滤芯对离心后上清液进行预过滤，获取预过滤澄清液。
[0031](4)超滤:选用10?30KD超滤膜包对预过滤上清液滤析进行残留培养基去除，100?1000倍，然后浓缩10?15倍。
[0032](5)沉淀:超滤浓缩液按照1: 1.0?3.0加入乙醇溶液，选用0.5?1.0MHCl调节pH至4.0?6.5，4°(^放置3.0±0.5小时，4000?5000印111，4°(^离心10?15111；[11，收集沉淀溶液无菌注射用水中，用0.5?1.0MNaOH溶液调节pH7.8 ±0.5，除菌过滤保存。
[0033]实施例2金黄色葡萄球菌胞质抗原原液。
[0034]对SA79菌株进行发酵罐高密度培养，收集菌体。通过珠磨法对菌体进行机械破碎、预过滤、等电点沉淀1、等电点沉淀2、酶解、透析对金黄色葡萄球菌胞质可溶性组分进行分离纯化，获取高保护性的金黄色葡萄球菌胞质抗原原液，工艺流程如图2所示。
[0035]所述纯化步骤如下。
[0036](I)机械破碎:将发酵罐高密度培养获取的菌体溶液pH6.0?8.0无菌0.9%NaCl溶液中混匀，然后通过蠕动栗将菌悬液栗入破碎机中进行连续破碎，玻璃珠粒径范围0.45-1.25mm，破碎率不低于80%，冷冻高速离心收集上清液。
[0037](2)预过滤:采用0.2+0.45um滤芯对离心后上清液进行预过滤，获取预过滤澄清液。
[0038](3 )等电点沉淀1:选用0.5?1.0MHCl调节预过滤澄清液pH至3.0?4.5，4 °C放置2?3小时，4000?5000rpm，4°C离心10?15min，收集沉淀溶液无菌0.9%NaCl溶液中，用0.5?
1.0MNaOH溶液调节pH至7.0?7.2。
[0039](4 )等电点沉淀2:选用0.5?I.0MHCl调节预过滤澄清液pH至4.5?6.5，4 °C放置2?3小时，4000?5000rpm，4°C离心10?15min，收集沉淀溶液无菌0.9%NaCl溶液中，用0.5?
1.0MNaOH溶液调节pH至7.0?7.2。
[0040](5)酶解:采用G-250或Lorry法测定复溶液总氮含量，按照
60?10mg总氮对应I?1mgTrypsin，加入Trypsin振荡溶解后，调节pH至8.0?8.2，30-37 °C孵育2?3小时，然后取出放置室温，调节pH至6.5 ± 0.5。
[0041 ] (6)透析:采用I?1KD透析膜对酶解液进行透析24?48小时，除菌过滤保存。
[0042]实施例3金黄色葡萄球菌类毒素原液。
[0043]对金黄色葡萄球菌CMCC26002进行发酵罐高密度培养，收集菌悬液。通过离心、脱毒、预过滤、超滤、酸沉淀、离心对金黄色葡萄球菌类毒素组分进行分离纯化，获取高保护性的金黄色葡萄球菌类毒素抗原原液，工艺流程如图3所示。
[0044]所述纯化步骤如下。
[0045](I)离心:通过10000?12000rpm，4°C，10?15min冷冻高速离心，收集上清液。
[0046](2)脱毒:加入0.4?I.0%甲醛溶液或戊二醛溶液，30?37 °C，pH6.8?7.2脱毒5?7天。
[0047](3)预过滤:采用0.2+0.45um滤芯对离心后上清液进行预过滤，获取预过滤澄清液。
[0048](4)超滤:选用10?30KD超滤膜包对预过滤上清液滤析100?1000倍，然后浓缩至20?30倍。
[0049](5)酸沉淀:加入NaCl晶体，使终浓度为10?30%，选用0.5?1.0MHCl溶液调节超滤液pH为3.0?5.0，4°C沉淀2?3小时。
[0050](6)离心:通过4000?5000rpm，4°C，10?15min离心，收集沉淀，加入生理盐水溶液复溶，调节PH为6.8?7.2，除菌过滤保存。
[0051 ]实施例4铜绿假单胞菌类毒素原液。
[0052]对PAlOl进行发酵罐高密度培养，离心收集上清液。通过加入脱毒、预过滤、超滤对铜绿假单胞菌类毒素进行分离纯化，获取高保护性的铜绿假单胞菌类毒素抗原原液，工艺流程如图4所示。
[0053]所述纯化步骤如下。
[0054](I)离心:过10000?12000rpm，4°C，10?15min冷冻高速离心，收集上清液。
[0055](2)脱毒:加入0.4?I.0%甲醛溶液或戊二醛溶液，30?37°C，pH6.8?7.2。
[0056]脱毒12?15天。
[0057](3)预过滤:采用0.2+0.45um滤芯对离心后上清液进行预过滤，获取预过滤澄清液。
[0058](4)超滤1:选用300?1000KD超滤膜包对预过滤上清液滤析100?1000倍，收集超滤液。
[0059](5)超滤2:选用10?30KD超滤膜包对预过滤上清液滤析100?1000倍，然后浓缩至1?15倍，除菌过滤保存。
[0060]实施例5奇异变形杆菌6价抗原混合液制备。
[0061]选择6株奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原，经过冷冻干燥，要求冻干抗原残留水份控制在3.0?8.0%，测定单一抗原干重，要求单一抗原干重不低于2mg/ml，将每一株抗原加入生理盐水稀释成浓度为9ug/ml或其倍数，然后6株抗原按照配比1: 1:1:1:1: I进行混合，其余用生理盐水补足，摇勾调节pH6.8?7.2，制备成奇异变形杆菌6价抗原混合液。
[0062]实施例6奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备。
[0063]奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备过程如下:制备Iml吸附联合疫苗制剂的有效剂量需要奇异变形杆菌抗原混合液48?60ug，金黄色葡萄球菌胞质抗原组分0.8?1.2mg，金黄色葡萄球菌类毒素抗原组分3?8EC，铜绿假单胞菌类毒素组分20?50ug，0.8?1.2mg铝佐剂。制备流程在图5中表示。
【主权项】
1.一种奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备方法，采用多株奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌进行制备而成，其特征在于有以下步骤: (1)奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原原液制备； (2)金黄色葡萄球菌胞质抗原原液制备； (3)金黄色葡萄球菌类毒素原液制备； (4)铜绿假单胞菌类毒素原液制备； (5)奇异变形杆菌6价抗原混合液制备； (6)奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备。2.根据权利要求1所述的一种奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备方法，其特征在于步骤(I)奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原原液制备:是指奇异变形杆菌经过高密度培养、在位消化、离心、预过滤、超滤、乙醇沉淀、除菌过滤制备而成的，在位消化是由胰酶消化获得的，在位消化过程中，4.0?6.0X 19个/ml细菌浓度加入I?2g胰酶，超滤所使用的超滤膜包孔径为10?30KD。3.根据权利要求1所述的一种奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备方法，其特征在于步骤(2)金黄色葡萄球菌胞质抗原原液制备:是指由金黄色葡萄球菌经过高密度培养、离心、机械破碎、离心、等电点沉淀1、等电点沉淀2、酶解、透析、除菌过滤步骤获得的，机械破碎使用的玻璃珠粒径为0.45?0.6mm，破碎率不低于80%，等电点沉淀I要求pH为3.0?4.5，等电点沉淀2要求pH为4.5?6.0，酶解使用胰蛋白酶含量为:1L，60?lOOmg/1总氮对应I?1mg胰蛋白酶，透析使用透析袋孔径为I?1KD04.根据权利要求1所述的一种奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备方法，其特征在于步骤(3)金黄色葡萄球菌类毒素原液制备:是指由金黄色葡萄球菌经过高密度培养、离心、脱毒、超滤、酸沉淀、离心、除菌过滤骤获得的，脱毒使用0.4%?I.0%甲醛或戊二醛、pH6.8?7.2、30?37°C脱毒5?7天，超滤使用超滤脓包孔径为10?30KD，酸沉淀中含有氯化钠浓度为0_30%，pH为3.0?5.0。5.根据权利要求1所述的一种奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备方法，其特征在于步骤(4)铜绿假单胞菌类毒素原液制备:是指由铜绿假单胞菌经过高密度培养、离心、脱毒、超滤1、超滤2、除菌过滤步骤获得的，脱毒使用0.4?1.0%甲醛或戊二醛、pH6.8?7.2、30?37°C脱毒12?15天，超滤I使用超滤脓包孔径为300?1000KD，超滤2使用超滤脓包孔径为10?30KD。6.根据权利要求1所述的一种奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备方法，其特征在于步骤(5)奇异变形杆菌6价抗原混合液制备:是指将6株奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原根据抗原浓度按照1: 1:1:1:1: I进行配伍混合而成。7.根据权利要求1所述的一种奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备方法，其特征在于步骤(6)奇异变形杆菌-金黄色葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗(PSP吸附联合疫苗)制备:是指将6价奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原、金黄色葡萄球菌胞质抗原、金黄色葡萄球菌类毒素、铜绿假单胞菌类毒素、铝凝胶及无机盐组成按照一定比例混合，6价奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原在吸附联合疫苗中浓度为48yg/ml?60yg/ml，其中每一株奇异变形杆菌的单一浓度为8?10ug/ml，金黄色葡萄球菌胞质抗原在吸附联合疫苗中浓度为0.Smg?1.2mg/ml;金黄色葡萄球菌类毒素在吸附联合疫苗中浓度为3 EC/ml?8EC/ml，铜绿假单胞菌类毒素在吸附联合疫苗中浓度为20yg/ml?50yg/ml，氢氧化招凝胶在吸附联合疫苗中浓度为0.8mg?1.2mg/ml ；吸附联合疫苗pH为6.8?7.5，疫苗中佐剂为铝凝胶，是指氢氧化铝凝胶、磷酸铝凝胶或氧化铝凝胶，或按照配方自制符合药典标准的铝凝胶。
【专利摘要】本发明公开了一种奇异变形杆菌?金黄色葡萄球菌?铜绿假单胞菌吸附联合疫苗的制备方法，该方法包括：（1）奇异变形杆菌培养液经过在位消化、高速离心、预过滤、超滤及沉淀，获取适当的奇异变形杆菌胞膜可溶性抗原原液；（2）金黄色葡萄球菌菌悬液经过离心、破碎、再离心、过滤、沉淀、酶解、透析获得适当的金黄色葡萄球菌胞质抗原原液；（3）金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌培养液经离心、预过滤、加入福尔马林脱毒去毒后纯化，获取适当的灭活金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌类毒素原液。该疫苗通过肌肉深层注射途径，用于预防烧伤、烫伤、术前后奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌一种或多种条件致病菌引起的感染。
【IPC分类】A61K39/085, A61K39/104, A61P31/04, A61K39/02
【公开号】CN105709218
【申请号】CN201610154756
【发明人】周荔葆, 杨文腰, 王瀛, 修雪亮, 王 琦, 张建, 戴泽文
【申请人】辽宁成大生物股份有限公司
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年3月18日