引物组、试剂盒以及同时检测单态性单核苷酸重复位点微卫星不稳定的方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体地，本发明涉及引物组、试剂盒以及同时检测nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26和mono-27单态性单核苷酸重复位点微卫星不稳定的方法。
背景技术：
：微卫星(microsatellite)dna是广泛分布于原核和真核生物基因组中短的串联重复序列，约占人类基因的10％，核心序列为1～6bp。这类基因多位于基因非编码区及染色体的近端粒区，在人群中表现为高度多态性主要是由于重复序列长度的数目不同，正常个体体细胞在生长发育过程中其长度(或重复序列的重复次数)保持不变。经统计学计算，微卫星的自发突变率为104～105。微卫星dna具有较高的遗传稳定性，呈孟德尔共显性遗传。体细胞的msi首先在研究结肠癌组织的研究中发现：在大部分患者特别是遗传性非息肉性结肠癌(hnpcc)患者的肿瘤细胞中广泛存在dna重复序列长度的改变(即msi)，其重复序列长度越长，突变频率越高。产生msi的原因主要是dna复制过程中滑动或修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失，由于重复拷贝数发生大的变化而使某些重要功能的基因发生功能改变，其中涉及到的重要基因是错配修复基因(如hmhl1，hmsh2，hmsh6等)。这类基因表达产物的功能是纠正因环境因素所致的dna复制过程出现的错误，确保复制过程的“保真性”。当发生msi时修复能力即大大减弱，甚至失去活性。如果msi发生于控制生长和增殖的基因(如bax和tgfb)，将导致肿瘤的发生。细胞dna错配修复系统基因突变，使得在dna复制过程中出现的错误无法得到纠正，导致基因突变率升高，微卫星序列和其他序列突变的累积致使msi的发生，同时也一步步迈向恶性变的过程，最终形成msi型结肠癌。错配修复系统功能丧失是msi型结肠癌形成过程中的早期分子生物学事件。msi分为三类：①高频微卫星不稳定(high-frequencymicrosatelliteinstability，msi-h)：2个或2个以上微卫星位点不稳定(或检测的大板标记中>30％的位点不稳定)。②低频微卫星不稳定(low-frequencymicrosatelliteinstability，msi-l)：只有1个微卫星位点不稳定(10％～30％标记位点不稳定)。③微卫星稳定(microsatellitestability，mss)：无不稳定微卫星位点(<10％标记点不稳定)。1998年，美国国立癌症研究院协作组推荐2个单核苷酸位点(bat-25、bat-26)和3个双核苷酸位点(d2s123、d5s346、d17s250)作为msi检测的标记点，但由于双核苷酸位点具有多态性，在群体中重复单位的数目表现杂合性，为了提高msi检测的准确性，故推荐病理学家从肿瘤组织周围的正常组织或者抽血提取dna与肿瘤组织配对进行msi检测。2004年，新的专家共识意见中推荐5个准单态性的单核苷酸位点(bat-25、bat-26、nr-21、nr-24、nr-27)作为msi检测的标记点。其原因是研究发现单核苷酸标记位点在大部分个体的等位基因中重复单位的数目是相同且恒定，故单核苷酸标记位点可被看作准单态性。因此，采用单核苷酸标记位点进行msi检测，无需对肿瘤组织配对正常组织的dna进行msi检测，不但可以提高msi检测的敏感性，而且降低成本和时间损耗。自此，寻找新的准单态性的单核苷酸位点成为研究的热点。2005年有学者不但发现了新的准单态性的单核苷酸位点cat25，而且研究表明仅采用3个单核苷酸位点(bat-25、bat-26、cat-25)检测的敏感性和特异性可以与之前美国国立癌症研究院协作组推荐的2个单核苷酸位点和3个双核苷酸位点的方法等同。2012年又有学者发现了新的单核苷酸位点mt1xt20，初步的研究表明其具有不错的敏感性和特异性。msi在临床病理学具有重大意义，随着对msi与肿瘤关系研究的深入，表明很多肿瘤的发生与msi相关，msi是继癌基因、抑癌基因发现之后的又一肿瘤发生的新途径，在肿瘤预防、诊断和治疗上有重大意义，msi在肺癌、食管癌、膀胱癌早期诊断方面具有很高的特异性。研究基因组msi的发生也有助于发现新的抑癌基因(易感基因或疾病基因)。pcr是判定msi型肿瘤的“金指标”，利用免疫组织化学检测msi-h，虽可能由于错配修复基因突变、蛋白产物表达但是其产物功能减弱甚至丧失的极少数病例出现假阳性而漏检，但是利用单克隆抗体筛查hmlh1、hmsh2蛋白，对msi-h的判定仍具有很高的特异性和准确性。有文献报道：同时用pcr检测msi与利用抗hmlh1、抗hmsh2单克隆抗体检测1144份结肠癌标本，其中350例(30.6％)被检测为msi-h的免疫组织化学显示其中323例表现为hmlhi(70.6％)或hmsh2(29.4％)，敏感性达92.3％、特异性为100％，仅有3.3％的msi-h病例表达上述基因蛋白。与pcr技术相比有快速、灵敏、成本低等优势，故适宜用于hnpcc的家系分析和大规模的流行病学调查。肿瘤的预后与肿瘤的早期发现与肿瘤的早期治疗密切相关，寻找特异的肿瘤分子标记如msi的研究，对临床用药、预后等方面都具有指导意义。技术实现要素：本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识做出的：发明人发现，如果待测样本能够同时检测出6个单态性单核苷酸重复位点，包括nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26和mono-27中的至少两个具有微卫星不稳定，那么该待测样本的细胞被施加pd-1单抗后，其复制会被高效抑制或被特异性杀伤；如果该待测样本来源于癌症患者，那么患者给予pd-1单抗治疗后，其患者进行pd-1单抗免疫治疗的效果更好，五年存活率更高。基于上述发现，在本发明的第一方面，本发明提出了一组引物组。根据本发明的实施例，所述引物组包括下列6对引物：第一对引物：具有seqidno:1所示核苷酸序列的第一正向引物和具有seqidno:2所示核苷酸序列的第一反向引物；第二对引物：具有seqidno:3所示核苷酸序列的第二正向引物和具有seqidno:4所示核苷酸序列的第二反向引物；第三对引物：具有seqidno:5所示核苷酸序列的第三正向引物和具有seqidno:6所示核苷酸序列的第三反向引物；第四对引物：具有seqidno:7所示核苷酸序列的第四正向引物和具有seqidno:8所示核苷酸序列的第四反向引物；第五对引物：具有seqidno:9所示核苷酸序列的第五正向引物和具有seqidno:10所示核苷酸序列的第五反向引物；第六对引物：具有seqidno:11所示核苷酸序列的第六正向引物和具有seqidno:12所示核苷酸序列的第六反向引物。gagtcgctggcacagttcta(seqidno:1)。ctggtcactcgcgtttacaa(seqidno:2)。ttgctgaattttacctcctgac(seqidno:3)。attgtgccattgcattccaa(seqidno:4)。ccatgcttgcaaaccact(seqidno:5)。cgataatactagcaatgacc(seqidno:6)。ctcgcctccaagaatgtaagt(seqidno:7)。tctgcattttaactatggctc(seqidno:8)。gaaattggatattgcagcagt(seqidno:9)。gctcctttataagcttcttcagtata(seqidno:10)。gcagggaaatggtgggaacc(seqidno:11)。agggtggatcaaatttcacttgg(seqidno:12)。根据本发明实施例的引物组能够高效特异性地同时检测nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26和mono-27单态性单核苷酸重复位点的微卫星不稳定，检测结果峰值稳定且分布合理，无杂峰。根据本发明的实施例，上述引物组还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述引物组包括：第七对引物：具有seqidno:13所示核苷酸序列的第七正向引物和具有seqidno:14所示核苷酸序列的第七反向引物；第八对引物：具有seqidno:15所示核苷酸序列的第八正向引物和具有seqidno:16所示核苷酸序列的第八反向引物；第九对引物：具有seqidno:17所示核苷酸序列的第九正向引物和具有seqidno:18所示核苷酸序列的第九反向引物。tgagcgcttctagggacttct(seqidno:13)。gcattggggacatgaacaca(seqidno:14)。ggaaggtcgaagctgaagtgag(seqidno:15)。ttgcctaacctatggtcataacg(seqidno:16)。ccctgggctctgtaaagaatag(seqidno:17)。atcagagcttaaactgggaagctg(seqidno:18)。上述三对引物可同时扩增内参基因位点pentac、pentad，以及性别标记位点tamrad，而不会影响seqidno:1～seqidno：12所示引物组的特异性，识别样本是否同源，防止样品污染，作为有效的样本质控。根据本发明的实施例，所述引物组的5’端具有荧光素标记。进而可以更好的筛选目的片段，去除杂峰干扰(筛去无荧光标记的峰)。根据本发明的实施例，所述第三、第四、第五对引物的5’端标记fam，所述第一、第二和第七对引物的5’端标记hex，所述第六、第八、第九对引物的5’端标记tamrad。发明人发现，上述九对引物扩增产生的目的片段大小在80bp-240np之间，在这个狭小的范围内九对引物只在同一个组内很难区分分子量相近的目的片段，因此，为了能够更好的筛选目的片段，发明人根据引物扩增产生的目的片段的分子量大小将引物划分为三组，即：第三、四、五对引物为第一组；第一、二、七对引物为第二组；第六、八、九对引物为第三组。分组标准为：每组内3对引物扩增产生的目的片段分子量大小相差至少30bp，大小相近的分在不同组中。上述三组引物分别添加不同的荧光标记(fam、hex、tamrad)，三种荧光标记的荧光波长不同，颜色不同，可以更好地筛选目的片段。利用测序仪的三个荧光通道来进行检测，同一通道内检测的一组3个扩增片段分子量大小相差足够大而能够鉴别，分子量大小相近的扩增片段分别在不同通道检测因而也能够鉴别。在本发明第二方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面所述的引物组。进而利用根据本发明实施例的试剂盒，可同时检测nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26和mono-27单态性单核苷酸重复位点的微卫星不稳定，检测结果峰值稳定且分布合理，无杂峰。根据本发明的实施例，上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述引物组的浓度分别为：所述第一对引物的浓度为0.58nm，所述第二对引物的浓度为0.58nm，所述第三对引物的浓度为1.08nm，所述第四对引物的浓度为0.58nm，所述第五对引物的浓度为1.08nm，所述第六对引物的浓度为3.12nm，所述第七对引物的浓度为5.40nm，所述第八对引物的浓度为3.12nm，和所述第九对引物的浓度为0.27nm。进而试剂盒用于同时检测上述单态性单核苷酸重复位点的微卫星不稳定的特异性和灵敏性进一步提高。在本发明的第三方面，本发明提出了一种同时检测nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26和mono-27单态性单核苷酸重复位点微卫星不稳定的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：以前面所述的引物组为引物将待测样品基因组进行pcr扩增。根据本发明实施例的检测方法，可特异性和灵敏性地同时检测出待测样品基因组中的nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26和mono-27单态性单核苷酸重复位点的微卫星不稳定，进而为后续的进一步的科学研究或癌症的用药指导奠定了基础。如果待测样本能够同时检测出6个单态性单核苷酸重复位点包括nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26和mono-27中的至少两个具有微卫星不稳定，那么该待测样本的细胞被施加pd-1单抗后，其复制会被高效抑制或被特异性杀伤；如果该待测样本来源于癌症患者，那么患者给予pd-1单抗治疗后，其患者进行pd-1单抗免疫治疗的效果更好，五年存活率更高。根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：所述pcr扩增是在如下条件进行的：扩增程序为：进而扩增的灵敏度和特异性进一步提高。扩增酶为takara公司的multiplex。进而pcr扩增的特异性更高，效果更好。mg2+浓度为3.0mm。进而进一步显著去除非特异性扩增产物的产生。dntp终浓度为200μm。进而进一步保证扩增的特异性。扩增体积为10μl。进而进一步节约扩增成本。根据本发明的实施例，所述待测样品中肿瘤细胞的数量占总细胞数量的至少20％。即预先检测待测样本中肿瘤细胞含量，当肿瘤细胞含量至少20％时，进行微卫星不稳定检测。发明人发现，当肿瘤细胞含量至少20％时，则利用根据本发明实施例的方法有效同时检测nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26和mono-27单态性单核苷酸重复位点的微卫星不稳定的准确度和检出性显著提高，从而降低假阴性率。在本发明的第四方面，本发明提出了一种同时检测nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26和mono-27单态性单核苷酸重复位点微卫星不稳定的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：以前面所述的引物组为引物将待测样品基因组进行pcr扩增，所述待测样品中肿瘤细胞的数量占总细胞数量的至少20％，所述pcr扩增是在如下条件进行的：扩增程序为：扩增酶为takara公司的multiplex；mg2+浓度为3.0mm；dntp终浓度为200μm；扩增体积为10μl。根据本发明实施例的检测方法，计数待测样品中肿瘤细胞的数量，当肿瘤细胞含量至少20％时，，而后进行msi检测，显著提高了msi检测的准确度，大大降低了假阴性率，且根据本发明实施例的方法可特异性和灵敏性地同时检测出待测样品基因组中的nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26和mono-27单态性单核苷酸重复位点的微卫星不稳定，扩增条件更加简单，扩增体系节省，模板量低，且整个扩增流程所需时间仅6个小时左右，易操作。为后续的进一步的科学研究或癌症的用药指导奠定了基础。如果待测样本能够同时检测出6个单态性单核苷酸重复位点包括nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26和mono-27中的至少两个微卫星不稳定，那么该待测样本的细胞被施加pd-1单抗后，其复制会被高效抑制或被特异性杀伤；如果该待测样本来源于癌症患者，那么患者给予pd-1单抗治疗后，其患者进行pd-1单抗免疫治疗的效果更好，五年存活率更高。所述癌症的种类不受特别限制。根据本发明的实施例，所述癌症包括选自结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胆管癌、胃癌和肝癌的至少之一。优选地，所述癌症为结直肠癌。附图说明图1是根据本发明实施例的msi-h(微卫星高不稳定状态)的结直肠肿瘤患者样品的msi检测结果；图2是根据本发明实施例的肿瘤样品的病理检测结果；图3a是根据本发明实施例的肿瘤组织dna与血液对照dna按照1：1混合下的msi检测结果；图3b是根据本发明实施例的肿瘤组织dna与血液对照dna按照1：2混合下的msi检测结果；图3c是根据本发明实施例的肿瘤组织dna与血液对照dna按照1：3混合下的msi检测结果；图3d是根据本发明实施例的肿瘤组织dna与血液对照dna按照1：4混合下的msi检测结果；图4a是根据本发明实施例的以肿瘤患者组织样本为例利用根据本发明实施例的方法检测微卫星不稳定的血液对照检测结果；图4b是根据本发明实施例的以肿瘤患者组织样本为例利用根据本发明实施例的方法检测微卫星不稳定的肿瘤组织检测结果；以及图5是根据本发明实施例的利用现有技术检测微卫星不稳定的检测结果。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下面首先详细介绍了本发明引物组合的获得以及检测方法的确定过程。1、引物组合的设计首先选取目前国际上常用的分析肿瘤细胞微卫星不稳定状态的6个单核苷酸位点，包括nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26、mono-27，另外还包括1个性别位点amel和2个五核苷酸位点内参位点pentac和pentad，发明人参照文献报道的这9个位点所在基因的genebank序列号，如下所示，然后从ncbi核酸数据库找到各位点所对应的基因序列，各位点所在基因的部分序列见序列表。nr-21核苷酸序列actgcctggtgcacagagacagaaccatcctggtttctggaagacacatccctttcagcagaattccagccggagtcgctggcacagttctatttttatatttaaatgtatgtctcccctggcctttttttttttttttttttttagcaacacttttcttgtttgtaaacgcgagtgaccagaaagtgtgaatgcggagtaggaatgtttttcgtgttctcttttatctgcttgcctttttagagagtagccatggttcctatttcggaaaaggacgttctaattcaaagctctctcccaa(seqidno:19)。nr-24核苷酸序列aaaatagctccctatttagtgaaaaattatctgaatatttaaggtctgccttaacgtgatccccattgctgaattttacctcctgactccaaaaactcttctcttccctgggcccagtcctattttttttttttttttttttttttgtgagacagagtctcactctgtcacccaggttggaatgcaatggcacaatctccgctcactgcaacgtccgcctcccgggttcacgccattctc(seqidno:20)。nr-27核苷酸序列tcatacatagaaagagatgtgactcccgccatcatggaggatgacgagttggccctagacttagaagacttgctgagcttttcttaccaggtggcaaagggcatggctttcctcgcctccaagaatgtaagtgggagtgattctctaaagagtttgtgttttgtttttttgatttttttttttttttttttttttttgagaacagagcattttagagccatagttaaaatgcagaatgtattttgaagtgtggtaaccaaaagcagaggaaatttagtttcttcatgttgcaactgctg(seqidno:21)。bat-25核苷酸序列aattgttggtaatgagatgtgatgtttctcctgccacctggaaacaaagcattgaagtctgcagttgaaaagcccaacgtctgtgagatccaggaaaccatgcttgcaaaccactggtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagccacagtgacttgcttattggtcattgctagtattatcgactcagaacctctttactaatggctagtaaatcataattgagaaattctgaattt(seqidno:22)。bat-26核苷酸序列gatccagtggtataggaaatcttcgatttttaaattcttaattttaggttgcagtttcatcatcgtctgctgtaatcaagtttttagaactcttatcagatgattccaactttggacagtttgaactgactacttttgacttcagccagtatatgaaattggatattgcagcagtcagagcccttaacctttttcaggtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagggttaaaaatgttgaatggttaaaaaatgtttcattgacatatactgaagaagcttataaaggagctaaaata(seqidno:23)。mono-27核苷酸序列tcagccgggcgtggtggagggcgcctgtagtcccagctactcgggaggctgaggcagggaaatggtgggaacccaggggggtggagattgcagtgagctgagattgcgccactgcactccagcgtgggagacagagcaagactctgcctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatcctggttttacttttttttcttttttagttggccaagtgaaatttgatccacccttaagaaaggagacagaaccacatcatgaacttgtaagtagtatagccttagaatgttagcactgaaaa(seqidno:24)。pentac核苷酸序列accagcagcgccgccactgctacaagagagcattccaacactgagcgcttctagggacttcttcagaaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacttagtccctcttttctattaccagtgcatatccctgtttaagccttgcctgacaggtgcaaagtgtgttcatgtccccaatgccatgacaagtgggtagggcaggggtcatcacccccagtttccagaggaggaaactgtgtggcagggatggcaagtgatctgtccttccctttcagtagtaggaaactgt(seqidno:25)。pentad核苷酸序列acactttgggaggccgaggtggaggatcatttgagaccaggagttaaagaccagcctgggcaccatagtgagaccccatctctacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactagctgggcacagtggcatgcacctatagtcccagctactcaggaggctgaggcaggaggatcacttgagcccagagagtcaaggctacagtgagttgtgattgtaccattgcattctagcctgggcaacagagcaagaccccagctctaaaaattaaaaaaaaaaaaaaaaaagtagagacggcagtaggaggagctacgtcatcacaaccaggaaactcccagggtcagatcaggggaagcccgtgaggcaaggcctggcccagcaggctcgagtctctttaaaatcttgctatttttgctcatcatggaattttttttttctttttgcacattgatttagattttctgaaatactgtgctaaaa(seqidno:26)。amel核苷酸序列aaagtaattttagtctctcttaatgttaacaattgcatattgacttaatctccttactctctcttcccttccttcacactctcccttcctctctctttctcttctcctcccctcctccctataaaagctaccacctcatcctgggcaccctggttatatcaacttcagctatgaggtaatttttctctttactaattttgatcactgtttgcattagcagtcccctgggctctgtaaagaatagtgggtggattcttcatcccaaataaagtggtttctcaagtggtcccaattttacagttcctaccatcagcttcccagtttaagctctgatggttggcctcaagcctgtgttgctccagcaccctcctgcctgaccattcggattgactcttc(seqidno:27)。用于扩增nr-21的上游引物是由位于序列1中的40～127位的20个连续碱基构成的引物，下游引物是由230～300位的互补序列的20个连续碱基构成的引物。用于扩增nr-24的上游引物是由位于序列2中的30～125位的22个连续碱基构成的引物，下游引物是由147～207位的互补序列的20个连续碱基构成的引物。用于扩增nr-27的上游引物是由位于序列3中的51～123位的20个连续碱基构成的引物，下游引物是由125～200位的互补序列的20个连续碱基构成的引物。用于扩增bat-25的上游引物是由位于序列4中的38～160位的21个连续碱基构成的引物，下游引物是由188～261位的互补序列的21个连续碱基构成的引物。用于扩增bat-26的上游引物是由位于序列5中的50～175位的21个连续碱基构成的引物，下游引物是由258～300位的互补序列的26个连续碱基构成的引物。用于扩增mono-27的上游引物是由位于序列6中的75～150位的20个连续碱基构成的引物，下游引物是由230～382位的互补序列的23个连续碱基构成的引物。用于扩增pentac的上游引物是由位于序列7中的67～186位的20个连续碱基构成的引物，下游引物是由253～370位的互补序列的23个连续碱基构成的引物。用于扩增pentad的上游引物是由位于序列8中的56～176位的22个连续碱基构成的引物，下游引物是由270～384位的互补序列的23个连续碱基构成的引物。用于扩增amel的上游引物是由位于序列9中的187～267位的22个连续碱基构成的引物，下游引物是由270～378位的互补序列的24个连续碱基构成的引物。引物设计原则：本发明中用于检测msi的9对引物是由primerpremier5和ncbiblast软件设计完成。多重pcr成功的先决条件是最佳的设计引物对，多重pcr引物长度在20-25个核苷酸之间，多重pcr引物的gc含量在40％-60％之间。多重pcr各引物的tm值≥58℃，本发明将各引物的tm值尽量控制在相同的水平，保证所有引物对能在同一退火温度下扩增，相比现有技术中的多个退火温度，更加的容易实现。另外，所有设计的引物用autodimer软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用情况，确保特异性和防止二聚体的出现。所设计引物如下所示：nr-21引物：上游引物：gagtcgctggcacagttcta(seqidno:1)；下游引物：ctggtcactcgcgtttacaa(seqidno:2)；nr-24引物：上游引物：ttgctgaattttacctcctgac(seqidno:3)；下游引物：attgtgccattgcattccaa(seqidno:4)；nr-27引物：上游引物：ccatgcttgcaaaccact(seqidno:5)；下游引物：cgataatactagcaatgacc(seqidno:6)；bat-25引物：上游引物：ctcgcctccaagaatgtaagt(seqidno:7)；下游引物：tctgcattttaactatggctc(seqidno:8)；bat-26引物：上游引物：gaaattggatattgcagcagt(seqidno:9)；下游引物：gctcctttataagcttcttcagtata(seqidno:10)；mono-27引物：上游引物：gcagggaaatggtgggaacc(seqidno:11)；下游引物：agggtggatcaaatttcacttgg(seqidno:12)；pentac引物：上游引物：tgagcgcttctagggacttct(seqidno:13)；下游引物：gcattggggacatgaacaca(seqidno:14)；pentad引物：上游引物：ggaaggtcgaagctgaagtgag(seqidno:15)；下游引物：ttgcctaacctatggtcataacg(seqidno:16)；amel引物：上游引物：ccctgggctctgtaaagaatag(seqidno:17)；下游引物：atcagagcttaaactgggaagctg(seqidno:18)。设计合成9对无荧光标签引物，首先单独进行pcr扩增。将9对引物配置成浓度为10μm，然后在取样稀释至1μm待用，采用任一人源的dna模板，样本浓度为2ng/μl。扩增完成后将扩增产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果，对pcr的体系和扩增条件作出调整。最终保证在同一扩增体系和同一扩增条件下，9对引物都能获得单一特异性条带。进行第一步多重pcr，将9对引物加上荧光标签分成三组：第一组含有fam标签的nr-27、bat-25、bat-26，第二组含有hex标签nr-21、nr-24、pentac，第三组含有tamrad标签amel、mono-27、pentad。分别进行三组三重pcr。后按照上一步的体系和扩增条件进行单重扩增，扩增完成后将扩增产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，分析各位点条带的单一性和条带亮度，确保加上荧光后对扩增特异性不会产生影响，否则重新设计引物。然后，将单重的扩增产物进行毛细管电泳检测，根据毛细管电泳检测结果进一步分析各对引物的扩增效率和特异性。最后进行九重pcr验证，将9对引物混合到一管中扩增，扩增产物首先进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，分析九重pcr扩增产物的特异性，确保无非特异性条带产生。然后，九重pcr的扩增产物进行毛细管电泳检测，根据毛细管电泳检测结果进一步分析各对引物的扩增效率和特异性，调整各自的浓度，尽量保证各位点的扩增产物信号一致，最终确定9对引物的加入比例。2.扩增体系及条件2.1taq酶和缓冲液多重pcr扩增体系中对taq酶的要求极高，为保证了极高的特异性和扩增的稳定性。发明人测试过多家公司的热启动taq酶，如kapa的fastmultiplexpcrkit和takara的multiplexpcrassaykitver.2，发现takara公司的multiplex特异性更高，效果更好。2.2mg2+浓度本发明中所使用的mg2+浓度为3.0mm，能够显著去除非特异性扩增产物的产生。2.3dntps浓度本发明中所使用的dntps为高纯度的，终浓度为200μm，可进一步保证扩增的特异性。2.4扩增体积本发明首先采用了10μl体系进行扩增，节约成本，同时能够得到较理想的扩增产物。另外，扩大到20μl和50μl体系仍然能够得到预期的效果。2.5扩增条件本发明首先进行了退火温度的调整，从58℃到62℃之间都进行了尝试，发现在60℃和62℃之间能够得到扩增灵敏度和特异性较好的结果。表1所示本发明最终确定的扩增条件。表1.pcr扩增程序温度℃时间95℃5min94℃30s62℃50s72℃1min72℃5min4℃-下面以来自于结直肠癌患者的肿瘤样品为例，做进一步的研究。发明人创造性地发现，msi检测结果的准确性与待测样本中肿瘤细胞含量有关。具体来说，图1是一个msi-h(微卫星高不稳定状态)的结直肠肿瘤患者样品的msi检测结果，图2显示，通过病理观察该样品的肿瘤比例(样本中肿瘤细胞占全部细胞的比例，即权利要求9和10中所述“肿瘤细胞含量”)为60％，然后将肿瘤组织dna与血液对照dna按照1：1(相当于肿瘤比例30％)，1：2(相当于肿瘤比例20％)，1：3(相当于肿瘤比例15％)和1：4(相当于肿瘤比例12％)混合，发现在1:1和1:2混合样品中能够检测到msi(出现双峰)，而在1：3和1；4混合样品中不能检测到msi(如图3a～图3d)。基于上述结果，发明人发现只有当样品中肿瘤比例达到20％及以上时，才能有效检出msi，从而保证msi检测的准确性，避免常规方法中因样品肿瘤细胞含量低而造成msi检测假阴性结果。因此，本发明所述方法在msi检测之前增加质控步骤，所述质控步骤按照如下方法进行：通过病理检测确定待测样本中肿瘤细胞含量。当确定肿瘤细胞含量≧20％时，进行后续的msi检测，从而保证msi检测的准确性，降低假阴性率。下面以肿瘤患者组织样本为例利用根据本发明实施例的上述检测方法检测微卫星不稳定，同时以同一患者血液样本作为对照。结果如图4a和图4b所示。其中，图4a是血液对照检测结果，图4b是肿瘤组织检测结果。结果显示，本发明msi检测结果杂峰少，荧光强度信号稳定均一，检测特异性好。同时，发明人在相同的实验条件下，利用现有技术cn102230004b检测微卫星不稳定，结果如图5显示，测试图杂峰多且杂峰信号强，各个峰之间信号强度差异大，且峰型不好，如有突变，峰裂分为双峰，难以辨识该位点是否存在突变。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。sequencelisting<110>北京莲和医学检验所有限公司<120>引物组、试剂盒以及同时检测单态性单核苷酸重复位点微卫星不稳定的方法<130>pidc3176322<160>27<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>第一正向引物<400>1gagtcgctggcacagttcta20<210>2<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>第一反向引物<400>2ctggtcactcgcgtttacaa20<210>3<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>第二正向引物<400>3ttgctgaattttacctcctgac22<210>4<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>第二反向引物<400>4attgtgccattgcattccaa20<210>5<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>第三正向引物<400>5ccatgcttgcaaaccact18<210>6<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>第三反向引物<400>6cgataatactagcaatgacc20<210>7<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>第四正向引物<400>7ctcgcctccaagaatgtaagt21<210>8<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>第四反向引物<400>8tctgcattttaactatggctc21<210>9<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>第五正向引物<400>9gaaattggatattgcagcagt21<210>10<211>26<212>dna<213>artificial<220><223>第五反向引物<400>10gctcctttataagcttcttcagtata26<210>11<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>第六正向引物<400>11gcagggaaatggtgggaacc20<210>12<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>第六反向引物<400>12agggtggatcaaatttcacttgg23<210>13<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>第七正向引物<400>13tgagcgcttctagggacttct21<210>14<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>第七反向引物<400>14gcattggggacatgaacaca20<210>15<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>第八正向引物<400>15ggaaggtcgaagctgaagtgag22<210>16<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>第八反向引物<400>16ttgcctaacctatggtcataacg23<210>17<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>第九正向引物<400>17ccctgggctctgtaaagaatag22<210>18<211>24<212>dna<213>artificial<220><223>第九反向引物<400>18atcagagcttaaactgggaagctg24<210>19<211>301<212>dna<213>artificial<220><223>nr-21核苷酸序列<400>19actgcctggtgcacagagacagaaccatcctggtttctggaagacacatccctttcagca60gaattccagccggagtcgctggcacagttctatttttatatttaaatgtatgtctcccct120ggcctttttttttttttttttttttagcaacacttttcttgtttgtaaacgcgagtgacc180agaaagtgtgaatgcggagtaggaatgtttttcgtgttctcttttatctgcttgcctttt240tagagagtagccatggttcctatttcggaaaaggacgttctaattcaaagctctctccca300a301<210>20<211>240<212>dna<213>artificial<220><223>nr-24核苷酸序列<400>20aaaatagctccctatttagtgaaaaattatctgaatatttaaggtctgccttaacgtgat60ccccattgctgaattttacctcctgactccaaaaactcttctcttccctgggcccagtcc120tattttttttttttttttttttttttgtgagacagagtctcactctgtcacccaggttgg180aatgcaatggcacaatctccgctcactgcaacgtccgcctcccgggttcacgccattctc240<210>21<211>299<212>dna<213>artificial<220><223>nr-27核苷酸序列<400>21tcatacatagaaagagatgtgactcccgccatcatggaggatgacgagttggccctagac60ttagaagacttgctgagcttttcttaccaggtggcaaagggcatggctttcctcgcctcc120aagaatgtaagtgggagtgattctctaaagagtttgtgttttgtttttttgatttttttt180tttttttttttttttttgagaacagagcattttagagccatagttaaaatgcagaatgta240ttttgaagtgtggtaaccaaaagcagaggaaatttagtttcttcatgttgcaactgctg299<210>22<211>240<212>dna<213>artificial<220><223>bat-25核苷酸序列<400>22aattgttggtaatgagatgtgatgtttctcctgccacctggaaacaaagcattgaagtct60gcagttgaaaagcccaacgtctgtgagatccaggaaaccatgcttgcaaaccactggtaa120aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagccacagtgacttgcttattggtcattgctagtat180tatcgactcagaacctctttactaatggctagtaaatcataattgagaaattctgaattt240<210>23<211>300<212>dna<213>artificial<220><223>bat-26核苷酸序列<400>23gatccagtggtataggaaatcttcgatttttaaattcttaattttaggttgcagtttcat60catcgtctgctgtaatcaagtttttagaactcttatcagatgattccaactttggacagt120ttgaactgactacttttgacttcagccagtatatgaaattggatattgcagcagtcagag180cccttaacctttttcaggtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagggttaaaaatgtt240gaatggttaaaaaatgtttcattgacatatactgaagaagcttataaaggagctaaaata300<210>24<211>300<212>dna<213>artificial<220><223>mono-27核苷酸序列<400>24tcagccgggcgtggtggagggcgcctgtagtcccagctactcgggaggctgaggcaggga60aatggtgggaacccaggggggtggagattgcagtgagctgagattgcgccactgcactcc120agcgtgggagacagagcaagactctgcctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatcct180ggttttacttttttttcttttttagttggccaagtgaaatttgatccacccttaagaaag240gagacagaaccacatcatgaacttgtaagtagtatagccttagaatgttagcactgaaaa300<210>25<211>319<212>dna<213>artificial<220><223>pentac核苷酸序列<400>25accagcagcgccgccactgctacaagagagcattccaacactgagcgcttctagggactt60cttcagaaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaa120acaaaacttagtccctcttttctattaccagtgcatatccctgtttaagccttgcctgac180aggtgcaaagtgtgttcatgtccccaatgccatgacaagtgggtagggcaggggtcatca240cccccagtttccagaggaggaaactgtgtggcagggatggcaagtgatctgtccttccct300ttcagtagtaggaaactgt319<210>26<211>480<212>dna<213>artificial<220><223>pentad核苷酸序列<400>26acactttgggaggccgaggtggaggatcatttgagaccaggagttaaagaccagcctggg60caccatagtgagaccccatctctacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactagctgg120gcacagtggcatgcacctatagtcccagctactcaggaggctgaggcaggaggatcactt180gagcccagagagtcaaggctacagtgagttgtgattgtaccattgcattctagcctgggc240aacagagcaagaccccagctctaaaaattaaaaaaaaaaaaaaaaaagtagagacggcag300taggaggagctacgtcatcacaaccaggaaactcccagggtcagatcaggggaagcccgt360gaggcaaggcctggcccagcaggctcgagtctctttaaaatcttgctatttttgctcatc420atggaattttttttttctttttgcacattgatttagattttctgaaatactgtgctaaaa480<210>27<211>396<212>dna<213>artificial<220><223>amel核苷酸序列<400>27aaagtaattttagtctctcttaatgttaacaattgcatattgacttaatctccttactct60ctcttcccttccttcacactctcccttcctctctctttctcttctcctcccctcctccct120ataaaagctaccacctcatcctgggcaccctggttatatcaacttcagctatgaggtaat180ttttctctttactaattttgatcactgtttgcattagcagtcccctgggctctgtaaaga240atagtgggtggattcttcatcccaaataaagtggtttctcaagtggtcccaattttacag300ttcctaccatcagcttcccagtttaagctctgatggttggcctcaagcctgtgttgctcc360agcaccctcctgcctgaccattcggattgactcttc396当前第1页12