专利名称：：一种人附睾蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物医学领域，特别是一种关于避孕的多肽疫苗。
背景技术：
：计划生育是我国的基本国策，为有效地控制人口过度增长，开发新型的安全、可逆避孕措施一直是计划生育研究的重要课题。目前男性避孕只能在避孕套和输精管结扎手术之间选择。前者失败率较高，后者具有不可逆性，且可能产生预想不到的严重免疫学后果，如持续高水平的抗精子抗体滴度和/或睾丸形态学的改变，故两者均无法令人满意。20多年来，国内外科学家一直在努力研制避孕疫苗，试图促使男性的免疫系统破坏精子，使其暂时失去生育能力。开展的研究主要集中于针对居留于精子和男性生殖道的特异性靶抗原制备疫苗，如PH-20、受精抗原-1，顶体抗原SP-IO，受精素p等，尤其是多价疫苗的开发可明显抑制动物的精卵结合与融合，但受孕抑制率仍停留在50%左右。鉴于此，开发创新性避孕措施是当前避孕研究的迫切需要。由于受精起源于两性配子细胞的结合，设想以射精后精子的自我保护分子机制为立足点，靶向性破坏精子受精能力，可以在保证生活质量的前提下有效遏制精卵结合，将可能成为男性避孕的新理念。研究表明射精后的精液中，精子表面的Eppin与精囊蛋白Semenogelin(Sg)相结合。精子最初呈不动状态，随后前列腺分泌的丝氨酸蛋白激酶前列腺特异性抗原(PSA)水解其生理底物Sg，释放活动的精子，精液开始液化，精子开始获能，期间精子膜表面发生一系列的改变，其表面的粘附分子经过一系列修饰和/或脱失，以及膜外周蛋白(失能因子)被移除。Eppin-Sg复合物结合在射出的精子表面，其生理意义可能在于保护精子，Eppin含有两个功能结构域，分别具有抗菌和抑制蛋白酶水解作用，为精子在女性生殖道中保持生育能力起到天然免疫作用，同时保护精子免遭蛋白酶水解。其中2973氨基酸残基之间为乳清酸蛋白(wheya2cidicprotein,WAP)结构域，77127之间为牛胰蛋白酶抑制蛋白(bovinepanocreatictrypsininhibitor,BPTI)结构域，又称Kunitz抑制蛋白结构域。抗Eppin抗体可直接破坏Eppin-Sg复合体，千扰Eppin调控PSA对Sg的水解作用，是抗Eppin抗体造成免疫性不育的分子基础。疫苗促使机体产生高滴度抗体的前提是疫苗具有强免疫原性。现代保护性免疫理论认为，有效的保护性免疫源于一组表位的合理组合和搭配。蛋白质抗原并非通过其完整分子发挥功能，而是通过其表位体现其特异性。就某一蛋白质抗原而言，它不仅含有B细胞表位、Th细胞表位、CTL表位、NK细胞表位、MHC限制位等与免疫识别密切相关的结构，同时还含有毒性或抑制性表位、优势非中和性表位、病理与自身抗原交叉反应性表位等，它们可引起免疫偏移、免疫颠覆等不利的免疫反应而导致免疫耐受。由于许多天然抗原引发的免疫反应不能满足预防感染或预防发病的需要，因此，为了提高蛋白质抗原的保护性，就必须在表位水平上做出选择，摒除后者，保留、改善前者以得到更理想的疫苗分子。我们既往提出了用模拟抗原(Mimogen)进行特异性免疫的思路和创立了"Epitope-basedVaccineDesign,EBVD(根据抗原表位设计疫苗)"技术路线，并在乙肝和肿瘤模型的mimogen设计上得到成功验证。模拟抗原在抗原特性上与天然抗原不同，而引起的免疫反应特异性与天然抗原无异。它摒除了致病性表位、优势非保护性表位、亚优势保护性表位、交叉反应性表位等不利组分，具有更好的针对性。
发明内容本发明的目的就是提供一种有效的人附睾蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，它避孕效率高，而且无毒副作用。本发明的目的是通过这样的技术方案实现的一种人附睾蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，它基本的氨基酸序列为氨基端-LSEIKGVIVHRLEGVGGG-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该基本的氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。本发明的基本的氨基酸序列来源于GENBANK报道的人附睾蛋白酶抑制基因的氨基酸序列(GENBANK登录号为AF286368，公开日为2001年6月14日)，如图1所示，采用蛋白质表位分子设计的原理和方法，对图l所示的蛋白质序列进行二级结构、抗原性、B细胞表位、亲水性质、疏水性质的分析研究，找到了具有功能的本发明所指的基本的氨基酸序列。氨基酸序列为MGSSGLLSLLVLFVLLANVQGPGLTDWLFPRRCPKIREECEFQERDVCTKDRQCQDNKKCCWSCGKKCLDLKQDVCEMPKETGPCLAYFLHWWYDKKDNTCSMFVYGGCQGNNNNFQSKANCLNTCKNKRFP本发明所指的基本的氨基酸序列的用途按80微克/只/次的剂量与福氏佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股沟皮下组织部位;7天后，按同样的方法，以50微克/只欣的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位;4再过7天，按同样的方法，50微克/只次的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。末次免疫后14天，将接受免疫的小鼠尾静脉取血，收集其血清，按酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测小鼠血清中的抗体滴度，显著高于空白对照组、PBS对照组和无关肽对照组，取得了明显的疫苗效果，见图l。另外，取健康人志愿者精液提取蛋白，与本发明的基本的氨基酸序列作为疫苗免疫上述小鼠的血清反应，酶联免疫吸附实验(ELISA法)结果为阳性，可以中和精液中的抗原成分，见图2。避孕观察将实验组抗原肽免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，对照组(PBS对照组、空白对照组和无关肽对照组)免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，三周后分别观察记录各组雌小鼠的产仔率。可以获得高效的避孕效果，见图6。实验例l:本发明的基本的氨基酸序列免疫小鼠的实验结果主要试剂及其配制包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)组成Na2C031.5gNaHC032.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至lOOOml，调至pH9.6;封闭液(5X小牛血清/PBS溶液)组成小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml;磷酸盐缓冲液(PBS):A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成NaH2P04，H2027.6g溶于超纯水lOOOml。B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成Na2HP04'7H2053.6g(或Na2HP04'12H2071.6g或Na2HP04.2H2035.6g)溶于超纯水1000ml。样本稀释液(PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分PBA液19ml:PBB液81ml:NaG118.5;超纯水lOOOml。洗涤液(PBST，pH7.4)组成PBS液lOOOml加Tween200.5ml，硫柳汞O.lg，调至pH7.4。底物液(OPD-H202)组成及其来源OPD(邻苯二胺〈盐酸盐〉)(Sigma公司，USA)A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成柠檬酸19.2§，加蒸馏水至lOOOml。B液(0.2mol/LNa2HP04溶液)组成Na2HP04'12H2071.7g，加蒸馏水至lOOOml。终止液(2mol/LH2S04溶液)组成双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。新生小牛血清(Hyclone公司，USA):原装进口，已经过56°C，30分钟水浴灭活补体，批号AJH10710。辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京华美公司分装)。福氏完全佐剂(CFA):RPMIgedium1640(Hyclone公司，USA);Hanks液(hyclone公司，USA);Hepes(GmbH公司，Germany)。主要仪器酶标仪(Thermolabsystemsmultiskanspectrum,USA)、电子天平(AEL-160,LIBROR，日本产)、pH测定仪(~ODEL450，BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶联板(Labsystern公司，USA)、电热恒温水热箱(S648，上海医疗器械七厂，中国)。实验方法实验动物分组健康Balb/c小鼠(北京军事医学科学院实验动物中心提供)40只，雄性，6~8周龄，10~16g，随机分为6组对照组3只，权利要求1~5的氨基酸序列作为疫苗分别分成组，按相同的方法和剂量免疫小鼠，每组10只。免疫程序按80微克/只/次的剂量与福氏佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股沟皮下组织部位；7天后，按同样的方法，以50微克/只.次的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位；再过14天，按同样的方法，50微克/次.只的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠尾静脉放血，收集其血清。标本的采集和分离将免疫小鼠尾静脉放血，分离血清，并冻存于一20。C冰箱保存备用。间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液见前。酶标二抗为羊抗小鼠IgG,底物为OPD;用96孔酶联板包被抗原浓度为10吗/mL，10(^1/孔，置37°C恒温水浴箱4小时后，弃去孔中液体；用5%BSA-PBS封闭酶标反应孔，37°(:恒温水浴箱40分钟后，洗漆液满孔洗涤3遍，每遍3分钟。按照10倍连续稀释的血清比例加入各孔，100|al/L，37°C恒温水浴箱1小时后洗涤3遍；加入酶标二抗，37°C恒温水浴箱40分钟，加入底物液OPD,100pl/L置37。C蔽光显色反应20分钟，终止反应，于20分钟内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照OD值>2.1判定为阳性。实验例2，免疫小鼠的抗体与人精液蛋白抽提液反应6间接酶联免疫(ELISA)方法同实验例1，取健康志愿者精液，蛋白抽提离心后取上清液体，与小鼠血清反应，用ELISA的方法检测，鉴定的方法同实验例l，结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照OD值〉2.1判定为阳性。实验例3，多肽疫苗的合成采用标准Fmoc方案，起始选用0.0125mmo1，PSC树脂(ABI公司产品)，分别按照权利要求1所述的序列特征、权利要求2所述的序列特征、权利要求3所述的序列特征、权利要求4所述的序列特征、权利要求5所述的序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸原料(美国ABI公司生产)的用量为O.lmmol。各种氨基酸保护基团是各氨基酸的a氨基为Pmoc保护，其余侧链保护基团，Arg(Mtr)、tyr(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(tBu)、Asp(OtBu)。每步縮合都加入HoBt/Dcc活化保护氨基酸的羧基。每步縮合用含有20X六氢吡啶的NMP溶液去除Fmoc保护基，肽链合成后，按照ABI公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液的成分结晶苯酸0.75g、酒石酸乙二胺(EDT)0.25ml、苯硫基甲垸(Thionaisole)0.5ml、去离子水0.5ml、三氟乙酸10ml。在室温条件下持续搅拌，反应时间为4.5小时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至l~2ml，加乙醚50ml使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是肽产品。以上过程都是在ABI-431A固相自动肽合成仪(美国生产)上完成。图4为按照权利要求1所述的序列特征所合成多肽疫苗的高压液相色谱仪(HPLC)分析结果，图5为按照权利要求1所述的序列特征所合成多肽疫苗的质谱图。本发明的有益效果是本发明涉及的各氨基酸原料可以室温保存、运输；本发明涉及的合成多肽疫苗可以室温保存、运输；本发明涉及的合成多肽疫苗可以自动化批量生产；本发明涉及的合成多肽疫苗均属机体成分，无毒副作用。总之，本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点，它具有显著免疫原性和抗原性，免疫效果明显，而且无毒副作用。本发明的如下图l为本发明的基本的氨基酸序列作为疫苗免疫小鼠的结果；图2为本发明基本的氨基酸序列免疫小鼠血清与人精子液的反应结果；图3为本发明的5项权利要求疫苗免疫小鼠的结果；图4为本发明的基本的氨基酸序列的纯度分析(HPLC测定)；HPLC纯度鉴定结果，纯度为^90%。图5为本发明的基本的氨基酸序列的质谱分析；图6为本发明的避孕效果分析。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明实施例1:本发明基本的氨基酸序列为氨基端-LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该基本的氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。本发明所指的基本的氨基酸序列的用途按80微克/只/次的剂量与福氏佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股沟皮下组织部位；7天后，按同样的方法，以50微克/只/次的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位；再过14天，按同样的方法，50微克/次/只的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠尾静脉放血，收集其血清，按酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测小鼠血清中的抗体滴度，显著高于各个对照组，取得了明显的疫苗效果，见图1。另外，取健康志愿者精液抽提的上清液，与本发明的基本的氨基酸序列作为疫苗免疫上述小鼠的血清反应，酶联免疫吸附实验(ELISA法)结果为阳性，可以中和人精液中的抗原成分，见图2。实验l，本发明的基本的氨基酸序列免疫小鼠的实验结果主要试剂及其配制包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)组成Na2C031.5g，NaHC032.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至PH9.6。封闭液(5X小牛血清/PBS溶液)组成小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。磷酸盐缓冲液(PBS):A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成Na2P04.H2027.6g溶于超纯水lOOOml。B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成:Na2HP(V7H2053.6g(或Na2HP04-12H2071.6g或Na2HP04.2H2035.6g)溶于超纯水lOOOml。样本稀释液(PBS，0.01mo/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分PBA液19ml;PBB液81ml;Na以18.5;超纯水1000ml。8洗涤液(PBST，pH7.4)组成PBS液100ml加Tween200.5ml,硫柳汞O.lg，调至pH7.4。底物液(OPD-H202)组成及其来源0PD(邻苯二胺盐酸盐)(Sigma公司，USA):北京鼎国生物技术发展中心分装，原批号P1526。A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成柠檬酸19.2g，加蒸馏水至lOOOml。B液(0.2mol/LNa2HP04溶液)组成Na2HP04'12H2071.7g，加蒸馏水至1000ml。终止液(0.2mol/LH2S04溶液)组成双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。新生小牛血清(Hyclone公司，USA):原装进口，已经过56°C，30分钟水浴灭活补体，批号AJH顧O。辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京华美公司分装)。福氏完全佐剂(CFA)组成羊毛脂70g加液体石蜡30ml，充分混匀后分装于10Qnl清洁玻璃瓶中，8磅灭菌15分钟后4保存待用。卡介苗(批号；991106，成都生物制品研究所)。RPM工Mediuml640(Hyclone公司，USA)。Hanks液(Hyclone公司，USA)。Hepes(GmhH公司，Germany)。主要仪器酶标仪(Thermolabsystemsmultiskanspectrum，USA)、电子天平(AEL-160,LIBROR，日本产)、pH测定仪(MODEL450，BI0~RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶联板(Labsystem公司，USA)、电热恒温水热箱(S648，上海医疗器械七厂，中国)、微量多头细胞收集器(卫星牌ZT—口型，绍兴卫星机械公司)。实验方法实验动物分组健康Balb/c小鼠(第三军医大学实验动物中心提供)43只，雌性，6~8周龄，1016g，随机分为6组正常对照组3只，权利要求1~5的氨基酸序列作为疫苗分别分成组，按相同的方法和剂量免疫小鼠，每组10只。免疫程序按1加微克/只.次的剂量与福氏佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股沟皮下组织部位；14天后，按同样的方法，以50微克/只.次的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位再过14天，按同样的方法，50微克/次。只的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠眼眶放血，收集其血清。标本的采集和分离将免疫小鼠眶静脉放血，分离血清，并冻存于-20。C冰箱保存备用。间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液见前。酶标二抗为羊抗小鼠IgG，底物为OPD;用96孔酶联板包被抗原浓度为10吗/ml，10(Hil/L，置37^恒温水浴箱4小时后，弃去孔中液体用5XBSA—PBS封闭酶标反应孔，37°(:恒温水浴箱40分钟后，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3分钟。按照10倍连续稀释的血清比例加入各孔，100pl/L，37°C恒温水浴箱1小时后洗涤3遍加入酶标二抗，37°C恒温水浴箱40分钟，加入底物液OPD，10(HU/L，置37。C蔽光显色反应20分钟，终止反应，于20分钟内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照OD值>2.1判定为阳性。实验2，免疫小鼠的抗体与人精液蛋白抽提液反应间接酶联免疫(ELISA)方法同实验例1，取健康志愿者精液，蛋白抽提离心后取上清液体，与小鼠血清反应，用ELISA的方法检测，鉴定的方法同实验例l，结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照OD值〉2.1判定为阳性。实验3，多肽疫苗的合成采用标准Fmoc方案，起始选用0.0125mmo1，PSC树脂(ABI公司)，分别按照权利要求1所述的序列特征、权利要求2所述的序列特征、权利要求3所述的序列特征、权利要求4所述的序列特征、权利要求5所述的序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸原料(美国AB工公司生产)的用量为O.lmmol。各种氨基酸保护基团是各氨基酸的P氨基为Pmoc保护，其余侧链保护基团，Arg(Mtr)、tyr(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(但u)、Asp(0tBu)。每步縮合都加入HoBt/Dcc活化保护氨基酸的羧基。每步縮合用含有20X六氢吡啶的NMP溶液去除Fmoc保护基，肽链合成后，按照ABI公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液的成分结晶苯酸0.75g、酒石酸乙二胺(EDT)0.25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole)0.5ml、去离子水0.5ml、三氟乙酸10ml。在室温条件下持续搅拌，反应时间为4-5小时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将混合液经4G的玻璃滤器过滤,以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至l2ml，加乙醚50ml使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是肽产品。以上过程都是在ABI431A固相自动肽合成仪(美国生产)上完成。图4为按照权利要求l所述的序列特征所合成多肽疫苗的高压液相色谱仪(HPLC)分析结果图5为按照权利要求1所述的序列特征所合成多肽疫苗的质谱图。10实施例2:本发明的基本氨基酸序列也可以为MFVYGGCQGNNNN\LSEIKGVIVHRLEGV<^主要试剂及其配制包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pU9.6)组成Na2C031.5g，NaHC032.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6。封闭液(5X小牛血清/PBS溶液)组成小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。磷酸盐缓冲液(PBS):A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成NaH2P(VH2027.6g溶于超纯水lOOOml。B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成Na2HP04'7H2053.6g(或Na2HP04'12H2071.6g或Na2HP04'2H2035.6g)溶于超纯水lOOOml。样本稀释液(PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分PBA液19mhPBB液81ml;NaCl18.5;超纯水lOOOml。洗涤液(PBST，pH7.4)组成PBS液lOOOml加Tween200,5ml，硫柳荥O.l，调至pH7.4。底物液(0PD~~H202)组成及其来源OPD(邻苯二胺<盐酸盐>)(Sigma公司，USA):北京鼎国生物技术发展中心分装，原批号P1526。A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成柠檬酸19.28,加蒸馏水至lOOOml。B液(0.2mol/LNa2HP04溶液)组成Na2HP04'12H2071.7g，加蒸馏水至lOOOml。终止液(2mol/LH2S04溶液)组成双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。新生小牛血清(Hyclone公司，USA):已经过56。C，30分钟水浴灭活补体。辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠lgG(Nordic公司，USA，北京华美公司分装)。福氏完全佐剂(CFA):SigmaF5881福氏不完全佐剂(CFA)组成SigmaF009-l。RPMIMedium1640(Hyclone公司，USA)。Hanks液(Hyclone公司，USA)。-Hepes(GmbH公司，Germany)。主要仪器酶标仪(Thermolabsystemsmultiskanspectrum,USA)、电子天平(AEL-160,LIBROR，日本产)、pH测定仪(MODEL450，BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶联板(Labsystern公司，USA)、电热恒温水热箱(S648，上海医疗器械七厂，中国)。实验方法实验动物分组健康Balb/c小鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，雌性，6~8周龄，1016g，随机分组正常对照组5只，按权利要求2的氨基酸序列作为疫苗，按相同的方法和剂量免疫10只小鼠。免疫程序按80微克/只/次的剂量与福氏完全佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股沟皮下组织部位；7天后，按同样的方法与福氏不完全佐剂等量混合，以50微克/只/次的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位；再过14天，按同样的方法，50微克/次/只的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠尾静脉放血，收集其血清。标本的采集和分离将免疫小鼠尾静脉放血，分离血清，并冻存于-20。C冰箱保存备用o间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液见前。酶标二抗为羊抗小鼠IgG，底物为OPD;用96孔酶联板包被抗原浓度为10pg/ml，如100^1/孔，置37。C恒温水浴箱4小时后，弃去孔中液体用5XBSA-PBS封闭酶标反应孔，37°C恒温水浴箱40分钟后，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3分钟。按照10倍连续稀释的血清比例加入各孔，100^1/孔，37°C恒温水浴箱1小时后洗涤3遍；加入酶标二抗，37。C恒温水浴箱40分钟，加入底物液OPD，10(Hil/孔，置37°C蔽光显色反应20分钟，终止反应，于20分钟内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照0D值〉2.1判定为阳性。避孕观察将实验组抗原肽免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，对照组(PBS对照组、空白对照组和无关肽对照组)免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，三周后分别观察记录各组雌小鼠的产仔率。实施例3:本发明的基本氨基酸序列也可以为LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNN1SN^LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN主要试剂及其配制包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pU9.6)组成Na2C031.5g，NaHC032.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6。封闭液(5X小牛血清/PBS溶液)组成小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。磷酸盐缓冲液(PB):A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成NaH2P04'H2027.6g溶于超纯水1000ml。B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成Na2HP04'7H2053.6g(或Na2HP04'12H2071.6g或Na2HP(V2H2035.6g)溶于超纯水1000ml。样本稀释液(PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分PBA液19ml;PBB液81ml;NaCl18.5;超纯水lOOOml。洗涤液(PBST，pH7.4)组成PBS液lOOOml加Tween200，5ml，硫柳汞O.l，调至pH7.4。底物液90PD—H202)组成及其来源:OPD(邻苯二胺〈盐酸盐力(Sigma公司，USA):北京鼎国生物技术发展中心分装，原批号P1526。A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成柠檬酸19.2g，加蒸馏水至1000ml。B液(0.2mol/LNa2HP04溶液)组成Na2HP04'12H2071.7g，加蒸馏水至1000ml。终止液(2mol/LH2S04溶液)组成双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。新生小牛血清(Hyclone公司，USA):己经过56°<:，30分钟水浴灭活补体。辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京华美公司分装)。福氏完全佐剂(CFA):SigmaF5881福氏不完全佐剂(CFA)组成SigmaF009-l。RPMIMedium1640(Hyclone公司，USA)。Hanks液(Hyclone公司，USA)。Hepes(GmbH公司，Germany)。，13主要仪器酶标仪(Theraiolabsystemsmultiskanspectrum,USA)、电子天平(AEL隱160，LIBROR，曰本产)、pH测定仪(MODEL450，BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶联板(Labsystern公司，USA)、电热恒温水热箱(S648,上海医疗器械七厂，中国)。实验方法实验动物分组健康Balb/c小鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，雌性，6~8周龄，1(M6g，随机分组正常对照组5只，按权利要求2的氨基酸序列作为疫苗，按相同的方法和剂量免疫IO只小鼠。免疫程序按80微克/只/次的剂量与福氏完全佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股沟皮下组织部位；7天后，按同样的方法与福氏不完全佐剂等量混合，以50微克/只/次的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位；再过14天，按同样的方法，50微克/次/只的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠尾静脉放血，收集其血清。标本的采集和分离将免疫小鼠尾静脉放血，分离血清，并冻存于-2(fC冰箱保存备用。间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液见前。酶标二抗为羊抗小鼠IgG，底物为OPD;用96孔酶联板包被抗原浓度为10pg/ml，如100^1/孔，置37°(:恒温水浴箱4小时后，弃去孔中液体用5XBSA-PBS封闭酶标反应孔，37°C恒温水浴箱40分钟后，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3分钟。按照10倍连续稀释的血清比例加入各孔，100nl/L，37°<:恒温水浴箱1小时后洗涤3遍；加入酶标二抗，37。C恒温水浴箱40分钟，加入底物液OPD，100nl/L，置37°C蔽光显色反应20分钟，终止反应，于20分钟内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照0D值>2.1判定为阳性。避孕观察将实验组抗原肽免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，对照组(PBS对照组、空白对照组和无关肽对照组)免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，三周后分别观察记录各组雌小鼠的产仔率。实施例4:本发明的基本氨基酸序列也可以为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>主要试剂及其配制包被稀释液(O.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pU9.6)组成Na2C031.5g，NaHC032.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至lOOOml，调至pH9.6。封闭液(5X小牛血清/PBS溶液)组成小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。磷酸盐缓冲液(PB):A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成NaH2P(VH2027.6g溶于超纯水lOOOml。B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成Na2HP04'7H2053.6g(或Na2HP04'12H2071.6g或Na2HP(V2H2035.6g)溶于超纯水lOOOml。样本稀释液(PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分PBA液19ml:洗涤液(PBST，pH7.4)组成PBS液lOOOml加Tween200，5ml，硫柳汞O.l,调至pH7.4。底物液(0PD~202)组成及其来源OPD(邻苯二胺<盐酸盐>)(Sigma公司，USA):北京鼎国生物技术发展中心分装，原批号P1526。A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成柠檬酸19,2g，加蒸馏水至lOOOml。B液(0.2mol/LNa2HP04溶液)组成Na2HP04'12H2071.7g，加蒸馏水至lOOOml。终止液(2mol/LH2S04溶液)组成双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。新生小牛血清(Hyclone公司，USA):已经过56°<:，30分钟水浴灭活补体。辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京华美公司分装)。福氏完全佐剂(CFA):SigmaF5881福氏不完全佐剂(CFA)组成SigmaF009-l。RPMIMedium1640(Hyclone公司，USA)。Hanks液(Hyclone公司，USA)。Hepes(GmbH公司，Germany)。主要仪器酶标仪(Thermolabsystemsmultiskanspectrum,USA)、电子天平(AEL-160，LIBROR，日本产)、pH测定仪(MODEL450，BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶联板(Labsystem公司，USA)、电热恒温水热箱(S648，上海医疗器械七厂，中国)。实验方法实验动物分组健康Balb/c小鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，雌性，6~8周龄，10~16g，随机分组正常对照组5只，按权利要求2的氨基酸序列作为疫苗，按相同的方法和剂量免疫10只小鼠。免疫程序按80微克/只/次的剂量与福氏完全佐剂等量混合，注入Balb/c小鼠腹股沟皮下组织部位；7天后，按同样的方法与福氏不完全佐剂等量混合，以50微克/只/次的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位；再过14天，按同样的方法，50微克/次/只的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠尾静脉放血，收集其血清。标本的采集和分离将免疫小鼠尾静脉放血，分离血清，并冻存于-20。C冰箱保存备用o间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液见前。酶标二抗为羊抗小鼠IgG，底物为OPD;用96孔酶联板包被抗原浓度为10ng/ml，如100nl/L置37。C恒温水浴箱4小时后，弃去孔中液体用5XBSA-PBS封闭酶标反应孔，37°C恒温水浴箱40分钟后，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3分钟。按照10倍连续稀释的血清比例加入各孔，10(Hil/孔，37。C恒温水浴箱l小时后洗涤3遍；加入酶标二抗，37T恒温水浴箱40分钟，加入底物液OPD,100nl/孔，置37°C蔽光显色反应20分钟，终止反应，于20分钟内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照0D值〉2.1判定为阳性。避孕观察将实验组抗原肽免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，对照组(PBS对照组、空白对照组和无关肽对照组)免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，三周后分别观察记录各组雌小鼠的产仔率。实施例5:本发明的基本氨基酸序列也可以为16K\KKLSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNNLSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNNLSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNNLSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN主要试剂及其配制包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pU9.6)组成Na2C031.5g,NaHC032.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6。封闭液(5X小牛血清/PBS溶液)组成-小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。磷酸盐缓冲液(PB):A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成NaH2P04'H2027.6g溶于超纯水lOOOml。B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成Na2HP04.7H2053.6g(或Na2HP04，12H2071.6g或Na2HP04'2H2035.6g)溶于超纯水lOOOml。样本稀释液(PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分PBA液19ml;PBB液81ml;NaC118.5;超纯水lOOOml。洗涤液(PBST，pH7.4)组成PBS液lOOOml加Tween200，5ml，硫柳隶O.l，调至pH7.4。底物液(0PD~~H202)组成及其来源OPD(邻苯二胺<盐酸盐>)(Sigma公司，USA):北京鼎国生物技术发展中心分装，原批号P1526。A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成柠檬酸19,2g，加蒸馏水至lOOOml。B液(0.2mol/LNa2HP04溶液)组成Na2HP04'12H2071.7g，加蒸馏水至lOOOml。终止液(2mol/LH2S04溶液)组成双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。新生小牛血清(Hyclone公司，USA):己经过56。C，30分钟水浴灭活补体。辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京华美公司分装)。福氏完全佐剂(CFA):SigmaF5881福氏不完全佐剂(CFA)组成SigmaF009-l。RPMIMedium1640(Hyclone公司，USA)。Hanks液(Hycone公司，USA)。Hepes(GmbH公司，Germany)。主要仪器酶标仪(Thermolabsystemsmultiskanspectrum,USA)、电子天平(AEL-160,LIBROR，曰本产)、pH测定仪(MODEL450,BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶联板(Labsystem公司，USA)、电热恒温水热箱(S648,上海医疗器械七厂，中国)。实验方法实验动物分组健康Balb/c小鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，雌性，6~8周龄，10~16g，随机分组正常对照组5只，按权利要求2的氨基酸序列作为疫苗，按相同的方法和剂量免疫10只小鼠。免疫程序按80微克/只/次的剂量与福氏完全佐剂等量混合，注入BaJb/c小鼠腹股沟皮下组织部位；7天后，按同样的方法与福氏不完全佐剂等量混合，以50微克/只/次的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位；再过14天，按同样的方法，50微克/次/只的剂量注射Balb/c小鼠腹股沟的皮下组织部位。观察28天，将接受免疫的小鼠尾静脉放血，收集其血清。标本的采集和分离将免疫小鼠尾静脉放血，分离血清，并冻存于-20。c冰箱保存备用o间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液见前。酶标二抗为羊抗小鼠IgG，底物为OPD;用96孔酶联板包被抗原浓度为10ng/ml,如100^1/孔，置37。C恒温水浴箱4小时后，弃去孔中液体用5XBSA-PBS封闭酶标反应孔，37°C恒温水浴箱40分钟后，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3分钟。按照10倍连续稀释的血清比例加入各孔，100pl/孑L，37°(:恒温水浴箱1小时后洗涤3遍；加入酶标二抗，37。C恒温水浴箱40分钟，加入底物液opd，100h1/孔，置37°c蔽光显色反应20分钟，终止反应，于20分钟内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照0D值>2.1判定为阳性。避孕观察将实验组抗原肽免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，对照组(PBS对照组、空白对照组和无关肽对照组)免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，三周后分别观察记录各组雌小鼠的产仔率，见图6。、实验4:对上述实施例l-5所述产品进行生殖力回复实验，结果如下生殖力回复实验初次免疫后18—20周后抗体滴度下降明显，从40万下降到2—8万，26周后抗体滴度低于5000，按雄雌比例l:2进行雌雄小鼠合笼，将实验组抗原肽免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，对照组(PBS对照组、空白对照组和无关肽对照组)免疫雄小鼠与健康雌小鼠合笼，三周后分别观察记录各组雌小鼠的产仔率。实验结果表明免疫雄性小鼠其生殖力回复，肽免疫组的雌小鼠与对照组雌小鼠的产仔率和受孕率差异不显著，参见表l。表l、免疫雄鼠抗体滴度下降后合笼情况<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>权利要求1、一种人附睾蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，其特征在于它基本的氨基酸序列为氨基端-LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该基本的氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。2、如权利要求l所述的人附睾蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，其特征在于它基本的氨基酸序列为MFVYGGCQGNNNN\LSEIKGVIVHRLEGVK3、如权利要求l所述的人附睾蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，其特征在于它基本的氨基酸序列为LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNN1S^LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN4、如权利要求l所述的人附睾蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，其特征在于它基本的氨基酸序列为LSEIKGVIVHRLEGVMFVYGGCQGNNNN^KLSEIKGVIVHRLEGV、MFVYGGCQGNNNN二K^5、如权利要求l所述的人附睾蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，其特征在于它基本的氮基酸序列为LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN\LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNNKLSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN\KLSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNNK全文摘要一种人附睾蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，其特征在于它基本的氨基酸序列为氨基端-LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN-羧基端；并可以以赖氨酸为接头，将多个该基本的氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。本发明具有产品便于运输保存和进行自动化生产的优点，它具有显著的免疫原性和抗原性，免疫效果明显，具有高效、可逆的避孕效果，而且安全无副作用。文档编号C07K14/81GK101638438SQ20081017095公开日2010年2月3日申请日期2008年10月15日优先权日2008年5月14日发明者畏何,吴玉章,李晋涛,梁志清,萍阎,陈正琼申请人:中国人民解放军第三军医大学