本发明涉及一种表达载体及其在植物基因功能研究中的应用。
背景技术：
基因是存在于染色体上的一段dna序列，生物的性状都是由基因的表达与否控制的。研究基因的功能不仅可以获取基因的具体生物学信息，更可以直接进行操作和改良，为人类生活和健康提供服务。随着科学技术的进步和生物学的迅猛发展，许多模式生物的基因功能已被解析。在国际上，酵母全基因组基因缺失突变体已经构建完成；在线虫以及果蝇中，利用不同的功能基因组学方法也阐明了许多基因的功能。近年来，在植物的模式生物拟南芥和水稻中，功能基因组学也取得了瞩目的成就。但是，对于大多数不是模式生物的作物，功能基因组学研究显得相对滞后。大豆在我国国民经济中占据重要地位，为我们提供丰富的蛋白质资源和油料品种。但由于大豆基因组结构庞大，同时也是4倍体作物，含有大量非编码序列冗余重复基因，所以对其功能基因组研究显得十分滞后。
大规模研究基因功能的方法有正向遗传学和反向遗传学。正向遗传学从表型入手，构建群体定位基因，最后阐明基因功能，比如ems诱变等，但这种方法耗时，效率偏低，仅仅依靠ems诱变已不能满足快速有效分析基因功能的需求。反向遗传学从突变的基因入手，寻找表型，最后解释基因功能，如建立t-dna插入突变体库等，但这种方法在基因冗余程度高的物种中不好应用。
cdna文库是表达基因的集合，建立全长cdna文库，从全长cdna文库中大规模发掘寻找基因功能是一个可靠的选择。全长cdna是指不仅包含完整的阅读框架，还拥有5’和3’端非编码区的cdna。全长cdna文库的优点非常明显，其绝大多数克隆是全长的，这不仅能大大提高基因测序和生物信息学分析过程，还利于后期蛋白质表达和功能分析。此外，全长cdna文库是高效、大规模分离阐释基因功能信息的一条有效途径。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种表达载体及其在植物基因功能研究中的应用。
本发明提供了一种特异表达载体：包括如下元件：lb序列、rb序列、抗性筛选基因甲、抗性筛选基因乙、启动子、终止子和特异dna分子；所述特异dna分子中具有两个sfii酶切位点；所述特异表达载体中，所述特异dna分子以外的其它部分不具有sfii酶切位点；所述启动子、所述特异dna分子和所述终止子处于同一表达盒，且自上游至下游依次为：所述启动子、所述特异dna分子和所述终止子。
所述特异dna分子如序列表的序列1自5’端第2568-2605位核苷酸所示。
所述特异dna分子位于所述特异表达载体的多克隆位点中。
所述抗性筛选基因甲为bar基因。所述bar基因如序列表的序列1自5’端第759-1310位核苷酸所示。
所述抗性筛选基因乙为卡那霉素抗性基因。所述卡那霉素抗性基因如序列表的序列1自5’端第4571-5365位核苷酸所示。
所述启动子为35s启动子。所述35s启动子如序列表的序列1自5’端第1617-2456位核苷酸所示。
所述终止子为nos终止子。所述nos终止子如序列表的序列1自5’端第2640-2892位核苷酸所示。
所述lb序列如序列表的序列1自5’端第1-25位核苷酸所示。
所述rb序列如序列表的序列1自5’端第2945-2969位核苷酸所示。
所述特异表达载体为序列表的序列1所示的环形质粒。
本发明还保护一种试剂盒，包括以上任一所述特异表达载体；所述试剂盒的功能为如下(a1)-(a9)中的至少一种：
(a1)构建cdna文库；
(a2)构建大豆cdna文库；
(a3)构建植物cdna文库；
(a4)研究大豆基因功能；
(a5)研究植物基因功能；
(a6)挖掘植物新基因；
(a7)挖掘植物新基因并验证其功能；
(a8)挖掘大豆新基因；
(a9)挖掘大豆新基因并验证其功能。
所述试剂盒还包括菌株。所述菌株具体可为大肠杆菌或农杆菌。所述大肠杆菌具体可为dh10b-t1菌株。所述农杆菌具体可为农杆菌gv3101。
本发明还保护以上任一所述特异表达载体或以上任一所述试剂盒的应用，为如下(b1)-(b9)中的至少一种：
(b1)构建cdna文库；
(b2)构建大豆cdna文库；
(b3)构建植物cdna文库；
(b4)研究大豆基因功能；
(b5)研究植物基因功能；
(b6)挖掘植物新基因；
(b7)挖掘植物新基因并验证其功能；
(b8)挖掘大豆新基因；
(b9)挖掘大豆新基因并验证其功能。
本发明还保护一种植物cdna文库的构建方法(方法甲)，包括如下步骤：(1)提取植物总rna；(2)以所述总rna为模板，采用引物5sm4z、引物5sm4za和引物5sm4zb进行反转录，得到第一链cdna；(3)将第一链cdna均一化，得到均一化cdna；(4)采用限制性内切酶sfii酶切均一化cdna，得到酶切产物；(4)将权利要求1-5任一所述的表达载体采用限制性内切酶sfii酶切，得到载体骨架；(5)将所述酶切消化产物和所述载体骨架连接，得到植物cdna文库。
所述引物5sm4z如序列表的序列2所示。
所述引物5sm4za如序列表的序列3所示。
所述引物5sm4zb如序列表的序列4所示。
所述步骤(1)中，所述总rna为混合总rna。所述混合总rna具体通过将植物根、茎、叶和茎尖组织的总rna混合得到。
所述步骤(2)中，所述引物5sm4z、引物5sm4za和引物5sm4zb具体可按照摩尔比1∶1∶1加入。
所述步骤(3)中，所述“将第一链cdna均一化”具体可采用差减杂交法进行。所述均一化cdna的制备方法具体可包括如下步骤：
(a)以所述总rna为模板，采用引物tester
(cagtggtatcaacgcagagtttttttttttttttttt)进行pcr，得到testercdna；将tests5序列(单链，cagtggtatcaacgcagag)连接到testercdna的3′端，然后采用5′磷酸化引物tests3(5pgtaatacgactcactatagggc)进行pcr扩增(pcr扩增的反应程序为：95℃1.5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，15个循环；72℃10min)，得到全长冗余富集的testercdna；将全长冗余富集的testercdna采用lambdaexonuclease消化；
(b)以所述总rna为模板，采用引物driver
(gggtaactataacggtcctaaggtagctttttttttttttttttt)进行pcr，得到drivercdna；将driver5序列(单链，gaacacgcgtcgtttacctcc)连接到drivercdna的3′端，然后采用5′磷酸化引物driver3
(5pgggtaactataacggtcctaaggtagc)进行pcr扩增(pcr扩增的反应程序为：95℃1.5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，15个循环；72℃10min)，得到全长冗余富集的drivercdna；将全长冗余富集的drivercdna采用lambdaexonuclease消化；
(c)将步骤(a)的产物和步骤(b)的产物以摩尔比20∶1混合后，采用50mmtris-hcl(ph8.0)，0.5mnacl，0.2mmedta缓冲液作为体系，与步骤(2)得到的第一链edna进行核酸杂交，68℃杂交6小时，去除双链的冗余分子(具体方法可参照文献：“patanjalisr，parimoos，weissmansm.constructionofauniform-abundance(normalized)cdnalibrary.[j].proceedingsofthenationalacademyofsciences，1991，88(5)：1943-7.”和“soaresmb，jelenep，sul，etal.constructionandcharacterizationofanormalizedcdnalibrary[j].proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，1994，91(20)：9228-32.”)
(d)将步骤(c)得到的产物采用引物(cagtggtatcaacgcagag)进行pcr扩增(pcr扩增的反应程度为：95℃2min；95℃12s，68℃8min，20个循环；68℃30min)，得到均一化cdna。
本发明还保护所述方法甲的应用，为如下(c1)-(c3)中的至少一种：
(c1)研究植物基因功能；
(c2)挖掘植物新基因；
(c3)挖掘植物新基因并验证其功能。
本发明还保护一种植物基因功能的研究方法，包括如下步骤：按照方法甲所述的方法构建植物cdna文库，将所述cdna文库转化农杆菌，得到重组农杆菌；将所述重组农杆菌转化目的植物，通过同时对插入载体骨架的dna片段进行序列分析和观察转化植物的表型，对植物基因功能进行研究。
所述农杆菌具体可为农杆菌gv3101。
所述目的植物具体可为拟南芥。更具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。
以上任一所述植物具体可为拟南芥。更具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。
以上任一所述植物具体可为大豆。更具体可为大豆品种williams82。
选择合适的载体连接cdna文库是利用cdna文库研究基因功能的一个重要环节。本发明人工构建了一种特异表达载体，作为连接cdna文库的载体，该载体承载量大，适合大片段cdna的插入，同时含有35s启动子以及用于转基因植物筛选的bar基因(提供basta抗性筛选)，可以用于构建植物过表达载体，35s启动子是目前使用频率最高的过表达启动子，过表达基因能够使基因功能凸显出来，对于快速鉴定基因最终作用功能十分有效。本发明将构建的表达载体与获得的全长cdna文库连接，得到过表达的大豆全长cdna文库，然后转化拟南芥，获得众多表型，证明了这一方法对于研究大豆功能基因组的有效性。
附图说明
图1为总rna电泳图。
图2为第一链cdna电泳图。
图3为均一化的cdna电泳图。
图4为菌落pcr检测电泳结果图。
图5为大豆各染色体上对应的测序基因数目。
图6为阳性苗筛选结果。
图7为不同表型的阳性苗。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
大豆品种williams82：中国国家作物种质资源库(http：//www.cgris.net/)。
dh10b-t1菌株：invitrogen，货号：c5100-03。
农杆菌gv3101：北京全是金公司，货号：waryonggt707。
哥伦比亚生态型拟南芥(arabidopsisthalianaecotypecolumbia，col-0)：abrc(arabidopsisbiologicalresourcecenter)。
basta：invitrogen，货号：w9062-100ml。
实施例1、表达载体的构建
人工合成序列表的序列1所示的环形质粒，将其命名为特异表达载体。特异表达载体可用于构建cdna文库、研究植物基因功能、发掘植物新基因以及进行植物新基因的功能验证。
特异表达载体包括如下元件：农杆菌识别序列lb(序列1自5’端第1-25位)和rb(序列1自5’端第2945-2969位)、bar基因(序列1自5’端第759-1310位)、卡那霉素抗性基因(序列1自5’端第4571-5365位)、35s启动子(序列1自5’端第1617-2456位)、特异dna分子(序列1自5’端第2568-2605位)、nos终止子(序列1自5’端第2640-2892位)。特异dna分子中具有两个sfii酶切位点。特异表达载体中，特异dna分子以外的其它部分不具有sfii酶切位点。
特异表达载体承载量大(可插入大于10kb的外源dna)，适合大片段cdna的插入。同时特异表达载体含有35s启动子、农杆菌识别序列lb和rb以及用于转基因植物筛选的bar基因(提供basta抗性筛选)，可以用于构建含有cdna的植物过表达载体并转化目的植物得到转基因植物。35s启动子是目前使用频率最高的过表达启动子，过表达基因能够使基因功能凸显出来，对于快速鉴定基因最终作用功能十分有效。
特异表达载体的应用原理如下：
提取大豆的总rna，将总rna用加接头序列(sfii酶切位点)的引物反转录得到cdna，并对cdna均一化，然后采用限制性内切酶sfii进行酶切，得到酶切产物(每个edna中均具有限制性内切酶sfii识别序列，因此得到核苷酸序列不同的多种酶切产物)；
取特异表达载体，采用限制性内切酶sfii酶进行酶切，收集载体骨架；
将所述酶切产物和所述载体骨架连接(由于前面步骤中得到了多种酶切产物，因此连接后得到具有不同插入序列的多个重组质粒，这些重组质粒组成cdna文库)，然后转化宿主菌，通过卡那霉素抗性筛选获得重组菌(cdna文库由多个重组质粒组成，因此得到了多个重组菌)；
分别取各个重组菌，提取质粒，一方面通过测序获得插入载体骨架的dna片段的序列，另一方面对出发植物进行遗传转化并通过basta抗性筛选获得转基因植物，通过比较出发植物与转基因植物的性状差异发掘来源于大豆cdna的基因功能。
实施例2、大豆cdna文库的构建
1、分别提取大豆品种williams82幼苗3片复叶时期的根、茎、叶和茎尖组织的总rna，将各组织提取的总rna混合，得到混合总rna(电泳结果如图1所示)。
2、以步骤1得到的混合总rna为模板，采用引物5sm4z、引物5sm4za和引物5sm4zb(摩尔比1∶1∶1)进行反转录，合成第一链cdna(电泳结果如图2所示)。
5sm4z：5’-gccattacggccaagttacggggg-3’；
5sm4za：5’-gccattacggccaagttacgggg-3’；
5sm4zb：5’-gccattacggccaagttacggg-3’。
引物5sm4z、引物5sm4za和引物5sm4zb中，下划线为sfii酶切位点。
3、将步骤2合成的第一链cdna用差减杂交法去除丰度高的序列，获得均一化的cdna。具体方法如下：
(a)以步骤1得到的混合总rna为模板，采用引物tester
(cagtggtatcaacgcagagtttttttttttttttttt)进行pcr，得到testercdna；将tests5序列(单链，cagtggtatcaacgcagag)连接到testercdna的3′端，然后采用5′磷酸化引物tests3(5pgtaatacgactcactatagggc)进行pcr扩增(pcr扩增的反应程序为：95℃1.5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，15个循环；72℃10min)，得到全长冗余富集的testercdna；将全长冗余富集的testercdna采用lambdaexonuclease消化；
(b)以步骤1得到的混合总rna为模板，采用引物driver
(gggtaactataacggtcctaaggtagctttttttttttttttttt)进行pcr，得到drivercdna；将driver5序列(单链，gaacacgcgtcgtttacctcc)连接到drivercdna的3′端，然后采用5′磷酸化引物driver3
(5pgggtaactataacggtcctaaggtagc)进行pcr扩增(pcr扩增的反应程序为：95℃1.5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，15个循环；72℃10min)，得到全长冗余富集的drivercdna；将全长冗余富集的drivercdna采用lambdaexonuclease消化；
(c)将步骤(a)的产物和步骤(b)的产物以摩尔比20∶1混合后，采用50mmtris-hcl(ph8.0)，0.5mnacl，0.2mmedta缓冲液作为体系，与步骤(2)得到的第一链cdna进行核酸杂交，68℃杂交6小时，去除双链的冗余分子(具体方法可参照文献：“patanjalisr，parimoos，weissmansm.constructionofauniform-abundance(normalized)cdnalibrary.[j].proceedingsofthenationalacademyofsciences，1991，88(5)：1943-7.”和“soaresmb，jelenep，sul，etal.constructionandcharacterizationofanormalizedcdnalibrary[j].proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，1994，91(20)：9228-32.”)
(d)将步骤(c)得到的产物采用引物(cagtggtatcaacgcagag)进行pcr扩增(pcr扩增的反应程度为：95℃2min；95℃12s，68℃8min，20个循环；68℃30min)，得到均一化cdna(电泳结果如图3所示)。
4、采用限制性内切酶sfii酶切步骤3得到的均一化的cdna，回收大于1kb的酶切消化产物。
5、采用限制性内切酶sfii酶切实施例1构建的步骤一构建的表达载体，回收约6000bp的载体骨架。
6、将步骤4得到的酶切消化产物和步骤5得到的载体骨架连接，得到连接产物(cdna质粒文库)。
7、将步骤6得到的cdna质粒文库转化dh10b-t1菌株，接种于含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基上培养，共获得1.0×106个克隆菌落。随机选取若干菌落测序，结果显示质粒中插入片段中存在大于10kb的片段。从若干菌落中再随机挑取14个菌落，采用引物f和引物r进行菌落pcr检测重复率克隆大小。电泳结果如图4所示，结果显示14个克隆中没有重复克隆出现，并且大小在大约1.0-3.0kb范围内(已测序验证)，质量达到要求。
f：5’-gacgcacaatcccactatc-3’：
r：5’-gccaatatatcctgtcaaacactg-3’。
8、将步骤6得到的cdna质粒文库用电转化法导入农杆菌gv3101，得到重组农杆菌。将重组农杆菌接种于含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基上培养，挑选96个菌斑，采用引物f和引物r进行菌落pcr，产物测序测3kb，将测序结果进行序列比对，结果表明重复序列只占3％，说明重复序列少。同时测出的基因序列在大豆20条染色体上都有分布，最少6个基因序列，最多16个，说明库容量大(图5)。
9、将步骤8得到的重组农杆菌转化哥伦比亚生态型拟南芥(方法参照文献：cloughsj，bentaf.floraldip：asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana[j].plantjournalforcell&molecularbiology，1998，16(6)：735.)，收获t0代种子。将t0代种子播种到温室，待子叶完全伸展开后将basta(1∶1000稀释)喷洒至叶片表面，每隔3天喷洒一次，持续2周。阳性苗可正常生长，阴性苗没有抗性，最后全部死亡。
筛选结果如图6所示。箭头指向的为阳性苗。
观察阳性苗表型，结果如图7所示。
图7中，阳性苗显示不同表型，具体如下所示：
a：锯齿状叶片(箭头)；
b：失去中心茎尖分生组织活性(上箭头)、叶子向上卷曲(下箭头)；
c：棒状叶子(箭头)；
d：生长缓慢(箭头)；
e：不平整皱褶叶面(箭头)；
f：不开花(箭头)；
g：分支增多(箭头)；
h：茎干变矮且无茎生叶(白色箭头)，黑色箭头为正常表型；
i、j：茎干无表皮毛(白色箭头)，黑色箭头为正常表型有表皮毛。
上述结果表明，通过使用本发明的特异表达载体构建大豆全长cdna文库，然后转化拟南芥，获得众多表型，证明了利用这一方法进行筛选和分析基因，可以进行大豆功能基因组的研究，并且这一方法还可以延伸到油菜，花生，芝麻等其它基因组学研究滞后的作物。
<110>中国农业科学院油料作物研究所
<120>一种表达载体及其在植物基因功能研究中的应用
<160>4
<210>1
<211>6285
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
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