本发明属于生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用枯草芽孢杆菌生产饲用抗菌肽的工艺及其应用。
背景技术：
乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉、玉米淀粉、玉米浆干粉、玉米浆等是常用的发酵工业用碳源。牛骨蛋白胨、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母膏、酵母浸粉、酵母粉、牛肉膏、牛肉浸粉、大豆粕粉、大豆饼粉等是常用的发酵工业用氮源。碳源、氮源、无机盐和微量元素、生长因子是组成基础发酵生产培养基的成分。通过在基础发酵生产培养基中补充碳源、氮源，进行补料分批高密度发酵工艺优化，可以显著提高生物发酵效价，降低发酵原料成本，缩短发酵生产周期，具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点。
市场上的同类抗菌肽产品，主要以生物效价作为其产品的质量评价指标，其发酵液的生物效价一般在6，000U/ml以下；喷雾干燥成品的含水量在5%以下，生物效价一般在40，000U/g。目前枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的工艺仍然存在成本过高，过程复杂，生产周期长，产物效价低等问题。
技术实现要素：
本发明为了解决现有技术中的上述问题，采用枯草芽孢杆菌BW115及优化的补料分批高密度发酵生产工艺生产的抗菌肽，其发酵液的效价达10，000U/ml以上，喷雾干燥成品的含水量5%以下、生物效价达80，000U/g以上；具有生物效价高，原料成本低、发酵周期短的优势。该抗菌肽作为饲料添加剂，添加在全价配合饲料中，能显著提高养殖动物生产性能。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所述的枯草芽孢杆菌BW115 (Bacillus subtilis BW115)，已于2016年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2016402。
本发明第一个方面提供一种生产饲用抗菌肽的工艺，包括如下步骤：
步骤1 获得生产菌株
将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到质粒中形成重组质粒，然后将得到的重组质粒转化枯草芽孢杆菌，再筛选出稳定表达抗菌肽CAD的生产菌株即枯草芽孢杆菌BW115，将其保存备用；
步骤2 液体种子发酵培养
将步骤1中得到的生产菌株活化后接种基础发酵培养基，进行液体种子发酵培养获得种子发酵液；
步骤3 发酵罐中发酵培养
将步骤2中得到的种子发酵液接种于发酵罐中，经流加补充碳源和氮源中的任意一种或者其组合，进行发酵培养获得发酵液；
步骤4 获得抗菌肽产品
将步骤3中所获得的发酵液，添加辅料，经60-600℃，进行喷雾干燥处理后，得到抗菌肽产品。
其中，枯草芽孢杆菌BW115，是利用基因重组技术，将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到质粒pPIC9K中得到重组质粒，再将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，经筛选得到稳定表达的菌株，表达家蚕抗菌肽。家蚕抗菌肽属于杀菌力最强的天蚕素-B类抗菌肽，由37个氨基酸残基组成，含25%的α-螺旋氨基酸，伸展结构的氨基酸占32%，含43%的无规则卷曲氨基酸。
优选地，上述步骤1中质粒是pPIC9K质粒。
优选地，上述步骤3中补充的碳源选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉、玉米淀粉、玉米浆干粉、玉米浆中的一种或几种。
优选地，上述步骤3中补充的氮源选自牛骨蛋白胨、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母膏、酵母浸粉、酵母粉、牛肉膏、牛肉浸粉、大豆粕粉、大豆饼粉中的一种或几种。
优选地，上述步骤3中发酵培养条件为：发酵温度是20-40℃；搅拌转速是100-500r/min；通气比是1:（0.5-2.0）；罐压是0.01-0.10Mpa。
优选地，上述步骤3中所获得的发酵液，其生物效价达到10，000U/ml以上。
优选地，以质量百分比计，上述步骤3中的补充碳源的用量为0.1-10%。
优选地，以质量百分比计，上述步骤3中的补充氮源的用量为0.1-10%。
优选地，上述步骤4中所获得的抗菌肽产品含水量小于5%，并且其生物效价达到80，000U/g以上。
本发明第二个方面提供上述工艺生产得到的抗菌肽。
本发明第三个方面提供上述工艺所制备的抗菌肽在饲料领域中的应用。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下有益效果：
1）本发明利用枯草芽孢杆菌BW115，进行补料分批高密度优化发酵生产工艺，发酵培养产生的发酵液的生物效价达到10，000U/ml以上，远高于已知技术中的发酵液生物效价。
2）与传统方法生产的抗菌肽相比，本发明生产的抗菌肽，具有更广谱的抗菌活性、pH适用范围更广、耐热性能更好，喷雾干燥成品的含水量5%以下，并且生物效价达到80，000U/g以上。
3）采用本发明中的工艺生产的抗菌肽，原料成本低，发酵周期短，作为饲料添加剂，可与抗菌素联用或替代抗菌素使用，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
本实施例中生产饲用抗菌肽工艺中发酵罐中补充的碳源、氮源和培养条件为：
（1）碳源：葡萄糖5%；
（2）氮源：酵母浸粉4%；
（3）发酵工艺条件：发酵培养温度30℃；搅拌转速300r/min；通气比1:1.5；罐压0.03-0.08Mpa。
本实施例中生产饲用抗菌肽的工艺，包括如下步骤：
步骤1：将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K质粒中形成重组质粒，然后将得到的重组质粒转化枯草芽孢杆菌，再筛选出稳定表达抗菌肽CAD的菌株得到生产菌株，即枯草芽孢杆菌BW115，将其放置于液氮罐中，保藏备用；
步骤2：将基础发酵培养基在121℃条件下，灭菌30分钟后冷却至30℃，然后将步骤1中得到的生产菌株活化后接种至基础发酵培养基，进行液体种子发酵培养获得种子发酵液；
步骤3：将步骤2中得到的种子发酵液接种于发酵罐中，发酵培养8小时，流加补充碳源、氮源，继续进行发酵培养，获得发酵液；
步骤4：将步骤3中所获得的发酵液，添加辅料，经进风温度180℃，出风温度90℃条件下，进行喷雾干燥处理，得到抗菌肽产品。
本实施例获得的抗菌肽，是在5吨发酵罐规模下发酵生产，经过检测，其发酵液效价为10，450U/ml，喷雾干燥产品效价为86，230U/g，含水量为3.2%。
实施例2
本实施例中生产饲用抗菌肽工艺中发酵罐中补充的碳源和培养条件为：
（1）碳源：葡萄糖3%、蔗糖3%；
（2）发酵工艺条件：发酵培养温度32℃；搅拌转速200r/min；通气比1:1.2；罐压0.03-0.05Mpa。
本实施例中生产饲用抗菌肽的工艺，包括如下步骤：
步骤1：将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K质粒中形成重组质粒，然后将得到的重组质粒转化枯草芽孢杆菌，再筛选出稳定表达抗菌肽CAD的菌株得到生产菌株，即枯草芽孢杆菌BW115，将其放置于液氮罐中，保藏备用；
步骤2：将基础发酵培养基在121℃条件下，灭菌30分钟后冷却至32℃，然后将步骤1中得到的生产菌株活化后接种至基础发酵培养基，进行液体种子发酵培养获得种子发酵液；
步骤3：将步骤2中得到的种子发酵液接种于发酵罐中，发酵培养4小时，流加补充碳源，继续进行发酵培养，获得发酵液；
步骤4：将步骤3中所获得的发酵液，添加辅料，经进风温度160℃，出风温度80℃条件下，进行喷雾干燥处理，得到抗菌肽产品。
本实施例获得的抗菌肽，是在10吨发酵罐规模下发酵生产，经过检测，其发酵液效价为11，330U/ml，喷雾干燥产品效价为90，120U/g，含水量为3.9%。
实施例3
本实施例中生产饲用抗菌肽工艺中发酵罐中补充的碳源和培养条件为：
（1）碳源：乳糖5%、蔗糖0.5%；
（2）发酵工艺条件：发酵培养温度37℃；搅拌转速280r/min；通气比1:1.1；罐压0.03-0.08Mpa。
本实施例中生产饲用抗菌肽的工艺，包括如下步骤：
步骤1：将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K质粒中形成重组质粒，然后将得到的重组质粒转化枯草芽孢杆菌，再筛选出稳定表达抗菌肽CAD的菌株得到生产菌株，即枯草芽孢杆菌BW115，将其放置于液氮罐中，保藏备用；
步骤2：将基础发酵培养基在121℃条件下，灭菌30分钟后冷却至37℃，然后将步骤1中得到的生产菌株活化后接种至基础发酵培养基，进行液体种子发酵培养获得种子发酵液；
步骤3：将步骤2中得到的种子发酵液接种于发酵罐中，发酵培养5小时，流加补充碳源，继续进行发酵培养，获得发酵液；
步骤4：将步骤3中所获得的发酵液，添加辅料，经进风温度165℃，出风温度70℃条件下，进行喷雾干燥处理，得到抗菌肽产品。
本实施例获得的抗菌肽，是在60吨发酵罐规模下发酵生产，经过检测，其发酵液效价为10，210U/ml，喷雾干燥产品效价为88，100U/g，含水量为2.6%。
实施例4
本实施例中生产饲用抗菌肽工艺中发酵罐中补充的碳源、氮源和培养条件为：
（1）碳源：麦芽糖9%；
（2）氮源：酵母膏4%、蛋白胨0.5%；
（3）发酵工艺条件：发酵培养温度35℃；搅拌转速310r/min；通气比1:1.3；罐压0.05-0.08Mpa。
本实施例中生产饲用抗菌肽的工艺，包括如下步骤：
步骤1：将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K质粒中形成重组质粒，然后将得到的重组质粒转化枯草芽孢杆菌，再筛选出稳定表达抗菌肽CAD的菌株得到生产菌株，即枯草芽孢杆菌BW115，将其放置于液氮罐中，保藏备用；
步骤2：将基础发酵培养基在121℃条件下，灭菌30分钟后冷却至35℃，然后将步骤1中得到的生产菌株活化后接种至基础发酵培养基，进行液体种子发酵培养获得种子发酵液；
步骤3：将步骤2中得到的种子发酵液接种于发酵罐中，发酵培养6小时，流加补充碳源、氮源，继续进行发酵培养，获得发酵液；
步骤4：将步骤3中所获得的发酵液，添加辅料，经进风温度190℃，出风温度85℃条件下，进行喷雾干燥处理，得到抗菌肽产品。
本实施例获得的抗菌肽，是在25吨发酵罐规模下发酵生产，经过检测，其发酵液效价为12，400U/ml，喷雾干燥产品效价为82，430U/g，含水量为3.6%。
实施例5
本实施例中生产饲用抗菌肽工艺中发酵罐中补充的碳源、氮源和培养条件为：
（1）碳源：乳糖3%、葡萄糖3%；
（2）氮源：酪蛋白胨3%；
（3）发酵工艺条件：发酵培养温度36℃；搅拌转速250r/min；通气比1:1.0；罐压0.02-0.04Mpa。
本实施例中生产饲用抗菌肽的工艺，包括如下步骤：
步骤1：将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K质粒中形成重组质粒，然后将得到的重组质粒转化枯草芽孢杆菌，再筛选出稳定表达抗菌肽CAD的菌株得到生产菌株，即枯草芽孢杆菌BW115，将其放置于液氮罐中，保藏备用；
步骤2：将基础发酵培养基在121℃条件下，灭菌30分钟后冷却至36℃，然后将步骤1中得到的生产菌株活化后接种至基础发酵培养基，进行液体种子发酵培养获得种子发酵液；
步骤3：将步骤2中得到的种子发酵液接种于发酵罐中，发酵培养9小时，流加补充碳源、氮源，继续进行发酵培养，获得发酵液；
步骤4：将步骤3中所获得的发酵液，添加辅料，经进风温度160℃，出风温度75℃条件下，进行喷雾干燥处理，得到抗菌肽产品。
本实施例获得的抗菌肽，是在50吨发酵罐规模下发酵生产，经过检测，其发酵液效价为11，230U/ml，喷雾干燥产品效价为87，130U/g，含水量为2.6%。
实施例6
本实施例中生产饲用抗菌肽工艺中发酵罐中补充的碳源、氮源和培养条件为：
（1）碳源：玉米浆干粉6%；
（2）氮源：大豆粕粉3%；
（3）发酵工艺条件：发酵培养温度30℃；搅拌转速250r/min；通气比1:1.2；罐压0.02-0.05Mpa。
本实施例中生产饲用抗菌肽的工艺，包括如下步骤：
步骤1：将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K质粒中形成重组质粒，然后将得到的重组质粒转化枯草芽孢杆菌，再筛选出稳定表达抗菌肽CAD的菌株得到生产菌株，即枯草芽孢杆菌BW115，将其放置于液氮罐中，保藏备用；
步骤2：将基础发酵培养基在121℃条件下，灭菌30分钟后冷却至30℃，然后将步骤1中得到的生产菌株活化后接种至基础发酵培养基，进行液体种子发酵培养获得种子发酵液；
步骤3：将步骤2中得到的种子发酵液接种于发酵罐中，发酵培养2小时，流加补充碳源、氮源，继续进行发酵培养，获得发酵液；
步骤4：将步骤3中所获得的发酵液，添加辅料，经进风温度180℃，出风温度80℃条件下，进行喷雾干燥处理，得到抗菌肽产品。
本实施例获得的抗菌肽，是在40吨发酵罐规模下发酵生产，经过检测，其发酵液效价为10，830U/ml，喷雾干燥产品效价为91，130U/g，含水量为4.6%。
通过上述的各个实施例可以看出，使用本发明重组基因工程枯草芽孢杆菌BW115及优化补料分批高密度发酵工艺生产的抗菌肽，其发酵液的效价均在10，000U/ml以上；喷雾干燥成品的含水量均在5%以下，其生物效价均达80，000U/g以上。
同时，采用上述实施例所生产的抗菌肽，作为饲料添加剂添加到全价配合饲料中，经畜禽等养殖动物饲喂试验显示，能显著提高养殖动物免疫力，降低死淘率，降低料肉比等生产性能。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。