。实施例3在通过GSK-3抑制剂CHIR99021和MEK抑制剂PD184352补充的培养基中培养人ES细胞。向该培养基中加入LIF进一步改善了细胞的增殖(数据未显示)实施例4在通过GSK-3抑制剂CHIR99021和MEK抑制剂PD184352补充的培养基中培养小鼠ES细胞。向该培养基中加入LIF进一步改善了细胞的增殖(数据未显示)实施例5在包含CHIR99021、PD184352和SU5402的培养基中生长小鼠ES细胞和人ES细胞，按如下制备三种抑制剂/拮抗剂的浓度:<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>制备DMEM/F12-N2培养基将lmlN2100x原液加至100mlDMEM/F12(Gibco42400-010)。DMEM/F12培养基中的每一种N2组分的最终浓度为<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>将2mlB27(Gibco17504-044)禾B1陽2ML-glutamine(TC储存1:100)加入100mlNeurobasal培养基(Gibco21103-049)。制备N2B27培养基以1:1比率将DMEM/F12-N2培养基与Neurobasal/B27培养基混合。用该培养基稀释所有化合物和生长细胞。该培养基用于维持人ES细胞和自129株小鼠的ES细胞的衍生和维持，以及还用于非受纳小鼠株CBA和C56/BL6的ES细胞的衍生。实施例6在FGF受体抑制剂和MEK抑制剂存在下培养小鼠ES细胞。分别使用选择性药理学抑制剂SU5402和PD184352抑制FGF受体酪氨酸激酶，且通过MEKl/2活化Erk1/2。发现在不提供BMP4时，加入任何一种抑制剂都足够使含LIF的N2B27培养基内的ES细胞繁殖力增强(数据未显示)。未分化的培养基在这些条件下可连续传代，同时维持多能性标记Oct4、Nanog禾QRexl的表达。神经约束(Neuralcommitment)未发生，尽管该ID基因的表达远低于在含LIF加BMP的培养基中维持的表达。表面皿培养的ES细胞在未加入LIF的N2B27培养基中，即通常引起有效的神经约束的情况下，如果加入SU5402或PD184352，保持Oct4阳性和Soxl阴性达几天(数据未显示)。然而这些细胞总是传代后分化和/或死亡。为减少潜在的毒性副作用，我们使用低2.5倍的剂量并将两种抑制剂组合体在一起。在含0.8|iMPD184352和2(iMSU5402的N2B27中，最初观察到一定程度的分化，但ES细胞继续存在，并且传代后扩增(数据未显示)。在这两种抑制剂(20条件下，比LIF存在的条件下，生命力较低和群体倍增时间变慢，但有效地抑制了分化。该发现表明ES细胞自我更新的最低要求可以转向自FGF受体发送的分化信号和Erk信号发送，同时避免损害细胞生长和发育。实施例7我们推断ES细胞在2i培养基中生长减少归于糖原合酶激酶3(GSK-3)活性增加，由此通过pErk的Rsk下游释放了抑制性磷酸化作用。CHIR9卯21是经充分表征的高选择性小分子GSK-3抑制剂，其不与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)在完全阻止GSK-3活性的浓度下交叉反应。当在血清存在下将CHIR99021(3pM)加至培养基时，我们发现其实际上促进了分化，即使存在LIF。在无血清N2B27培养基中，该分化响应减少，并且一些群几天未出现形态分化。然而，传代后未分化的细胞未继续存在。通过两种其它广泛使用的GSK-3抑制剂SB216763和SB415286，得到相类似的结果，但两者都表现出对ES细胞的一定程度的毒性。然而，当将CHIR99021与2i组合体时，分化响应完全消失。并且CHIR99021调控对2i的响应，以便ES细胞呈紧密三维群体生产，而不是通常在LIF加血清/BMP或在2i中看到的平坦单层。在这三种抑制剂中的分化是可以忽略的并且ES细胞快速增殖。最重要的未分化群传代后高效生长。两个独立的亲本品ES细胞系E14Tg2a和CGR8的衍生物表明了在3i中的长时间强力扩增，而很少或无明显分化(数据未显示)。它们表达Oct4、Nanog禾BRexl，并且不显示谱系标记Gata4、Soxl或brachyury的可察觉到的表达(数据未显示)。在大批培养基中，ES细胞在3i中如在LIF加BMP中一样，以可比的倍增速度扩增，并且该Oct4-GFP阳性未化细胞的比例保持高于卯％。因此，3i培养基可用于在无血清和不添加细胞因子时，培养ES细胞，无分化。实施例8对培养基培养方式是否充分支持ES细胞自我更新的严格测试是通过单个细胞形成未分化群进行的。单个细胞沉积后，在N2B27和3i存在时的克隆效率为25%(98/384)，高于用LIF和BMP(11%,23/192)-数据未显示。这些群表达Oct4-GFP，并且如未分化ES细胞一样是可传代的。因此，包含MEK抑制剂、FGF受体抑制剂和GSK3抑制剂的培养基能够支持由单个细胞衍生的未分化ES细胞群的形成。实施例9我们检查3i是否适合新的ES细胞直接由胚胎衍生，或反映己确立(细胞)株的变化。将自受纳129株的胚泡直接置于涂布凝胶的塑料上的N2B27和3i中培养5天。随后分裂和再培养内细胞群，自12个胚胎中的7个得到ES细胞群体。扩增三个并注入胚泡。它们都具有很高的嵌合性和种系传递性(表1)。随后，由C57BL/6和非受纳CBA和MFI株衍生了多个ES细胞，这表明了3i有助于由外胚层向ES细胞的传递。我们得出结论3i将ES细胞由对外源LIF和BMP/血清的无选择地需要，或损害生长潜力中解放出来。表1:在3i中衍生的ES细胞对嵌合体和幼体后代的贡献<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>*通过毛色检测的129/01aES细胞基因组的嵌合性和传递性。#假定为XX的ES细胞。因此，ES细胞维持在GSK3抑制剂和MEK抑制剂的组合体、MEK抑制剂和FGF受体拮抗体，或可选GSK3抑制剂的组合体，MEK抑制剂和FGF受体拮抗体的组合体中，并且本发明还提供了培养方法和培养基。权利要求1.一种培养基，其包括MEK抑制剂和GSK3抑制剂。2.根据权利要求1所述的培养基，还包括FGF受体拮抗体。3.根据权利要求1或2所述的培养基，其中MEK抑制剂为MEK1抑制剂。4.根据上述任一权利要求所述的培养基，其中MEK抑制剂选自PD184352和PD98059。5.根据上述任一权利要求所述的培养基，其中GSK3抑制剂为GSK-33抑制剂。6.根据上述任一权利要求所述的培养基，其中GSK3抑制剂对GSK3的选择性高于cdc2和/或erk2。7.根据权利要求6所述的培养基，其中GSK3抑制剂对GSK3的选择性高于cdc2至少100倍。8.根据权利要求6所述的培养基，其中GSK3抑制剂对GSK3的选择性高于cdc2至少200倍。9.根据上述任一权利要求所述的培养基，其中GSK3抑制剂为CHIR99021。10.根据上述任一权利要求所述的培养基，还包括gpl30拮抗体。11.根据权利要求IO所述的培养基，其中gpl30拮抗体为LIF、CNTF、心肌营养素、抑瘤素M、IL-6加sIL-6受体或hyperlL-6。12.根据权利要求10所述的培养基，其中gpl30拮抗体为(a)LIF，(b)sIL-6R和IL-6，或(c)hyperlL-6。13.根据权利要求2至12中任一项所述的培养基，其中FGF受体拮抗体为FGFR1拮抗体。14.根据权利要求13所述的培养基，其包括SU5402。15.根据权利要求13所述的培养基，其包括PD173074。16.根据上述任一权利要求所述的培养基，其包括细胞凋亡的抑制剂。17.根据上述任一权利要求所述的培养基，其包括N2培养基和/或B27培养18.根据上述任一权利要求所述的培养基，其包括PD184352、CHIR99021和SU5402。19.一种基于上述任一权利要求的人ES培养基。20.—种基于权利要求1至18中任一项的小鼠ES培养基。21.MEK抑制剂和GSK3抑制剂在制作多能细胞用培养基中的应用。22.MEK抑制剂、GSK3抑制剂和FGF受体拮抗体在制作多能细胞用培养基中的应用。23.根据权利要求21或22所述的应用，所述培养基用于小鼠ES细胞的培养。24.根据权利要求21或22所述的应用，所述培养基用于人ES细胞的培养。25.根据权利要求21或22所述的应用，所述培养基用于大鼠多能细胞的培养。26.—种以促进自我更新的多能细胞的培养方法，其包括将所述细胞维持在权利要求1至18中任一项所述的培养基中。27.根据权利要求26所述的培养方法，所述培养基不含血清或血清提取物。28.根据权利要求26或27所述的培养方法，所述细胞为小鼠细胞。29.根据权利要求26或27所述的培养方法，所述细胞为人细胞。30.根据权利要求26或27所述的培养方法，所述细胞为大鼠细胞。31.—种ES细胞的培养方法，其包括如下步骤-维持ES细胞在培养基中处于多能状态，可在培养基中设饲养层；-使ES细胞传代至少一次；-由该培养基中提出血清或血清提取物(如果存在)和提取该饲养层(如果存在)，以便该培养基不含词养层、血清和血清提取物；和-然后在MEK抑制剂和GSK3抑制剂存在的条件下使ES细胞维持在多能状态下。32.根据权利要求31所述的培养方法，所述细胞在MEK抑制剂、GSK抑制剂和gpl30下游信号发送途径活化剂的存在条件下维持在多能状态。33.根据权利要求31所述的培养方法，所述细胞在MEK抑制剂、GSK抑制剂和FGF受体拮抗体的存在下维持在多能状态。34.根据权利要求31至33中任一项所述的培养方法，所述细胞为小鼠细胞。35.根据权利要求31至33中任一项所述的培养方法，所述细胞为人细胞。36.—种得到ES细胞转染群体的方法，包括-转染具有编码选择性标记的结构的ES细胞；-将所述ES细胞放在培养板上；-在MEK抑制剂和GSK3抑制剂存在下培养所述ES细胞；和-选择表达该选择性标记的细胞。37.根据权利要求36所述的得到ES细胞转染群体的方法，所述ES细胞在MEK抑制剂、GSK抑制剂和gpl30下游信号发送途径活化剂的存在下培养。38.根据权利要求36所述的得到ES细胞转染群体的方法，所述ES细胞在MEK抑制剂、GSK抑制剂和FGF受体拮抗体的存在下培养。39.根据权利要求36至38中任一项所述的得到ES细胞转染群体的方法，所述细胞为小鼠细胞。40.根据权利要求36至38中任一项所述的得到ES细胞转染群体的方法，所述细胞为人细胞。41.一种不含血清和血清提取物的细胞培养基，包括-基础培养基；-MEK抑制剂；-GSK3抑制剂；和-铁转运体。42.根据权利要求41所述的细胞培养基，还包括gpl30下游信号发送途径的活化剂。43.根据权利要求41或42所述的细胞培养基，还包括FGF受体拮抗体。44.根据权利要求41至43中任一项所述的细胞培养基，还包括胰岛素、清蛋白和铁转运体。45.根据权利要求41至44中任一项所述的细胞培养基，还包括细胞凋亡抑制剂。46.—种从胚泡衍生多能细胞的方法，包括(1)获得胚泡；(2)在MEK抑制剂和GSK3抑制剂的存在下培养该胚泡，以得到内细胞群；(3)分离所述内细胞群；(4)由所述分离内细胞群分离一个细胞或多个细胞；和(5)在MEK抑制剂和GSK3抑制剂的存在下培养上一步骤中分离的细胞。47.根据权利要求46所述的从胚泡衍生多能细胞的方法，在gpl30下游信号发送活化剂、MEK抑制剂和GSK3抑制剂的存在下培养所述分离细胞。48.根据权利要求46所述的从胚泡衍生多能细胞的方法，在FGF受体拮抗体、MEK抑制剂和GSK3抑制剂的存在下培养该分离细胞。49.根据权利要求46至48中任一项所述的从胚泡衍生多能细胞的方法，包括在LIF中培养该胚泡2天至4天的时间。50.—种成套材料，其包括第一和第二组合体，所述第一组合体包含GSK3抑制剂且所述第二组合体包含MEK抑制剂。51.根据权利要求50所述的成套材料，还包括含FGF受体拮抗体的第三组合体。52.根据权利要求50所述的成套材料，其中的GSK3抑制剂、MEK抑制剂和FGFR拮抗体与权利要求3至9或13至15所定义的相同。53.根据权利要求50至52中任一项所述的成套材料，包括另一个含gpl30下游信号发送活化剂的组合体。54.根据权利要求53所述的成套材料，该gpl30拮抗体为(a)LIF，(b)sIL-6R和IL-6，或(c)hyperlL-6。55.MEK抑制剂和GSK3抑制剂在促进多能干细胞自我更新中的应用。56.MEK抑制剂、GSK3抑制剂和FGF受体拮抗体在促进多能干细胞自我更新中的应用。57.—种扩增干细胞群体的方法，包括在MEK抑制剂和GSK3抑制剂的存在下培养该干细胞。58.—种扩增干细胞群体的方法，其包括在MEK抑制剂、GSK3抑制剂和FGF受体拮抗体的存在下培养该干细胞。59.MEK抑制剂和GSK3抑制剂在促进表达Nanog的多能干细胞自我更新中的应用。60.MEK抑制剂、GSK3抑制剂和FGF受体拮抗体在促进表达Nanog的多能干细胞自我更新中的应用。61.—种培养基，其包括MEK抑制剂和FGF受体拮抗体。62.MEK抑制剂和FGF受体拮抗体在制作多能细胞用培养基中的应用。63.—种促进自我更新的多能细胞的培养方法，包括将细胞维持在含MEK抑制剂和FGF受体拮抗体的培养基中。64.—种培养ES细胞的方法，包括如下步骤-维持ES细胞在培养基中处于多能状态，可在培养基中设饲养层；-使ES细胞传代至少一次；-由该培养基中提取血清或血清提取物(如果存在)以及提取该饲养层(如果存在)，以便该培养基不含词养层、血清和血清提取物；和-随后在MEK抑制剂和FGF受体抑制剂的存在下使ES细胞维持在多能状态下。65.—种得到ES细胞转染群体的方法，包括-转染具有编码选择性标记的结构的ES细胞；-将上述ES细胞放在培养板上；-在MEK抑制剂和FGF受体抑制剂的存在下培养上述ES细胞；和-选择表达该选择性标记的细胞。66.—种不含血清和血清提取物的细胞培养基，其包括-基础培养基；-MEK抑制剂；-FGF受体拮抗体；和-铁转运体。67.—种自胚泡衍生多能细胞的方法，包括(1)获得胚泡；(2)在MEK抑制剂和FGF受体拮抗体的存在下培养该胚泡，以得到内细胞群；(3)分离该内细胞群；(4)由该分离的内细胞群分离一个细胞或多个细胞；和(5)在MEK抑制剂和FGF受体拮抗体的存在下培养该分离的细胞。68.—种包括第一组合体和第二组合体的成套材料，第一组合体包含MEK抑制剂，第二组合体包含FGF受体拮抗体；所述成套材料还可包括本专利文件中所述的其它组合体和/或组分。69.MEK抑制剂和FGF受体拮抗体在促进多能干细胞自我更新中的应用。70.MEK抑制剂和FGF受体拮抗体在促进表达Nanog的多能干细胞自我更新中的应用。71.—种扩增干细胞群体的方法，包括在MEK抑制剂和FGF受体拮抗体的存在下培养该干细胞。全文摘要本发明公开了在包括MEK抑制剂、GSK3抑制剂，和可选FGF受体拮抗体的无血清培养基中维持多能细胞处于自我更新状态；还在包括MEK抑制剂和FGF受体拮抗体的无血清培养基中维持多能细胞处于自我更新状态。文档编号C12N5/02GK101410510SQ200780011232公开日2009年4月15日申请日期2007年3月30日优先权日2006年3月30日发明者A·G·史密斯,应其龙申请人:爱丁堡大学管理处