本发明涉及化学
技术领域：
，具体来说涉及一种含4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物、该化合物的制备方法以及对烟草花叶病毒病具有抑制作用的用途。
背景技术：
：植物病毒病又被称为“植物癌症”，几乎每一种农作物都会受到植物病毒病的侵染和危害，给农作物生产造成巨大的损失。据报道，全世界范围内每年仅烟草病毒造成的经济损失高达200亿美元。由于植物病毒专性活体寄生的特点，即植物病毒增殖需要的一切条件都全部依赖于所寄生的活体植物寄主，使得植物病毒的防治成为农业生产中的重大难题。在国外的一些报道也为防治植物病毒提供了一些新的途径，诸如控制植物病毒传播媒介、利用卫星RNA和抗病毒基因导入植物等方法。但是，这些措施对在实际生产中有效实施仍有一定难度，使用化学药剂防治植物病毒病不失为一种经济有效的措施。现有的商品化药剂病毒必克、病毒A、宁南霉素、病毒星有一定防效(大多在30-60％)，但药剂防治效果仍不理想，因此，筛选低毒高效、环境友好的化学合成抗病毒剂显得尤为重要。在农药的研究开发中，杂环化合物由于表现出较好的生物活性、结构多样性以及对温血动物、鱼类和蜜蜂毒性低等优点，成为当今前农药领域开发的热点，在农药的研究开发中占有非常重要的地位，深受农药开发者的青睐。在作为农用活性化合物申请的专利中，含杂环的活性化合物占到了百分之九十以上。在近年来开发的杂环新农药中，大多为超高效、广谱、低毒、易降解的品种，这些农药的使用不仅降低了对环境的影响，还降低了使用的成本。嘧啶属于六元杂环类化合物，广泛存在于生物体中。如生命所必须的核酸中的五种含氮碱基，有三种就含有嘧啶结构(尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶)。因此其表现出独特的作用方式和良好的生物活性，成为一大研究热点。近年来，发现含有嘧啶杂环的化合物具有较好的抗烟草花叶病毒活性。在抗植物病毒药物研发方面：2006年，Yuan等(Yuan,D.K.；Li,Z.M.；Zhao,W.G.；Fan,Z.J.；Wang,S.H.；SynthesisandBiologicalActivityofaSeriesofPoly-substitutedPurines[J].ChemicalJournalofChineseUniversities,2006,27(2):258-262)以4氯-5-硝基嘧啶为起始物，经胺解、还原和环合等反应，合成了系列新型含硫酮或巯基结构的嘧啶衍生物。生物活性测试结果表明，其中化合物部分具有一定的抗烟草花叶病毒活性。2007年，Gao等(Gao,X.W.；Cai,X.J.；Yan,K.；Song,B.A.；Gao,L.L.；Chen,Z.Synthesisandantiviralbioactivitiesof2-phenyl-3(substitutedbenzalamino)-4(3H)-quinazolinonederivatives[J].Molecules,2007,12:2621-2642.)设计合成了系列新型含3-芳亚甲氨基-苯并嘧啶酮类新化合物。采用半叶枯斑法对该系列化合物进行了抗烟草花叶病毒生物活性测试，结果表明，这些化合物在药剂的质量浓度为500mg/L时对TMV活体均有较高的治疗作用。2008年，高兴文等(高兴文,蔡学建,严凯.4(3H)-喹唑啉酮类Schiff碱的合成与抗烟草花叶病毒活性[J].有机化学,2008,28(10):1785-1791.)以邻氨基苯甲酸为原料经醋酐酰化闭环得2-甲基苯并噁嗪-4-酮，水合肼回流肼解合成系列2-甲基-3-氨基苯并嘧啶酮，再在无水乙醇中与芳醛反应得到一系列苯并嘧啶酮类Schiff碱类化合物。采用半叶枯斑法在500mg/L药剂浓度下对目标化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定，测定结果表明，该类化合物均有一定的抗烟草花叶病毒活性。2010年，Kumar等(Kumar,K.S.；Ganguly,S.；Veerasamy,R.Synthesis,antiviralactivityandcytotoxicityevaluationofschiffbasesofsome2-phenylquinazoline-4(3)H-ones[J].Eur.J.Med.Chem.,2010,45:5474-5479.)合成了系列新型2-苯基取代的苯并嘧啶酮类衍生物。以牛痘病毒、单纯疱疹病毒、烟草花叶病毒等病毒为供试病毒进行抗病毒活性测试，结果表明，该类化合物均有一定的抗病毒活性。2012年，Xiong等(Xiong,T.Z.；Lin,X.F.；Liu,J.F.；Bi,L.；Bao,X.P..SynthesisandBioactivitiesofNovel1,2,4-triazolo[1,5-a]PyrimidineDerivativesContaining1,2,4-triazole-5-thioneSchiffBaseUnit[J].ChineseJournalofOrganicChemistry,2012,32(07):1255-1260.)利用活性单元拼接原理将三唑硫酮席夫碱单元通过亚甲基醚桥引入到1,2,4-三唑并[1,5-α]嘧啶环的7位，合成了系列含三唑硫酮席夫碱单元的嘧啶类衍生物。初步生物活性测试结果表明，部分化合物表现出较好抗烟草花叶病毒(TMV)活性。综上所述，嘧啶类衍生物表现出了一定的防治烟草花叶病毒活性。为创制新型高效的烟草花叶病毒病抑制剂，本发明在前期工作的基础上，设计合成了系列含4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物，期望筛选出高活性的抗烟草花叶病毒的药物。技术实现要素：本发明目的在于提供一种具有抗烟草花叶病毒活性的含4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物及其制备方法。本法明的另一目的在于防治烟草花叶病毒病(TMV)的用途。本发明的一种含4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物，其通式为下式(I)：其中：R1为苯基、单取代苯基、对位单取代甲氧基苯基、对位单取代甲基苯基、环己基或呋喃甲基；R2甲基或乙基。本发明含5-氯-4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物，已合成化合物为：化合物I1：二甲基-2-(((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)(苯甲基)丙二酸；化合物I2：二乙基-2-(((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)(4-氯苯基)丙二酸；化合物I3：二甲基-2-(((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)(4-甲基苯基)丙二酸；化合物I4：二乙基-2-(((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)(4-甲氧基苯基)丙二酸；化合物I5：二甲基-2-(((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)(呋喃-2-基)丙二酸；化合物I6：二甲基-2-(环己基)((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)甲基)丙二酸；化合物I7：二乙基-2-(环己基)((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)甲基)丙二酸；化合物I8：二乙基-2-(((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)(苯甲基)丙二酸。本发明含4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物的制备方法，是以4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-胺、取代醛、丙二酸酯为原料，以离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIM]Br)为溶剂，一锅法合成含5-氯-4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物，其合成路线为：其中部分化合物(I1-I2)的结构特征如下：I1：R1＝PhR2＝Me；I2：R1＝4-Cl-PhR2＝Et；I3：R1＝4-Me-PhR2＝Me；I4：R1＝4-OMe-PhR2＝Et；I5：R1＝2-furylR2＝Me；I6：R1＝cyclohexylR2＝Me；I7：R1＝cyclohexylR2＝Et；I8：R1＝PhR2＝Et。本
发明内容所述的一种含4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物的制备方法，经下列步骤合成：将4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-胺、取代醛、丙二酸酯投入单口瓶，加入5g离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIM]Br)为溶剂，升温至100℃，反应60分钟结束，向体系中加入30mL蒸馏水以及50mL乙酸乙酯，转入分液漏斗中，分液收集有机相，浓缩，经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝7:1V/V)得到目标产物I1-I8，本发明含4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物的用途是指对烟草花叶病毒病具有抑制作用的抗植物病毒病的药物或药剂。本发明的有益效果：本发明合成了具有抗烟草花叶病毒病活性的含4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物。目前无此类化合物用于防治烟草花叶病毒病活性方面的报道，本发明的优点在于，合成工艺简单，反应条件温和，反应收率高。并且本发明中的化合物I5在防治烟草花叶病毒活性方面，无论是治疗、保护还是钝化活性，均优于商品化对照药剂宁南霉素。另外，本发明，还对生物活性最优的化合物I5的制备方法进行了深入的研究，并最终确定本发明中活性最优化合物I5的连续生产制备方法。附图说明图1为利用MCT微反应器连续制备I5示意图。具体实施方式实施例1：二甲基-2-(((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)(苯甲基)丙二酸的合成；在100mL单口瓶中，加入4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-胺(0.001mol)、苯甲醛(0.001mol)、丙二酸二甲酯(0.0015mol)，加入5g离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIM]Br)为溶剂，升温至100℃，反应60分钟结束，向体系中加入30mL蒸馏水以及50mL乙酸乙酯，转入分液漏斗中，分液收集有机相，浓缩，经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝7:1V/V)得到目标产物。实施例2：二乙基-2-(((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)(4-氯苯基)丙二酸的合成；在100mL单口瓶中，加入4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-胺(0.001mol)、4-氯苯甲醛(0.001mol)、丙二酸二乙酯(0.0015mol)，加入5g离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIM]Br)为溶剂，升温至100℃，反应60分钟结束，向体系中加入30mL蒸馏水以及50mL乙酸乙酯，转入分液漏斗中，分液收集有机相，浓缩，经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝7:1V/V)得到目标产物。实施例3：二甲基-2-(((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)(4-甲基苯基)丙二酸合成；在100mL单口瓶中，加入4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-胺(0.001mol)、4-甲基苯甲醛(0.001mol)、丙二酸二甲酯(0.0015mol)，加入5g离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIM]Br)为溶剂，升温至100℃，反应60分钟结束，向体系中加入30mL蒸馏水以及50mL乙酸乙酯，转入分液漏斗中，分液收集有机相，浓缩，经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝7:1V/V)得到目标产物。实施例4：二乙基-2-(((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)(4-甲氧基苯基)丙二酸合成；在100mL单口瓶中，加入4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-胺(0.001mol)、4-甲氧基苯甲醛(0.001mol)、丙二酸二乙酯(0.0015mol)，加入5g离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIM]Br)为溶剂，升温至100℃，反应60分钟结束，向体系中加入30mL蒸馏水以及50mL乙酸乙酯，转入分液漏斗中，分液收集有机相，浓缩，经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝7:1V/V)得到目标产物。实施例5：二甲基-2-(((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)(呋喃-2-基)丙二酸的合成；在100mL单口瓶中，加入4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-胺(0.001mol)、2-呋喃甲醛(0.001mol)、丙二酸二甲酯(0.0015mol)，加入5g离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIM]Br)为溶剂，升温至100℃，反应60分钟结束，向体系中加入30mL蒸馏水以及50mL乙酸乙酯，转入分液漏斗中，分液收集有机相，浓缩，经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝7:1V/V)得到目标产物。实施例6：二甲基-2-(环己基)((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)甲基)丙二酸的合成；在100mL单口瓶中，加入4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-胺(0.001mol)、环己基甲醛(0.001mol)、丙二酸二甲酯(0.0015mol)，加入5g离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIM]Br)为溶剂，升温至100℃，反应60分钟结束，向体系中加入30mL蒸馏水以及50mL乙酸乙酯，转入分液漏斗中，分液收集有机相，浓缩，经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝7:1V/V)得到目标产物。实施例7：二乙基-2-(环己基)((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)甲基)丙二酸的合成；在100mL单口瓶中，加入4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-胺(0.001mol)、环己基甲醛(0.001mol)、丙二酸二乙酯(0.0015mol)，加入5g离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIM]Br)为溶剂，升温至100℃，反应60分钟结束，向体系中加入30mL蒸馏水以及50mL乙酸乙酯，转入分液漏斗中，分液收集有机相，浓缩，经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝7:1V/V)得到目标产物。实施例8：二乙基-2-(((4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)(苯甲基)丙二酸合成；在100mL单口瓶中，加入4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-胺(0.001mol)、苯甲醛(0.001mol)、丙二酸二乙酯(0.0015mol)，加入5g离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIM]Br)为溶剂，升温至100℃，反应60分钟结束，向体系中加入30mL蒸馏水以及50mL乙酸乙酯，转入分液漏斗中，分液收集有机相，浓缩，经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝7:1V/V)得到目标产物。对上述实施例1-8合成的含4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物的收率、物理形态与元素分析如表1所示，核磁共振氢谱(1HNMR)数据如表2所示、核磁共振碳谱(13CNMR)数据如表3所示，红外光谱(IR)数据如表4所示：表1目标化合物的理化性质与元素分析表2目标化合物的1HNMR数据表3目标化合物的13CNMR数据表4目标化合物的红外数据化合物IR(KBr)(cm-1)I13105,2995,1713,1586,1552,1495,1478,1249,1090,1053,861I23112,2987,1737,1584,1553,1492,1475,1295,1235,,1082,1055,788I33117,2999,1724,1556,1542,1491,1476,1243,1172,1051,863I43072,2979,1727,1585,1558,1497,1472,1238,1174,1059,867I53100,2931,1723,1710,1585,1558,1497,1472,1245,1091,781I63077,2985,2660,1558,1445,1268,1241,1162,1040,1019,900I73083,2981,2667,1555,1437,1274,1238,1165,1041,1008,894I83101,2977,1731,1710,1567,1490,1466,1291,1245,1177,1053,864实施例9、目标化合物抗烟草花叶病毒治疗、钝化和保护活性(1)测试方法A.病毒提纯采用Gooding方法(GoodingGVjr,HebertTT.Asimpletechniqueforpurificationoftobaccomosaicvirusinlargequantities[J].Phytopathology,1967,57,1285)，选取接种3周以上，TMV系统侵染寄主Nicotianatabacum.L植株上部叶片，在磷酸缓冲液中匀浆，双层纱布过滤，8000g离心，经过2次聚乙二醇处理，再离心，沉淀用磷酸缓冲液悬浮，即得到TMV精提液体。整个实验在4℃下进行，用紫外分光光度计测定260nm波长的吸光度，根据公式计算病毒浓度。病毒浓度(mg/mL)＝(A260×稀释倍数)/E0.1％1cm260nm。其中E表示消光系数，即波长260nm时，浓度为0.1％(1mg/mL)的悬浮液，在光程为l厘米时的光吸收(光密度)值。TMV的E0.1％1cm260nm是3.1。B、药剂对TMV侵染的活性治疗作用：选长势一直的5-6叶期心叶烟打顶，向全叶撒匀金刚砂，用排笔蘸取病毒汁(6×10-3mg/mL)全叶接种病毒，自然晾干后用清水冲洗。用毛笔在左半叶轻轻涂施药剂，右半叶涂施对应溶剂的浓度作为对照，2-3天后记录枯斑数，按下列公式计算抑制率。C、药剂对TMV侵染的活体保护作用药剂对TMV侵染的活体保护租用：选长势一直的5-6叶期心叶烟打顶，用毛笔在左半叶轻轻涂施药剂，右半叶涂施对应浓度的溶剂作对照，24小后向全叶撒匀金刚砂，用排笔蘸取病毒汁(6×10-3mg/mL)全叶接种病毒，用清水冲洗，2-3天后记录枯斑数，按下列公式计算抑制率。D、药剂对TMV侵染的活体钝化作用药剂对TMV侵染的活体钝化作用:选长势一直的5-6叶期心叶烟打顶，向全叶撒匀金刚砂，用磷酸缓冲液将TMV；病毒稀释至6×10-3mg/mL，将化合物与等体积的病毒汁液混合钝化30分钟，用排笔人工摩擦接种于撒有金刚砂的适龄心叶烟左半业，对应剂量的溶剂与病毒汁液混合接种于撒有金刚砂的适龄心叶烟右半叶，2-3天后记录枯斑数，按下列公式计算抑制率。X％＝(CK－T)/CK×100X:相对抑制率(％),CK:未涂施药剂半叶的平均枯斑数T:涂施药剂半叶的平均枯斑数其中，CK与T都采用各组三次重复的平均数。(2)生物测试结果表5目标化合物对烟草花叶病毒的治疗、保护、钝化活性化合物浓度(μg/mL)治疗效果(％)保护效果(％)钝化效果(％)I150046.3±2.645.2±4.166.9±3.9I250055.7±2.368.0±4.091.2±3.7I350042.5±2.839.1±1.974.5±7.9I450041.3±4.942.9±2.950.5±3.5I550054.1±1.768.5±2.293.4±4.4I650039.2±2.550.4±3.548.9±4.4I750054.6±2.266.3±3.283.9±2.1I850048.1±2.359.0±3.459.8±3.3宁南霉素50053.1±1.363.0±2.190.8±2.0采用半叶枯斑法，浓度为500mg/L，以宁南霉素为对照药剂测试了目标化合物的抗TMV活性，从表5生物活性测定结果可以看出含4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物对TMV均具有中等到优秀的抑制活性，其中I2、I5和I7在500μg/mL浓度下，对TMV的保护活性分别为68.0％、68.5％和66.3％，均优于对照药剂宁南霉素63.0％。其中化合物I2和I5在治疗、保护、钝化方面，均优于对照药剂宁南霉素。为了进一步研究含4-甲氧基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物抗TMV活性，我们测定了该类化合物中I2、I5和I7的保护活性的EC50值，结果见表6.表6部分目标化合物对TMV的保护活性的EC50值化合物EC50(μg/mL)I2196.1±2.0I5178.5±1.6I7214.1±2.3宁南霉素225.1±1.9从表6结果可以看出，I2、I5和I7对TMV保护活性的EC50分别为196.1、178.5、214.1μg/mL，均优于对照药剂宁南霉素225.1μg/mL。实施例10、利用MCT微反应器连续制备I5取500mL的0.1mol/L的4-甲氧基-6-甲基嘧啶-2-胺的甲苯溶液置于A瓶中(标为A瓶)，取500mL的浓度均为0.1mol/L的糠醛和丙二酸二甲酯的混合甲苯溶液置于B瓶中。(标为B瓶)；将A瓶和B瓶分别用MPK2005中压恒流泵以10mL/min的流速推动，进入MCT微反应器(MCT微反应器设置反应温度80℃)，50分钟后停止反应，减压回收产物收集瓶中的甲苯，产物经柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝7:1V/V)得32g目标产物I5，产率：91.7％。利用MCT微反应器可连续生产克级目标产物I5。本发明实施例辅以说明本发明的技术方案。本发明效果是合成路线简单、产率较高，得到新型、高效的防治烟草花叶病毒病的新药剂。当前第1页1 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