专利名称：一对基于gyrB基因的沙门氏菌PCR快速检测引物的制作方法
技术领域：
本发明属于致病菌检测技术领域，具体涉及一对基于gyrB基因，能够快速检测沙门氏菌的PCR引物。
背景技术：
沙门氏菌是导致食物中毒和食源性疾病的主要病原菌之一，由于沙门氏菌导致的疾病发病率正在逐年上升。2008年美国圣保罗沙门氏菌感染疫情爆发，沙门氏菌蔓延至23 个 州，228人感染，其中造成一人死亡。我国国家质量监督检验检疫总局明确规定沙门氏菌为必检项目。因此准确、快速地检测食物及环境中的沙门氏菌，对于沙门氏菌防治具有十分重要的意义。现有技术中，运用PCR方法已经成为快速检测沙门氏菌的方法之一，但是由于所选用引物的基因通常是功能基因，因此并不能把沙门氏菌属的所有沙门氏菌均检测出来， 因此有一定的局限性。幻基因即促旋酶(gyrase)的B亚单位基因，属于信息通路中与DNA复制、限制、 修饰或修复有关的蛋白编码基因。WTi 基因序列全场约1.2 1.4kb，平均碱基替换率为每 100万年变化0. 79Π). 8%，比16S rDNA的每5000万年变化1%的速度快。另外，由于其作为蛋白编码蛋白，其所固有的遗传密码子的兼并性使得DNA序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列，尤其是密码子的第三位碱基，这就使得^jri 基因序列在鉴定细菌近缘种方面，具有较高的分辨率。1995年，Yamamoto等根据大肠杆菌、恶臭假单胞菌和枯草芽孢杆菌的GyrB亚蛋白两端的保守氨基酸序列设计兼并引物，并对不同的种群的细菌进行扩增， 研究结果表明这组引物可以扩增(G+C)含量低的革兰氏阳性菌、大部分革兰氏阴性菌。 Lzumi等通过分析9株变形假单胞菌的^jri 基因序列，设计出特异性引物，并对肠道和肾脏样品进行PCR分析，结果表明，此种方法可以快速检测由变形假单胞菌引起的疾病。目前， ^jri 基因序列分析在蛭弧菌属、芽孢杆菌属、巴氏肺炎球菌属和苯酚分解菌等相近菌株的快速检测中效果显著。
发明内容
技术问题本发明提供了一对基于WTi 基因，能够快速检测沙门氏菌的PCR引物， 此对引物能够高效、快速地检测出试样中含有的各种沙门氏菌。技术方案提供了一对WTi 基因，能够快速检测沙门氏菌的PCR引物，该引物包括如下基因序列
S-P-for :5’ -GGTGGTTTCCGTAAAAGTA-3‘S-P-rev :5， -GAATCGCCTGGTTCTTGC-3，
有益效果与现有技术相比，本发明的引物具有检测周期短、操作简单、结果可靠及灵敏度高等优点，有助于对人和动物常见所有沙门氏菌病的早期临床诊断，并对于公共卫生， 畜牧兽医和口岸检疫中的致病性沙门氏菌的检出具有重要意义。
图1是应用本发明沙门氏菌PCR快速检测引物的检测准确性结果图。
图2是应用本发明沙门氏菌PCR快速检测引物的检测灵敏度结果图。
具体实施例方式实施例
1、引物的设计通过分别对所有已知的沙门氏菌基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段(沙门氏菌^jri 基因)，设计多对引物，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物组合如下
S-P-for :5’ -GGTGGTTTCCGTAAAAGTA-3‘ S-P-rev :5， -GAATCGCCTGGTTCTTGC-3，
2、现采用该引物，对7株常见沙门氏菌进行检测，同时以6株粪便中常见的其它致病菌株做为对照，来验证本发明快速检测弓I物的准确性及灵敏度。菌株沙门氏菌第II 亚属 Salmonella sub-genus II (CMCC50215)、沙门氏菌第 III HSalmoimlla sub-genus III b (CMCC50381 )、肠炎沙门氏菌 fehfweWa en teri tidis (CMCC50335 )、肠炎沙门氏菌 danysz 变种 Salmonella en teri tidis var. danysz (CMCC50100 )、鸡沙门氏菌 Salmonella gallinarum (CMCC50770 )、山夫登堡沙门氏 1 Salmonella senftenberg (CMCC 50210)和曼彻斯特沙门氏菌manchester (CMCC50380)。大肠杆i Escherichia coli (ATCC 25922)、粪链球 M Streptococcus faecal is (CMCC 32223)、阴沟肠杆菌你iero 力 acier cloacae (CMCC 45301)、产气肠杆 1 Enterobacter aerogenes (CMCC 45103)、弗劳地枸橼酸杆菌 CYiro Bacter freumdii (CMCC48001)和弗氏志贺菌flexneri (CMCC 51229)。以上标准菌株均采购于中国医学微生物菌种保藏中心。培养条件37°C培养24h。PCR具体实施步骤如下
1) PCR反应体系(25 μΡ_
_名称I体积—
无菌水_20. ^L
10X Buffer (IOOmMTris - HCl, 15mMMgCl2, 500mMKCl)2. 5μΙ
IOmMdNTP0.2μΙ
S-P-for0. 5μ
S-P-rev0. 5μΙ
2. 5UTaqPolymerase|θ. 2μΙ
权利要求
1. 一对基于沙门氏菌^Fri 基因专一序列的PCR快速检测引物，其特征在于在引物包括如下基因序列S-P-for :5’ -GGTGGTTTCCGTAAAAGTA-3‘ S-P-rev :5， -GAATCGCCTGGTTCTTGC—3，。
全文摘要
本发明公开了一对基于gyrB基因的沙门氏菌PCR快速检测引物，该引物包括如下基因序列S-P-for5’-GGTGGTTTCCGTAAAAGTA-3’；S-P-rev5’-GAATCGCCTGGTTCTTGC-3’。本发明的引物具有检测周期短、操作简单、结果可靠及灵敏度高等优点，有助于对人和动物常见所有沙门氏菌病的早期临床诊断，并对于公共卫生，畜牧兽医和口岸检疫中的致病性沙门氏菌的检出具有重要意义。
文档编号C12N15/11GK102154493SQ20111005881
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月11日 优先权日2011年3月11日
发明者叶旭红, 林先贵, 王一明 申请人:中国科学院南京土壤研究所