APolymerase(全式金公司，中国），GatewayLRClonase enzymemix(Invitrogen公司，美国），质粒DNA提取试剂盒（Takara公司，日本）。本发明 实施例中的各序列合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
[0030] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指 南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件。
[0031] 实施例1小菜蛾T0R基因RNAi载体的构建
[0032] 一、小菜蛾T0R基因RNAi片段的获取及合成
[0033] 通过小菜蛾基因组数据库(http：//iae.fafu.edu.cn/DBM/)，找出小菜蛾TOR基 因的全长CDS序列：T0R1 :7140bp;T0R2 :6882bp。用小菜蛾TOR的CDS在NCBI中进行同源 比对，找出三段最保守的序列，融合三条序列。在融合的序列的5'端加上AscI-NotI酶 切位点，在3'端加上Sbfl-BbvCI酶切位点，将该序列命名为TOR-RNAi(658bp)，序列如序 列表SeqIDNo:1所示，合成该序列。
[0034] 二、小菜蛾T0R基因RNAi载体的构建
[0035] 按照如下步骤操作：
[0036] (1)合成如序列表SeqIDNo:2所示的序列，将该序列命名为35S-IN4,该序列包 含EcoRI、AsiSI、NotI、SbfI、BbvCI和AscI酶切位点（如下面序列所示，下划线字母 依次表示该6个酶切位点），该序列含有花椰菜病毒的启动子（P35S)、ACTIN的第四个内含 子（Intron4)和花椰菜病毒的终止子（T35S)序列。35S-IN4的序列为：
[0038] 用EcoRI对pCR8/GW/T0P0载体和35S-IN4序列进行单酶切，酶切体系为50μL 体系，如下所示：
[0039]
[0040] 37°C酶切3小时后，用胶回收试剂盒回收相应的片段。将回收的载体pCR8/GW/ Τ0Ρ0用去磷酸化试剂盒去磷酸化，防止自连。将酶切的35S-IN4片段和去磷酸化的载体 PCR8/GW/T0P0进行连接，连接体系为5μL体系，如下所示：
[0041 ]
[0042] 置于冰水混合物上过夜连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，菌液PCR鉴定阳 性克隆。用35SF(如序列表SeqIDNo:3所示）和Intron4R(如序列表SeqIDNo:4所 示）引物鉴定阳性克隆，PCR扩增的反应体系为50yL体系，包括5yL10X TaqBufTer、4yL2.5mMdNTPs、lyL7)丫⑨TaqDNAPolymerase、lyLΙΟμΜ35S F引物、lyLΙΟμΜIntron4R引物、lyL的菌液作为模板，用ddH20补足至50yL。PCR扩 增反应程序为：94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，40个循环；最 后72°C延伸10min。PCR扩增得到250bp左右的片段即为阳性克隆。获得含有35S-IN4的 载体，命名为P35S-IN4,其结构如图 1 所示。35SF:5' -ATGACGCACAATCCCACTATCCTTC-3'， Intron4R:5' -GTAAACCATTAGAGGAGTTGTC-3' 〇
[0043] (2)将前述合成的TOR-RNAi序列和载体p35S-IN4分别用内切酶NotI和Sbfl进 行酶切，酶切体系为50μL体系，如下所示：
[0044]
[0045] 37°C酶切3小时后，用胶回收试剂盒分别回收相应的片段。将回收的TOR-RNAi和 载体P35S-IN4进行连接，连接体系为5μL体系，如下所示：
[0046]
[0047] 置于冰水混合物上过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，用引物 TOR-RNAiF(如序列表SeqIDNo:5所示）和Intron4R鉴定菌液阳性克隆，TOR-RNAi F: 5 ' -GCTGGAAGATGTAGGTGATGG-3 '。
[0048] 鉴定阳性克隆的步骤方法与本步骤前述鉴定阳性克隆的步骤方法一样，只是 将相应的对象和引物置换即可。PCR扩增得到500bp左右的片段即为阳性克隆。得到 p35S-IN4+T0R-RNAi的载体，命名为p35S-T0RIN4。
[0049] (3)用质粒提取试剂盒提取p35S-T0RIN4质粒。再将合成的TOR-RNAi序列和 P35S-T0RIN4质粒用内切酶BbvCI和AscI进行酶切连接，酶切连接体系和方法同本步骤 前述酶切连接方法，只是相应的对象和内切酶不同。用引物Intron4F(如序列表SeqID No:6所示）和TOR-RNAiF鉴定阳性克隆，PCR扩增得到500bp左右的片段即为阳性克隆， Intron4F:5' -TTTGCTTCTTGTGGTTGATTA-3'，鉴定阳性克隆的步骤方法与本步骤前述鉴定阳 性克隆的步骤方法一样，只是将相应的对象和引物置换即可。获得p35S-T0RIN4+T0R-RNAi 的载体，命名为P35S-T0RRI，其构建过程示意图如图2所示，即为以pCR8/GW/T0P0载体为骨 架载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接的EcoRI酶切位点、AsiSI酶切位点、P35S启 动子、NotI酶切位点、SEQIDN0:1所示的序列、SbfI酶切位点、ACTIN的第四个内含子、 BbvCI酶切位点、SEQIDNO: 1所示的反向互补序列、AscI酶切位点、T35S终止子、EcoR I酶切位点，在PCR8/GW/T0P0中插入的这些片段连接起来的序列如序列表SeqIDN〇:7所 示，将该序列命名为35S-T0RRI。p35S-T0RRI载体中的TOR序列能够形成一个茎环结构，以 达到干扰小菜蛾T0R基因的目的。将构建的载体p35S-T0RRI进行酶切验证，一组酶切体系 为用内切酶AsiSI、AscI，另一组酶切体系为用内切酶BbvCI、AscI，酶切体系均为50yL 体系，如下所示：
[0050]
[0051 ] 37°C酶切3小时后，用1%的琼脂糖跑胶，结果如图3所示。图中1、2为p35S-T0RRI 载体用AsiSI和AscI酶切后的产物，大片段为3237bp，小片段为1976bp;图中3、4为P35S-T0RRI载体用BbvCI和AscI酶切后的产物，大片段为4555bp，小片段为658bp，同 时得到这4个大小片段的p35S-T0RRI载体即为构建成功的载体。酶切验证后将正确的 P35S-T0RRI载体送去测序，测序结果显示所得到的载体为正确的构建。
[0052] (4)再通过Gateway LR反应将p35S-T0RRI中插入的Seq ID No :7序列重组到植 物表达载体pEarleyGate 303上，LR反应体系为2. 5μL体系，如下所示：
[0053]
[0054] 在PCR仪中25°C反应3小时，反应产物转化DH5a感受态细胞。用35SF和 Intron4R引物鉴定阳性克隆，PCR扩增得到850bp左右的片段即为阳性克隆。得到 pEarleyGate303+35S-T0RRI的载体，命名为pE35S-T0RRI，其构建过程示意图如图4所示。 鉴定阳性克隆的步骤方法与前述步骤（3)中鉴定阳性克隆的步骤方法一样，只是将相应的 对象和引物置换，将循环程序中的72°C延伸时间改为50s即可。
[0055] 实施例2转基因拟南芥植株的获得
[0056] 按照如下步骤操作：
[0057] (1)将实施例1得到的PE35S-T0RRI载体转化农杆菌LBA4404菌株，转化步骤为： 1)在装有50μL农杆菌LBA4404菌株感受态细胞的离心管中加入pE35S-T0RRI载体质粒 DNA(用质粒DNA提取试剂盒提取得到，操作方法参考试剂盒说明书）5μL，轻轻混匀后冰浴 30min;2)放入液氮中lmin，然后立即放入37°C水浴锅中水浴5min;3)取出离心管，置于 冰上冰浴3min;4)在超净工作台中将离心管中冰浴后的液体加入500μLLB液体培养基， 28°C、200rpm振荡培养4h;5)取出菌液在含有利福平和卡那霉素各50mg/L的LB固体培养 基上涂板，待干后在28°C培养箱中倒置培养。2天左右菌落可见。
[0058] 挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28°C、220rpm振荡培养过 夜。用35S F(如序列表Seq ID No:6所示）和Intron4R引物