专利名称：一种抗hiv药物的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种药物的筛选方法，具体地，涉及抗HIV药物的 筛选方法。
背景技术：
由人免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的艾滋病是我国重点防治的重 大传染性疾病。目前，我国HIV-1感染者已达IOO万，而且感染人数 已经进入快速增长期。艾滋病不仅成为我国严重的卫生健康问题，同 时每年造成了上千亿的直接经济损失。据中国卫生部2006年底最新 通报，全国历年累计报告艾滋病近二十万例。
目前，艾滋病的防治主要是依靠药物治疗。临床上使用的抗HIV-1 的药物主要可分为核苷类和非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制 剂、以及新型的跨膜糖蛋白抑制剂四大类。这些药物针对的乾点都是 HIV-1的结构蛋白或酶，但由于病毒高变异而产生的耐药性突变，导 致药物的作用活性迅速丧失。虽然目前普遍应用的高效抗逆转录病毒 治疗(HAART)和联合治疗方法，可以在一定程度上控制病毒的复制， 延长患者的生命，但这些治疗方案都面临着疗效间存在极大的个体差 异，严重的毒副作用，病毒突变重组所形成的多重耐药，以及高成本 等问题。目前，抗艾滋病病毒药物治疗中所面临的问题表明研发针对 崭新药物靶点的新型抗艾滋病药物仍然迫在眉睫。
病毒的耐药性是目前艾滋病药物治疗中最亟需解决的问题。 HIV-1之所以能够迅速产生针对现有临床应用的抗病毒药物的耐药 性，其主要根源在于这些药物所针对的靶点都是病毒本身。而病原病 毒天然就具有高变异的特点，在药物的选择压力下，很容易引起病毒 的迅速变异从而产生耐药。因此，解决HIV-1的耐药性问题的关键之 一在于必须突破传统的"以病原病毒本身为靶"的药物发展模式。
4在生物进化的漫长过程中，宿主细胞会形成针对不同病原病毒 的防御体系，而病毒也会形成特异性的拮抗机制，以逃避宿主细胞的 抑制作用。在不影响宿主生存能力的前提下，特异性地上调宿主天然 的抗病毒机制不仅可以有效地抑制病毒的复制，同时也可以明显减小 甚至是避免药物对病毒的选择压力，从而降低耐药性突变发生的可能 性。因此，"以宿主为靶"的药物发展模式已经成为解决目前抗病毒 药物耐药性难题的重要研究策略之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选抗HIV药物的方法，具体地 将是一种以APOBEC3G为靶点的抗HIV-1药物筛选方法。
为实现上述目的，本发明首先构建了 一种表达hA3G与报告基因 的融合蛋白以及Vif的细胞。在这种细胞中VIF蛋白特异性地结合 hA3G，并与细胞蛋白Cu15， elonginsB和C以及Rbxl相互作用， 形成Skpl-qimn-F-box(SCF)复合物，通过泛素介导的降解途径，导 致hA3G报告基因的降解。hA3G的降解可以通过考察报告基因编码 产物的量来实现。
这里的报告基因可以是本领域技术人员所熟知的常规报告基因， 优选为荧光蛋白基因，例如绿荧光蛋白(GFP )、红荧光蛋白(DsRed2 ) 以及深蓝萤光蛋白(CFP),更优选为黄荧光蛋白的效果最为优化。 可以通过检测细胞的荧光值方便地进行观察。所述细胞为动物细胞。
上述细胞可通过如下方法构建构建表达hA3G与报告基因融合 蛋白的表达载体以及表达Vif的表达载体，将所述表达载体分别或共 转染细胞，筛选表达hA3G与报告基因的融合蛋白以及Vif的阳性克 隆。其中，所述表达hA3G与报告基因的融合蛋白的表达载体优选为 pEYFP-Nl-APOBEC3G，所述表达Vif的表达载体优选为pcDNA-hvif 质粒。
本发明筛选抗HIV药物的方法包括如下步骤
5(1) 添加待测样品至上述的细胞；检测细胞报告基因表达产物
量的变化，选择能使报告基因表达产物量上升的样品；
(2) 从步骤1)选择的样品中选择非蛋白酶体降解通路阻断的样品。
其中，所述步骤(2 )选择非蛋白酶体降解通道阻断样品的方法， 可以参照Ausseil等(Ausseil F， Samson A， Aussagues Y, Vandenbe rghe I， Creancier L, Pouny I， Kruczynski A, Massiot G, Bailly C. High-throughput bioluminescence screening of ubiquitin—proteasome p athway inhibitors from chemical and natural sources. J Biomol Sere en. 2007，12(1):106-16)提供的方法或Rickardson等(Rickardson L， Wickstr6m M， Larsson R， Ldvborg H. Image-based screening for th e identification of novel proteasome inhibitors. J Biomol Screen. 20 07，12(2):203-10.)提供的方法进行。也可通过如下方法考察样品是否 为蛋白酶体降解途径抑制剂将步骤(1)选择的样品添加至表达P5 3与报告基因的融合蛋白以及E4orf6的细胞，通过与照比较，选择报 告基因编码产物量相对较低的样品。其中，所述表达P53与报告基因 融合蛋白以及E4orf6的细胞通过如下方法构建构建表达P53蛋白 与报告基因的融合蛋白的表达载体以及表达E4orf6的表达载体，将 构建的表达载体分别或共转染细胞，并筛选阳性克隆；其中所述细胞 为动物细胞，优选为293T细胞；所述报告基因优选为荧光蛋白，更 优选为黄荧光蛋白；所述表达P53与报告基因的融合蛋白的表达载体 优选为pEYFP-Nl-P53;所述表达E4orf6的表达载体优选为E4orf6-myc。
人APOBEC3G(human protein apoliprotein B mRNA-editing enz yme- catalytic polypeptide-like-3G， hA3G)可以有效地抑制HIV-1的 复制，其是在人淋巴细胞中表达的一种RNA/DNA编辑酶，属于AP OBEC蛋白超家族的成员。人的APOBEC蛋白超家族至少有10个成员，其同源蛋白包括AID、 APOBEC 1、 APOBEC2和APOBEC3A國
G，多数具有编辑核酸的功能，可以使mRNA上的胞嘧啶残基脱氨形 成尿嘧啶，或单链DNA上的脱氧胞嘧啶残基脱氨形成脱氧尿嘧啶。h A3G不仅可以高效抑制包含HIV-1在内的各种逆转录病毒的复制， 而且对非逆转录病毒如乙肝病毒也有很好的灭活效果，因此成为宿主 抵御病毒感染的固有免疫系统的一个重要组成。
HIV-1病毒编码的VIF蛋白可以特异性地结合hA3G，并与细胞 蛋白Cul5， elongins B和C以及Rbxl相互作用，形成Skpl-cullin-F-box (SCF)复合物，通过泛素介导的降解途径，导致hA3G的降解， 从而阻断了宿主细胞hA3G抗病毒系统对HIV-1病毒复制的抑制作 用。鉴于人体内表达hA3G的细胞和组织主要是HIV-l的靶细胞(夕卜 周血单核细胞、T-淋巴细胞、单核巨噬细胞)，如果能特异而有效地 阻断VIF介导的降解途径，宿主细胞就可以利用自身编码的hA3G抑 制HIV-1的复制。
根据HIV-1病毒蛋白Vif介导的hA3G的降解作用机制，建立以 Vif介导的降解hA3G为靶点的抗HIV-l药物高通量筛选方法在细 胞内共表达HIV-1的Vif和融合了黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein(YFP))的hA3G, Vif对hA3G的降解将造成融合在hA3G 上的YFP的降解，从而导致胞内荧光强度(530nm)的下降。通过测 定荧光强度的变化，可以定量分析筛选样品对Vif降解hA3G的影响。
HIV-1病毒蛋白Vif介导的hA3G的降解作用抑制剂的條选方法 构建表达hA3G与YFP的融合蛋白的pEYFP-Nl-APOBEC3G以及 表达野生型的Vif的pcDNA-hvif质粒。
将这两个质粒分别或共转染细胞。转染后，添加样品至转染后的 细胞，检测细胞荧光值的变化。
若样品对该方法有效，即阻止Vif对APOBEC3G-YFP融合蛋白 降解作用，则荧光值升高。若样品对该方法无效，即vif降解APOBEC3G-YFP融合蛋白，则荧光值降低。
通过上述筛选，可以快速筛选能够抑制hA3G降解的活性样品 (发酵样品或化合物)，但仍然无法确定该样品是特异性干扰Vif介 导的hA3G的降解作用，还是通过阻断蛋白酶体降解通路来实现对 hA3G的保护。
为了确定阳性样品是否为Vif降解hA3G的特异性抑制剂，根据 E4orf6对P53的蛋白酶体降解机制，利用类似的荧光发光检测方法， 釆用排除蛋白酶体降解通路阻断剂的复筛方法进行检测。
与Vif降解hA3G类似，腺病毒早期基因蛋白E4orf6可以结合 p53，通过Cul5介导的多泛素化，特异性地降解P53。虽然这两个降 解作用可以各自特异性地识别底物(hA3G和p53 )，但都利用相同的 蛋白酶体降解途径来降解底物。因此，如果活性样品可以同时阻断这
两个降解反应，则表明其作用靶点很可能位于蛋白酶体降解途径中。
复篩即非蛋白酶体降解通路阻断剂的筛选如下
构建E4orf6-P53质粒和P53与YFP融合蛋白的表达载体Vif -APOBEC3G质粒；
这两个质粒分别转染细胞，转染后，添加样品至转染后的细胞， 检测细胞荧光值的变化；
在复筛中，构建了 P53与报告基因YFP融合蛋白的表达载体， 与Myc-E4orf6同时转染进细胞，检测细胞荧光值的变化。若样品对 该方法有效，即能阻止E4orf6通过泛素化蛋白酶体途径降解P53,荧 光值较高，则该样品属于我们排除的对象。若样品对该方法无效，而 在Vif-APOBEC3G筛选方法上有效，则说明样品能特异地抑制Vif 对hA3的降解作用。
复筛方法的流程
(1) Vif-APOBEC3G筛选方法的流程 ①细胞培养取细胞进行培养，待细胞长满培养瓶后，弃旧培养基，用消化液 消化。待细胞变圆，弃消化液，立即加入培养基，用吸管轻轻吹打瓶 底，使细胞完全脱离瓶底且使之分散为单细胞悬液。血球计数板计数 后，取细胞悬液接种于培养皿，用于进行细胞转染。
② 细胞转染
a、 培养基混合用于转染的质粒，然后轻轻混匀。
b、 培养基加入转染试剂，温室孵育。
C、将含有转染质粒和转染试剂的培养基轻轻混匀，室温孵育后， 加到细胞培养上清中。
③ 细胞分盘
转染后，培养一段时间。然后吸去旧的培养基，用消化液消化， 弃消化液，立即加入培养基，轻轻吹打，使细胞分散为单细胞悬液。 血球计数板计数后，接种。
④样品制备
化合物样品取纯品化合物溶到DMSO中，加水倍比稀释，取 稀释液作用于细胞体系。
发酵液样品菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物种入盛有发 酵培养基的瓶中，摇床培养。取发酵液用丙酮抽提，挥干后，用DMSO 溶解。取溶液加水倍比稀释，再取稀释液作用于细胞体系。
用DMSO溶解MG132。 MG132可以阻断蛋白酶体降解通路，抑 制Vif对hA3G的降解，作为阳性化合物。
样品活性检测
A、 阳性组和空白对照组加入DMSO于细胞培养上清中。
B、 实验组又分为三组
阴性对照组加DMSO于细胞培养上清中，该组反映Vif对 APOBEC3G的降解程度。
阳性药对照组加MG132于细胞体系中。该组反映蛋白酶体抑
9制剂MG132对vif降解APOBEC3G的抑制程度。
样品实验组加要筛选的样品于细胞体系中，该组反映筛选样品 对vif降解APOBEC3G的抑制程度。
在细胞培养上清中加入一定浓度的检测样品。继续培养后，吸去 旧的培养基，用磷酸缓冲液(PBS)吹打细胞，直至细胞完全脱离。
将细胞悬液转移到黑板中，检测荧光强度，激发波长为485nm， 检测波长为520nm。测量两次取平均值。
检测结果的分析
测定的荧光强度减去空白对照组的数值作为各组YFP荧光强度 数值。
相对荧光强度-实验组荧光强度/阳性组荧光强度x 100% 降解抑制率=(样品实验组-阴性对照组)/ (阳性组-阴性对照组) x 100%
(2) 、 E4orf6-P53筛选方法的流程
该流程与Vif-APOBEC3G筛选方法的流程相同。
(3) 、比较检测结果，筛选具有特异地抑制Vif对hA3的降解 作用的样品。
选择h A 3 G作为靶点，不仅可以解决病毒高变异导致的耐药性问 题，而且与目前临床应用的抗HIV-1药物无交叉耐药性。同时作为宿 主内源性的抗病毒宿主因子，还将具有低毒副作用的优点。
图1为实施例2中构建的表达质粒pEYFP-Nl-APOBEC3G; 图2为实施例2中构建的表达质粒pcDNA-Vif; 图3为实施例6中构建的表达质粒pEYFP-Nl-p53; 图4为实施例6中构建的表达质粒E4orf6 -myc。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。 实施例1细胞培养
取293T细胞进行培养，待细胞长满培养瓶后，弃旧培养基，用 含0.25%胰酶和0.02% EDTA的消化液消化。待细胞变圆，弃消化 液，立即加入含10%FBS(购自Biological industries)的高糖DMEM培 养基(HyCkme),用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底且使之 分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，用培养基将细胞浓度调整为 2.2xl()5个/ml，取15ml细胞悬液接种于10cm培养皿，12小时后(细 胞丰度约为70%)用于细胞转染。
实施例2构建表达载体
应用PCR扩增hA3G的全基因(GeneID: 60489)。模板为人 cDNA，所用引物上游引物5'-GCCAGAATTCAAGGATGAAGC CTCACTTCAG， 下游弓l物5'-TAG AAG CTC GAGGTT TTC CTG
ATT CTG GAG AAT GG，
反应体系:_
5xPrimeSTARBufer (Mg kis) 10pl
Prime STAR HS DNA Polymerase(2.5U/ml) 0.5pl
dNTP Mixture(各2.5mM) 4pl
模板DNA 1^1 上游引物(10uM) lpl 下游引物(10uM) 1^1
ddH20 32.5^1
总体积 — 50uT"
反应条件98°C 5min;94。C/lmin， 55°C/lmin， 72°C/lmin,共30个循环;72 °C lOmin。
扩增产物经验证后，插入到真核细胞表达载体pEYFP-Nl (Clontech )的多克隆位点(Xhol和EcoRl ),得到质粒 pEYFP-Nl-APOBEC3G。 pEYFP-Nl-APOBEC3G表达hA3G和YFP
的融合蛋白。
从野生型的HIV-1毒株pSVC21,BH10 (NIH AIDS Research &
iiReference Reagent Program)中通过PCR扩增全长的Vif基因 (GenelD:326389)。所用引物
上游引物5'-TAG AAG GAA TTC ATG GAA AAC AGA TGC 下游引物5'-TAG AAG CTC GAG CTA GTG TCC ATT CAT
反应体系:_
5xPrime STARBufer (Mg2+plus) T^ii~~
Prime STAR HS DNA Polymerase(2.5U/ml) 0.5jal
dNTP Mixture(各2.5mM) 4nl 模板DNA
上游引物(10uM) 1^1
下游引物(10uM) 1^1
ddH20 32，
总体积 50nl
反应条件98°C 5min;94。C/lmin， 55°C/lmin， 72°C/lmin,共30个循环;72 。C lOrairu
PCR产物经验证后插入到真核细胞表达载体pcDNA3.1 (Invitrog en)的多克隆区(EcoRl和Xho 1 )，构建形成pcDNA-Vif.。
实施例3 细胞转染
转染步骤按Lipofectamine 2000 (Invitrogene )的说明书进行。具 体操作如下用1.5ml高糖DMEM培养基混合用于转染的质粒，然 后轻轻混匀。阳性组共转染12pgpEYFP-Nl-APOBEC3G和12pg 对照空载体pcDNA3.1，实验组共转染12pgpEYFP-Nl-APOBEC3G 和12昭pcDNA-hvif;空白对照组转染24pg对照空载体pcDNA3.1。
用1.5ml高糖DMEM培养基稀释60nl Lipofectamine 2000。室温 孵育5分钟，将含有转染质粒和Lipofectamine 2000的培养基轻轻混 匀(总体积为3ml)，室温孵育20分钟后，加到10cm培养皿的细胞 培养上清中。
转染后，37°C， 5%的C02培养10h。然后吸去旧的培养基，用 含0.25%胰酶和0.02% EDTA的消化液消化，弃消化液，立即加入 含10。/。FBS的高糖DMEM培养基，轻轻吹打，使细胞分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，用培养基将细胞浓度调整为2.2xl()S个/m1, 96孔板每孔接种150jil细胞悬液。
实施例4 样品制备
化合物样品10mg纯品化合物溶到lmlDMSO中，取10nl加10pl 水倍比稀释，取1.5pl作用于150iil细胞体系，使其终浓度为50|ig/ml.
发酵液样品菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物种入盛有 50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28°C、 190转/分旋转摇床培养 4天。取10ml发酵液用10ml的丙酮抽提，挥干后，用lml的DMSO 溶解。取l(Hil加10pl水倍比稀释，取1.5^作用于150lul细胞体系。
MG132(购自Merck Calbiochem): lmg用5ml的DMSO溶解， MG132的浓度为0.4205mM。 MG132可以阻断蛋白酶体降解通路， 抑制Vif对hA3G的降解，在本筛选模型里作为阳性化合物。
实施例5 样品活性检测
培养26小时后，按以下分组进行操作。
阳性组和空白对照组加入1.5nl 50% DMSO于细胞培养上清中。
实验组分为三组，阴性对照组加入1.5^1 50% DMSO于细胞培 养上清中，该组反映Vif对APOBEC3G的降解程度。
阳性药对照组加的0.4205mMMG132于150|dl的细胞 体系中，使MG132的终浓度为2uM。该组反映蛋白酶体抑制剂MG132 对vif降解AP0BEC3G的抑制程度。
样品实验组加药筛选的样品L5)il于150jnl的细胞体系中。该 组反映筛选样品对vif降解AP0BEC3G的抑制程度在96孔板的细胞 培养上清中(每孔)加入1.5pl —定浓度的检测样品。继续培养12 小时后，吸去旧的培养基，每孔用100pl磷酸缓冲液(PBS)吹打细 胞，直至细胞完全脱离。
将细胞悬液转移到黑板中，BMG公司的Polarstar荧光检测仪检 测各孔荧光强度，激发波长为485nm，发射波长为520nm， Gain值为70。测量两次取平均值。
测定的荧光强度减去空白对照组的数值作为各组YFP荧光强度 数值。
相对荧光强度=实验组荧光强度/阳性组荧光强度x 100%
降解抑制率=(样品实验组-阴性对照组)/ (阳性组-阴性对照组)xioo%
实施例6E4orf6-P53筛选方法
应用PCR扩增p53的全基因。以Clontech公司的pCMV-P53 (GeneID: 631922 )为模板，所用引物上游引物5' GTACTCGAGA TGGAGGAGCCG 3';下游引物5' GGAATTCGGTCTGAGTCAG
GC 3'
反应体系:_
5 xPrime STAR Bufer (Mg2+ plus ) T^ili~
Prime STAR HS DNA Polymerase(2.5U/ml) 0.5^1
dNTP Mixture(各2.5mM) 4(J
模板DNA 1^1
上游引物(10uM) 1^1
下游引物(10uM) 1^1
ddH20 32，
总体积 50^1
反应条件98°C/10see,68°C/2min,共30个循环 扩增产物经验证后，插入到真核细胞表达载体pEYFP-Nl (Clontech )的多克隆位点(Xhol和EcoRl )，得到质粒 pEYFP-Nl-p53。 pEYFP-Nl-p53则表达p53和YFP的融合蛋白。以 腺病毒(ATCC VR-5TM )应用PCR扩增腺病毒E4orf6全基因(GeneID : 2958467)，所用引物上游引物5'-CTT CAG GAT CCA TGA CTA CGT CCG GCG-3,，下游弓I物5'-GAA GTG AAT TCC TAC ATG GGG GTA
GAG TCATAA3',
反应体系:_
5 xPrime STAR Bufer (Mg2+ plus ) 10pl Prime STAR HS DNA Polymerase(2.5U/ml) 0.5nl dNTP Mixture(各2.5mM) 模板DNA lpl 上游引物(10uM) l^tl 下游引物(10uM) lpl ddH20_32.5^1
反应条件94°C 5min;94。C/lmin, 55°C/lmin， 72。C/lmin,共30个循环;72 。C 10min。
扩增产物经验证后，插入到到真核细胞表达载体pcDNA3 (Invitrogen)的多克隆区3，和Xbal，构建形成E4orf6-myc。
该筛选方法除转染质粒的量不同外，其余的和Vif-APOBEC3G 筛选方法一样。实验组共转染E4or伤-myc和pEYFP-N1-P53的质 量为2:1， E4orf6是Lipofectamine2000说明书推荐的量。阳性组 转染的P53的量是Lipofectamine 2000说明书推荐量的一半。
筛选结果为，从组合化学库、微生物次级代谢产物库以及天然产 物库中共筛选7000个样品，其中1200个化合物，5800个发酵液样品， 初筛阳性率176/7000=2.51%，复筛阳性率64/7000=0.9%。活性化合物 两个为IMB-26和IMB-35。抑制率分别51.1%, 52.3%。序列表
<110>中国医学科学院医药生物技术研究所 <120> —种抗HIV药物的筛选方法 <130> 〈160> 8
〈170> Patentln version 3. 3
<210> 1 <211> 31 〈212〉 DNA <213>人工序列 <400〉 1
gccagaattc aaggatgaag cctcacttca g 31
<210〉 2 <211> 35 <212> 腿 〈213〉人工序列 <400〉 2
t3gaagctcg aggttttcct gattctggsg朋tgg 35
<210> 3 <211> 27 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <400〉 3
taga鄉aat tcettggaaaa cagatgc 27
〈210> 4 〈211> 27 <212> DNA <213>人工序列 〈400〉 4
tagaagctcg agctagtgtc cattcat 27
〈210〉 5 <211> 21
16〈212〉 DNA <213>人工序列 <400> 5
gtactcgaga tggaggagcc g 21
<210〉 6 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <400〉 6
ggaattcggt ctgagtcagg c 21
〈210〉 7 <211〉 27 <212> DNA <213〉人工序列 〈400〉 7
cttcaggatc catgactacg tccggcg 27
<210> 8
<211> 33
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
<400> 8
gaagtgaatt cctacatggg ggtagagtca taa 3权利要求
1、一种细胞，其表达hA3G与报告基因的融合蛋白以及Vif。
2、 如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述的报告基因为 荧光蛋白。
3、 如权利要求2所述的细胞，其特征在于，所述的荧光蛋白为 黄荧光蛋白。
4、 如权利要求2或3所述的细胞，其特征在于，所述的细胞为 动物细胞。
5、 如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述的细胞为293T
6、 一种制备权利要求1 5任一所述细胞的方法，其包括步骤 构建表达hA3G与报告基因融合蛋白的表达载体以及表达Vif的表达 载体，将所述表达载体分别或共转染细胞，筛选表达hA3G与报告基 因的融合蛋白以及Vif的阳性克隆。
7、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表达hA3G与 报告基因的融合蛋白的表达载体为pEYFP-Nl-APOBEC3G，所述表 达Vif的表达载体为pcDNA-hvif质粒。
8、 一种抗HIV药物的筛选方法，其包括如下步骤 (1 )添加待测样品至权利要求1所述的细胞； 检测细胞报告基因表达产物量的变化，选择能使报告基因表达产物量上升的样品；(2)从步骤1)选择的样品中选择非蛋白酶体降解通路阻断的样品。
9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)选 择非蛋白酶体降解通道阻断样品的方法是将步骤(1)选择的样品添加至表达P53与报告基因的融合蛋白以及E4orf6的细胞，通过与照比较，选择报告基因编码产物量相对较低的样品。
10、如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述表达P53与 报告基因融合蛋白以及E4or伤的细胞通过如下方法构建构建表达P 53蛋白与报告基因的融合蛋白的表达载体以及表达E4orf6的表达载 体，将构建的表达载体分别或共转染细胞，并筛选阳性克隆；其中所 述细胞为动物细胞，优选为293T细胞；所述报告基因优选为荧光蛋 白，更优选为黄荧光蛋白；所述表达P53与报告基因的融合蛋白的表 达载体优选为pEYFP-Nl-P53;所述表达E4orf6的表达载体优选为E 4orf6-myc。
全文摘要
本发明公开了一种抗HIV药物的筛选方法，其通过将待测样品添加至表达hA3G与报告基因的融合蛋白以及Vif的细胞，通过考察报告基因编码产物的量，来判断样品对Vif途径的阻断作用，并进一步判断初选的样品是否为蛋白酶体降解途径的抑制剂，从而筛选出抗HIV的药物。本发明的筛选方法选择hA3G作为靶点，解决了病毒高变异导致的耐药性问题，且与目前临床应用的抗HIV-1药物无交叉耐药性。
文档编号C12N5/10GK101591645SQ20081011358
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者余利岩, 山 岑, 彭宗根, 建 徐, 李卓荣, 蒋建东 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所