[0028] (3)滋养细胞的纯化：用含体积分数为10%胎牛血清（FBS)的DMEM/F12、丙酮酸 盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF配制成悬浮 液，将密度梯度离心后的滋养细胞进行重悬，用差速贴壁法去除成纤维细胞后计数，获得的 滋养细胞量可达（6. 12)X108个；
[0029] 滋养细胞的鉴定：所获滋养细胞取部分细胞，用PBS洗涤2次，调整细胞密度至 IX109/L。0. 5mlEP管中加入0.ImL细胞悬液，按顺序加入小鼠抗人细胞角蛋白7单克隆 抗体和FITC标记的羊抗鼠二抗孵育，设置一抗和FITC对照，流式细胞仪计数10000个细 胞。经流式细胞仪检测，细胞角蛋白7阳性率为（90. 00±4. 36) %。
[0030] (4)胎盘间充质干细胞的进一步分离与培养：用含体积分数为10 %胎牛血清 (FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克 /mL的bFGF、增殖促进剂配制成悬浮液，所述增殖促进剂为凝结的脐带血液的液体成分，以 促进细胞生长，将密度梯度离心后获得的胎盘间充质干细胞进行重悬，在通过多轴旋转所 形成的模拟微重力环境下，依次通过电磁场和声波处理间充质干细胞，可以获得具有更小 的平均气泡尺寸的间充质干细；计数并接种于75mm的培养瓶，在培养基中补充4mg/ml碱 性成纤维细胞生长因子（bFGF)、lOng/mlN-乙酰基-L-半胱氨酸、lOOng/ml氯化f丐，放入 37°C、二氧化碳浓度为0. 5%的C02培养箱中培养，2d换液1次，细胞生长至90%融合后， 消化并计数细胞，按1 : 4比例传代，细胞传代后生长速度较快，细胞形态比较均一，变化形 态明显的第2天用100ng/ml的BMP4处理，第3天或4用10ng/ml的BMP4处理，第5天用 lng/ml的BMP4处理，到第6天时，用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加 无血清培养基继续培养，传至第8代时细胞开始出现老化现象，细胞增殖缓慢，细胞体积增 大，胞浆中出现很多黑色颗粒，此时需要注入一种抗氧化剂，所述抗氧化剂为聚乙二醇-缀 合过氧化氢酶（PEG-过氧化氢酶）或N-乙酰半胱氨酸，或使用抗氧化物，所述抗氧化物为 1-500yM丙酮酸乙酯（EP)，抑制间充质干细胞的衰老，用于增加干细胞产量，直到传至第 九或十代，见图2。
[0031] 胎盘间充质干细胞的鉴定：
[0032] 细胞表型检测：取第3代细胞，调整密度至1X109L\每管加入0.1 mL细胞 悬液。阴性对照管加入鼠IgG-FITC，IgG-PE;其他管分别加入鼠抗人抗体⑶14-PE， CD45-PE，CD34-PE，CD29-FITC，CD44-FITC，HLA-DR-FITC，室温孵育 30min，流式细胞 仪计数10000个细胞。流式细胞仪检测结果显示，第3代胎盘间充质干细胞表面标 志物比较均一，强表达透明质酸受体⑶44和整合素家族成员⑶29,阳性率分别为 (99. 86±0. 05) %，（98. 50±1. 26) % ;不表达造血干细胞标志物⑶34,⑶45和⑶14,阳性 率分别为（1.62 ±0.87) % (2. 26 ±1.95) %，（2. 08 ±0.97) %;强表达HLA-ABC，阳性率为 (99. 00 ±L58) %，不表达HLA-DR，阳性率为（1. 66 ± 0? 84) %。
[0033] 成骨潜能检测：取第3代细胞接种于12孔板上，每个标本3孔，2孔进行诱导，1孔 作为阴性对照。每孔加ImL完全培养基，含IX104个细胞。放入培养箱中培养，每2d换液 1次，直到细胞生长至70 % -80 %融合后开始诱导。成骨细胞诱导分化培养基为含体积分数 为10 %胎牛血清的L-DMEM培养基，5mmol/LP-磷酸甘油，50mg/L维生素C，lnmol/L地塞米 松。每2d更换1次诱导分化培养基，诱导20d，直至细胞出现聚集现象。将分化的胎盘间 充质干细胞用ImLPBS洗2遍；每孔加入ImL体积分数为10%的中性甲醛，室温固定细胞 10min。使用10g/L的茜素红（pH4. 1)染色，室温30min。再用去离子水洗除茜素红，直到 阴性对照孔背景染色基本消除。诱导4周后茜素红染色，胎盘间充质干细胞可被染成鲜艳 的橙红色，但阴性对照孔基本不上色，见图3。
[0034] 以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通 技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术 启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特征在于包括以下步 骤： (1) 胎盘标本处理，得处理后的胎盘组织，将胎盘组织进行组织消化，得细胞悬液； (2)不连续Percoll梯度密度分离：在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分 离液，每个密度5mL，再缓缓加入5mL细胞悬液，使用水平离心机室温下1200g离心20min， 小心弃除离心管20mL刻度以上的液体，收集12. 5~20.0 mL刻度的细胞层和12. 5~7. 5mL 刻度的液体，分别放入不同离心管里，用D-Hank' s液稀释5倍后，室温下1000 g离心15min ; ⑶滋养细胞的纯化：用含体积分数为10%胎牛血清（FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10 毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF配制成悬浮液，将密 度梯度离心后的滋养细胞进行重悬，用差速贴壁法去除成纤维细胞后计数； (4)胎盘间充质干细胞的进一步分离与培养：用含体积分数为10%胎牛血清（FBS)的 DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的 bFGF、增殖促进剂配制成悬浮液，将密度梯度离心后获得的胎盘间充质干细胞进行重悬，在 微重力环境下，依次通过电磁场和声波处理间充质干细胞，计数并接种于75mm的培养瓶， 放入37°C、二氧化碳浓度为0. 5 %的C02培养箱中培养，2d换液1次，细胞生长至90 %融合 后，消化并计数细胞，按1 : 4比例传代，细胞传代后生长速度较快，细胞形态比较均一，变 化形态明显的第2天用lOOng/ml的BMP4处理，第3天或4用lOng/ml的BMP4处理，第5 天用lng/ml的BMP4处理，到第6天时，用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶 中补加无血清培养基继续培养，直到传至第九或十代。2. 如权利要求1所述的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特 征在于所述的胎盘标本处理步骤包括：无菌条件下将娩出胎盘剥除羊膜，剪除胎盘母体面 2. 0~3. Omm组织后，剪下胎盘小叶，称取50g，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗 菌肽的保存液是将10~100微克/毫升多聚赖氨酸加入到10~100微克/毫升没食子酸 酯EGCG中配制而成，浸泡预定时间后，将剪下的胎盘小叶用手术剪剪碎，用生理盐水反复 冲洗血污，直至冲洗液接近无色。3. 如权利要求1所述的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特 征在于所述组织消化步骤包括：用15mmol/L三羟甲基氨基甲烷，加入哈特曼-D溶液，调节 pH至8. 0,作为消化缓冲液，加入终浓度为2. 4g/L HyQTase (购于HyClone公司）和300U/ mL DNase I组成的消化液，取消化液320mL，将冲洗后的胎盘组织分多次进行消化，每次在 37±0. 2°C、180r/min恒温气浴摇床消化2min，消化完毕后，无菌去除HyQTase溶液，用新生 牛血清终止消化反应，得到细胞悬液。4. 如权利要求1所述的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特 征在于所述增殖促进剂为凝结的脐带血液的液体成分。5. 如权利要求1所述的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特 征在于所述微重力环境是通过多轴旋转所形成的模拟微重力环境。
【专利摘要】本发明公开了人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，包括以下步骤：胎盘标本处理，得处理后的胎盘组织；组织消化，得到细胞悬液；不连续Percoll梯度密度分离，得到滋养细胞和胎盘间充质干细胞；滋养细胞的纯化；胎盘间充质干细胞的进一步分离与培养。本发明采用HyQTase和DNAse？I共同消化组织，经密度梯度分离获得大量的细胞纯度和活力都比较理想的滋养细胞和的胎盘间充质干细胞；且去除消化碎片、成纤维细胞和红细胞，并把滋养细胞和胎盘间充质干细胞区分开来，获得的细胞滋养细胞纯度可达90％，胎盘间充质干细胞用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加无血清培养基继续培养，纯度也很高。
【IPC分类】C12N5/073, C12N5/0775
【公开号】CN105087470
【申请号】CN201510484060
【发明人】何静
【申请人】何静
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年7月31日