专利名称：msCT-AcAPc2融合蛋白转基因工程菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种融合蛋白转基因工程菌株。
背景技术：
老年人骨质疏松发病率较高，全球有2亿骨质疏松患者，并且女性多于男性。根据世界卫生组织(WHO)的标准，美国国家健康和营养调查(NHANES III，1988 1994年)结果表明，骨质疏松严重影响老年人生活质量，50岁以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他们的一生中都会出现骨质疏松性骨折，一旦患者经历了第一次骨质疏松性骨折，继发性骨折的危险明显加大。中国老年人居于世界首位，现有骨质疏松症患者9000万，占总人口的7. 1%。随着社会老龄化的进程，骨质疏松症的发病率呈上升趋势，预计到2050年将增加到2. 21亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在中国。有学者对1995 1996年美国骨质疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年发生数进行调查显示，每年发生骨质疏松性骨折150万次，其中椎体骨折70万次，腕部骨折20万次，髋部骨折30万次，其它骨折30万次。 血栓形成是ー种涉及许多彼此相互作用的遗传和环境因素的多因素变化的过程。而对于老年人其凝血系统又有其特殊性，老年人纤维蛋白原(FIB)含量、组织型纤溶酶原激活物増加以及纤溶酶原激活物抑制剂复合物的増加都导致老年人的高凝状态，所以更容易形成血栓；其中研究发现绝经期后的女性的血栓发生率远高于男性。对于老年人骨质疏松和血栓已成为常见多发病，且往往同时存在。如果患者服用多种药物同时治疗骨质疏松和血栓，容易产生药物拮抗反应；若要错开服药时间一方面要靠考虑药物的半衰期，另ー方面还要考虑药物有效浓度，而且给患者造成不便。目前缺乏ー种可以同时有效治疗骨质疏松和血栓的药品。
发明内容
本发明要解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和血栓药品的缺陷，而提供的ー种msCT-AcAPc2融合蛋白转基因工程菌株。msCT-AcAPc2融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)，大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/AcAPc2)按以下步骤制备一、将含有msCT-AcAPc2融合蛋白基因的质粒载体pUC (msCT/AcAPc2)用BamH I和EcoR I双酶切，获得msCT-ACAPC2融合蛋白的DAN片段；ニ、用 BamHI 和 EcoR I 双酶切质粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-AcAPc2融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX_6P_l进行酶连接，然后16°C放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/ACAPC2 ；四、用载体PGEX-msCT/AcAPc2转化大肠杆菌BL21(DE3)，选择阳性重组子，即获得msCT-AcAPc2融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)。本发明中msCT-AcAPc2融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。
本发明中msCT-AcAPc2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明msCT-AcAPc2融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)发酵产生的msCT-ACAPC2融合蛋白含有118个氨基酸。本发明mSCT-ACAPC2融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/AcAPc2)发酵产生的msCT_AcAPc2融合蛋白可用于同时治疗骨质疏松和血栓，适合同时患有这两种疾病的患者使用。且msCT-AcAPc2融合蛋白为微生物制剂，不产生拮抗反应，使用安全。本发明采用生物基因工程手段获得大肠杆菌BL21(DE3-msCT/ACAPC2)。采用本发明基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/AcAPc2)可大規模发酵生产msCT-AcAPc2融合蛋白，具有广泛应用前景。本发明为治疗骨质疏松和血栓奠定了物质基础。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式msCT-ACAPC2融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌 BL21 (DE3-msCT/AcAPc2)，大肠杆菌 BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)按以下步骤制备一、将含有msCT-AcAPc2融合蛋白基因的质粒载体pUC (msCT/AcAPc2)用BamH I和EcoR I双酶切，获得msCT-ACAPC2融合蛋白的DAN片段；ニ、用 BamHI 和 EcoR I 双酶切质粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-AcAPc2融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX_6P_l进行酶连接，然后16°C放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/ACAPC2 ； 四、用载体PGEX-msCT/AcAPc2转化大肠杆菌BL21(DE3)，选择阳性重组子，即获得msCT-AcAPc2融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)。本实施方式步骤四采用电击转化法转化大肠杆菌BL21 (DE3)。
具体实施方式
ニ 本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤一中质粒载体pUC (msCT/AcAPc2)酶切反应体系为
pUC (msCT/AcAPc2)20^1
IOXM buffer6(J
BamHl3(0,1
KcoR I3 [j]
不含 DNA 酶的 ddH2028^1。其他步骤及參数与具体实施方式
一相同。本实施方式步骤ー酶切反应在37°C条件下反应10h，然后1. 5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或ニ的不同点在于步骤ニ中质粒pGEX-6P-l酶切反应体系为载体 pGEX-6P-l20(i
IOXM buffer6\i\
BamH\3(il
EcoR I3p,l
不含 DNA 酶的 ddH2028|al。其他步骤及參数与具体实施方式
一或二相同。本实施方式步骤ニ酶切反应在37°C条件下反应10h，然后0. 6%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一、ニ或三的不同点在于步骤三
中酶连接反应体系为
双酶切的载体PGEX-6P-13…
融合蛋白的DNA片段13…
10 X T4 DNA 迕接 1 : buffer2(il T4 DNA连接酶2nl。其他步骤及參数与具体实施方式
一、ニ或三相同。本实施方式步骤三酶连接反应在16 °C条件下进行。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一的不同点在于步骤ー中msCT-AcAPc2融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示。其他步骤及參数与具体实施方式
一至四之一相同。本实施方式msCT_AcAPc2融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物エ程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC (msCT/AcAPc2)0具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一的不同点在于步骤ー中msCT-ACAPC2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。其他步骤及參数与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式msCT-ACAPC2融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌 BL21 (DE3-msCT/AcAPc2)，大肠杆菌 BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)按以下步骤制备一、将含有msCT_AcAPc2融合蛋白基因的质粒载体pUC (msCT/AcAPc2)用BamH I和EcoR I双酶切，获得msCT-ACAPC2融合蛋白的DAN片段；ニ、用 BamHI 和 EcoR I 双酶切质粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-AcAPc2融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX_6P_l进行酶连接，然后16°C放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/ACAPC2 ；四、用载体PGEX-msCT/AcAPc2转化大肠杆菌BL21 (DE3 )，选择阳性重组子，即获得msCT-AcAPc2融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)；
其中步骤一中质粒载体pUC (msCT/AcAPc2)酶切反应体系为
权利要求
1.msCT-AcAPc2融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于msCT_AcAPc2融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/AcAPc2 )，大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2 )按以下步骤制备 一、将含有msCT-AcAPc2融合蛋白基因的质粒载体pUC(msCT/AcAPc2)用BamH I和EcoR I双酶切，获得mSCT-ACAPC2融合蛋白的DAN片段； 二、用BamHI 和 EcoR I 双酶切质粒 pGEX_6P_l ； 三、msCT-AcAPc2融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX_6P_l进行酶连接，然后16°C放置连接过夜，得到载体PGEX-msCT/AcAPc2 ； 四、用载体pGEX-msCT/AcAPc2转化大肠杆菌BL21(DE3 )，选择阳性重组子，即获得msCT-AcAPc2融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)。
2.根据权利要求1所述的msCT-ACAPC2融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中质粒载体pUC (msCT/AcAPc2)酶切反应体系为
3.根据权利要求1所述的msCT-ACAPC2融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤二中质粒pGEX-6P-l酶切反应体系为
4.根据权利要求1所述的msCT-ACAPC2融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤三中酶连接反应体系为
5.根据权利要求1所述的msCT-ACAPC2融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中msCT-AcAPc2融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。
6.根据权利要求5所述的msCT-ACAPC2融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中msCT-AcAPc2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
全文摘要
msCT-AcAPc2融合蛋白转基因工程菌株，它涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和血栓药品的缺陷。msCT-AcAPc2融合蛋白转基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3-msCT/AcAPc2)按以下步骤制备一、获得融合蛋白DAN片段；二、双酶切质粒；三、酶连接；四、转化大肠杆菌BL21。本发明可用于医药制备领域。
文档编号C12N9/64GK103031266SQ20121058536
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者余琼 申请人:黑龙江大学