自蚕豆的基因后，考察转基因烟草对甲醛胁迫的响应情况。将生长一致的野生型和转基因烟草移栽到盆中在温室培养I个月后，再将野生型和转基因烟草放入甲醛测定仪中，用20ppm甲醛处理2h并每1min中读取剩余甲醛含量，处理完之后，用植物气孔计测定气孔传导率。
[0011]本发明相对于现有技术的优点和技术效果如下:
本发明提供的植物表达载体为进一步研宄基因对甲醛胁迫的应答提供了更好的基因工程手段和工具，以及通过该载体转染野生型烟草所获得的转基因的烟草扩大了在增强植物对甲醛吸收能力的应用，为通过基因工程方法提高植物净化甲醛能力奠定了理论基础。同时，本发明中所获得的结果能够为我们通过基因工程手段提高植物甲醛吸收能力奠定理论基础以及提供更多的基因资源。
【附图说明】
[0012]图1为本发明中甲醛胁迫下基因转录水平变化电泳示意图；
图2为本发明中植物表达载体PK-35S-K/^°7C的构建策略图；
图3为本发明中外源基因的获得电泳示意图；
A:蚕豆RNA提取；B:PCR扩增基因CDS序列，图中M为Marker 111,1-3表示PCR扩增产物；C: 基因PCR产物胶回收，图中M为Marker III ；
图4本发明中TA克隆载体pMD18T- VFPPltM电泳检测示意图；
A为质粒pMD18T-泳检测，图中1_5为不同编号的pMD18T_ VFPP1CM粒，对照是对照质粒为质粒pMDlST-K/^WC PCR检测，图中M为Marker III，正对照是蚕豆cDNA，负对照是水，1-5表示不同编号的质粒；C为pMDlST-K/^/^C BamHI和XhoI双酶切检测，图中M为Marker III，对照是未酶切的质粒，1_5表示不同编号的质粒；
图5为本发明中中间载体pENTR- VFPPim电泳检测示意图；
A:pENTR-K/^76质粒电泳检测示意图，对照是对照质粒，1-6表示不同编号的质粒；B:pENTR- VFPPlC BamHI和XhoI双酶切检测示意图，对照是未酶切质粒，1-5表示不同编号的质粒；C:pENTR- VFPPICMM PCR检测示意图，图中M为Marker III，正对照是蚕豆cDNA，负对照是水，1_6表不不同编号的质粒；
图6为本发明中植物表达载体PK-35S- 的检测电泳示意图；
A:PK-35S-K/^°7CM粒电泳检测，对照为空载pK2GW7.0质粒，1-3表示不同编号的质粒；B:PK-35S- VFPPlC BamHI和XhoI双酶切检测，图中M为Marker III, 1-3是不同编号的质粒;
图7为本发明中植物表达载体PK-35S- 电转农杆菌ρΜΡ105后的菌液PCR检测电泳示意图；图中M为Marker III，正对照是PK-35S-粒，负对照是水，I是农杆菌单菌落；
图8是本发明中转基因烟草的的RT-PCR电泳检测示意图，图中WT是野生型烟草，1-5表示不同编号的转基因烟草株系，M为Marker III ；
图9是本发明野生型和转基因烟草株系的基因组电泳示意图，图中M为Markerlll，1-5表示不同编号的转基因烟草株系；
图10为本发明野生型和转基因烟草株系基因组PCR检测，图中正对照是粒，负对照是水，1-5表示不同编号的转基因烟草株系；
图11为本发明转基因烟草Western blot检测，图中WT是野生型烟草，1、3和5是转基因烟草株系；
图12是本发明转基因烟草对高浓度气体甲醛的吸收能力分析，图中CK是无植物的空盆处理，WT是野生型烟草，1、3和5是转基因烟草株系；
图13是本发明20ppm气体甲醛处理野生型和转基因烟草2h气孔导度的变化，图中WT是野生型烟草，1、3和5是转基因烟草株系；
图14是20ppm气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草H+-ATPase活性变化，图中WT是野生型烟草，1、3和5是转基因烟草株系；
图15是20ppm气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草H+泵活性变化，图中WT是野生型烟草，1、3和5是转基因烟草株系。
【具体实施方式】
[0013]本实施中采用的试剂主要为分子生物学实验试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶和dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒的提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限工程。其余试剂均为国产分析纯。
[0014]仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0015]实施例1:甲醛胁迫下基因表达水平检测
选取温室下盆栽4周生长一致的健壮蚕豆植株，实验时将种植蚕豆的花盆用塑料袋覆盖以防止土壤和土壤中的微生物吸收甲醛，再将蚕豆植株放入空气中含有0、5、10、20和40ppm气体甲醛的玻璃密封仓中，该装置规格为700 mmX600 mmX700 mm(长X宽X高)，经检测无气体外泄现象。密封仓的两侧提供光源，仓中光照强度为600 ymol/m2 *s，密封仓的角落装有四个小风扇，以加速气体甲醛在仓内循环并均匀散布于仓内空间。密封仓中的温度和湿度由传感器(CH20/C-10，MEMBRAP0R，Swizerland)检测并在仪表盘自动显示。0、5、10、20和40ppm气体甲醛处理时间为30 min后收集叶片用液氮速冻后置于_80°C冰箱。使用Trolz试剂盒提取叶片总RNA，用20 μ L焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA，从各RNA样品中取5 yL，用M-MLV Reverse Transcriptase(Promega公司)反转录合成cDNA，以反转录合成的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，以16S rRNA为内参进行RT-PCR分析。根据基因序列设计引物为:上游:5’ -AGCGGTTCTGGACGACAT-3’，下游引物:5’ - AGCTCTGCTTGCCACGAT-3’ ；16S rRNA的引物序列为:上游引物:5’ -TCAAGGTCGGGGACAACAGT-3’，下游引物:5’ -ACGGACTCTTTACGCCCAAT-3’，结果如图1所示，从图1可以看出，随着甲醛处理浓度的升高，VFPPicm因的表达水平受到明显地抑制。
[0016]实施例2:植物表达载体PK-35S- 的构建
1、外源基因的获得以及TA克隆
植物表达载体的构建策略如图2所示，提取蚕豆叶片中总RNA(图3Α)，经反转录为cDNA后，以cDNA为模板，用带有限制性酶切位点BamHI和XhoI的特异性引物扩增获得VFPPlC^CDS 片段(972bp)(图 3B)。h游引物:5’ -GGATCCATGAGTGCACAAGGACAAC-3’ (含有 BamH I酶切位点)，下游引物:5 ’ -CTCGAGTCACATCTTGTTTGACATCAC-3 ’(含有XhoI酶切位点)。回收并纯化基因片段(图3C)，并将其连接到PMD18T (大连宝生物公司)载体上，转化大肠杆菌感受态DH5 α (天根生化科技)，采用碱裂解法提取质粒DNA (图4Α)，经I %琼脂糖凝胶电泳，选取大小和理论值相符的重组质粒做进一步的PCR检测和双酶切检测。以重组质粒为模板，用特异性引物扩增得到972bp的PCR产物，如序列表I所示。根据阳性重组质粒pMD18T-K/^°76^体两端的多克隆位点，用BamHI和XhoI双酶切重组质粒，经I %琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD18T-K/^°7C酶切产物为2.7kb和972bp左右的条带(图4B)，并经过质粒PCR检测结果(图4C)显示1_5质粒均能扩增出与目的基因片段大小的条带，将正确的重组质粒送上海生工生物工程有限公司测序。
[0017]2、中间载体pENTR-PPlc的构建
用BamHI和XhoI双酶切pMD18T_获卩原始入门克隆载体pENTR_2B，通过胶回收试剂盒分别回收酶切后的VFPPim 2B片段，然后在T4-DNA连接酶的作用下将这两个回收