专利名称：天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化方法
技术领域：
本发明属于一种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化方法。
背景技术：
蚕蛹是蚕蛾科昆虫家蚕的蚕茧缁丝后留下的蛹体。其来源广泛，被认为是人类的一种新营养源，是卫生部批准的“作为普通食品管理的食品新资源名单”中唯一的昆虫类食品。蚕蛹具有极高的营养价值，含有丰富的蛋白质、脂肪酸、维生素。其中所含的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin，缩写SP)，可作为蛋白酶抑制剂参与凝血反应、纤维溶解、血管生成、 补体激活、免疫调节及炎症反应等。还有少数执行非抑制功能作为激素转运分子、分子伴侣和肿瘤抑制因子发挥作用。它们在人体内多种生理体系中起关键性的调控作用，是维持体内环境稳定的重要因素。但目前，市场上基本还未出现以蚕蛹中有效成分作为药物开发的产品，缺乏天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化方法。
发明内容
本发明的目的是设计一种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化方法，利用蚕蛹作为原料，通过分离纯化获得具有药用价值的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，该方法操作简便，且产量高，适用于大规模生产，提纯的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂可作为保健药物，无毒副作用。为此，本发明的包括下步骤(1)蚕蛹预处理，将新鲜蚕蛹与4°C预冷的50mM磷酸缓冲液，pH7. 4，按1 1加入到榨汁机中勻浆30秒，在冰上冰浴5分钟，继续勻浆，重复三次，使蚕蛹中的蛋白充分溶解； 将勻浆转移到离心杯中，40C，每分钟15000转，离心20分钟，取上清液，上清液过九层纱布过滤除去油脂，重复离心和过滤步骤三次；收集过滤后的上清液，4°C，每分钟15000转，离心20分钟，上清液用0. 45 μ m滤膜真空抽滤，4°C保存；(2)天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的初步分离纯化，将上清液置于50°C恒温水浴30分钟，再置离心机每分钟15000转，离心20分钟，取上清；(3)天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化，将上清液置于100°C恒温水浴30分钟， 再置离心机每分钟15000转，离心20分钟，取上清，再重复该步骤数次，直至100°C恒温水浴无沉淀析出，即可得到天然丝氨酸蛋白酶抑制剂。所述的步骤(3)中的数次为3至5次。上述方法实现了本发明的目的。本发明的优点是能利用蚕蛹作为原料，通过分离纯化获得具有药用价值的蚕蛹中天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，该方法操作简便，且产量高，适用于大规模生产，提纯的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂可作为保健药物，无毒副作用。将用本发明方法制成的抑制剂使用明胶-聚丙烯酰胺凝胶活性染色法进行活性检测。抑制剂超滤浓缩后跑非变性明胶-聚丙烯酰胺凝胶，将胶条割下，分别于25 μ g/ml胰蛋白酶，pH8. 0，37 °C水浴的条件下，酶解30分钟、60分钟、2小时、3小时、12小时，再将酶解后的胶条用考马斯亮蓝染色，结果证明所得到的抑制剂酶解3小时后仍保持其生物活性。
具体实施例方式一种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化方法。包括下步骤(1)蚕蛹预处理，将新鲜蚕蛹与4°c预冷的50mM磷酸缓冲液，pH7. 4，按1 1加入到榨汁机中勻浆30秒，在冰上冰浴5分钟，继续勻浆，重复三次，使蚕蛹中的蛋白充分溶解；将勻浆转移到离心杯中，4°C，每分钟15000转，离心20分钟，取上清液，上清液过九层纱布过滤除去油脂，重复离心和过滤步骤三次；收集过滤后的上清液，40C，每分钟15000转，离心30分钟，上清液用0. 45 μ m滤膜真空抽滤，4°C保存。(2)天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的初步分离纯化，将上清液置于50°C 恒温水浴30分钟，再置离心机每分钟15000转，离心20分钟，取上清。( 天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化，将上清液置于100°C恒温水浴30分钟，再置离心机每分钟15000转， 离心20分钟，取上清，再重复该步骤3至5次，直至100°C恒温水浴无沉淀析出，即可得到天然丝氨酸蛋白酶抑制剂。将得到的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂无菌分装，-50°C冷冻干燥，制成冻干粉。检测用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测样品，在42kDa处有目的蛋白的条带。总之，本发明能利用蚕蛹作为原料，通过分离纯化获得具有药用价值的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，该方法操作简便，且产量高，适用于大规模生产，提纯的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂可作为保健药物，无毒副作用。
权利要求
1.一种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化方法，其特征在于包括下步骤，(1)蚕蛹预处理，将新鲜蚕蛹与4°C预冷的50mM磷酸缓冲液，PH7.4，按1 1加入到榨汁机中勻浆30秒，在冰上冰浴5分钟，继续勻浆，重复三次，使蚕蛹中的蛋白充分溶解；将勻浆转移到离心杯中，40C，每分钟15000转，离心20分钟，取上清液，上清液过九层纱布过滤除去油脂，重复离心和过滤步骤三次；收集过滤后的上清液，4°C，每分钟15000转，离心30 分钟，上清液用0. 45 μ m滤膜真空抽滤，4°C保存；(2)天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的初步分离纯化，将上清液置于50°C恒温水浴30分钟， 再置离心机每分钟15000转，离心20分钟，取上清；(3)天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化，将上清液置于100°C恒温水浴30分钟，再置离心机每分钟15000转，离心20分钟，取上清，再重复该步骤数次，直至100°C恒温水浴无沉淀析出，即可得到天然丝氨酸蛋白酶抑制剂。
2.按权利要求1所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化方法，其特征在于所述的步骤(3)中的数次为3至5次。
全文摘要
本发明属于一种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化方法，方法包括蚕蛹预处理，天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的初步分离纯化，天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化的步骤。本发明能利用蚕蛹作为原料，通过分离纯化获得具有药用价值的蚕蛹中天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，该方法操作简便，且产量高，适用于大规模生产，提纯的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂可作为保健药物，无毒副作用。
文档编号C07K1/14GK102372777SQ20111033903
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者叶曼, 张耀洲, 舒特俊, 陈剑清, 陈昊 申请人:特菲(天津)生物医药科技有限公司