200mmol)和2-(吡啶-2-基）乙酸盐酸盐（34 · 7mg，· 200mmo 1)起 始。
[0317] 以与ER-898979相似的方法制备ER-898981 (25mg，0 · 067mmol，33 · 4%收率），其中 以ER-888840-2HC1 (68mg，0 · 200mmo 1)和2-( 1H-吡唑-1 -基）乙酸（25 · 2mg，· 200mmo 1)起始。
[0318] 以与ER-898979相似的方法制备ER-898982( 10mg，0 ·028mmol，13 · 9%收率），其中 以ER-888840-2HC1 (68mg，Ο · 200mmol)和1H-吡唑-4-甲酸（22 · 4mg，· 200mmol)起始。
[0319] 以与ER-898979相似的方法制备ER-898984(18mg，0 · 048mmo 1，24 · 4%收率），其中 以ER-888840-2HC1 (68mg，0 · 200mmol)和烟酸（25mg，· 200mmol)起始。
[0320] 以与ER-898979相似的方法制备ER-898985 (27mg，0 · 072mmo 1，36 · 1 % 收率），其中 以ER-888840-2HC1 (68mg，0 · 200mmol)和1-甲基-1H-咪唑-5-甲酸（25 · 2mg，· 200mmol)起始。
[0321] 以与ER-898979相似的方法制备ER-898986(45mg，0 · 120mmol，60 · 1 %收率），其中 以ER-888840-2HC1 (68mg，0 · 200mmol)和1-甲基-1H-吡唑-5-甲酸（25 · 2mg，· 200mmol)起始。
[0322] 以与ER-898979相似的方法制备ER-899350 ·HC1 (36mg，0 · 090mmol，30 · 5% 收率）， 其中以ER-888840-2HC1 (100mg，0.295mmol)和3-((叔丁氧基羰基）氨基)氧杂环丁烷-3-甲 酸(70.4mg, .324mmol)起始，如前述实例中所述的那样使用TFA对Boc基团进行去保护并形 成HC1盐。
[0323] ER-896760:向ER-888840-2HC1 (100mg，· 295mmol)在DCM( 1 · 0ml)中的经搅拌的溶 液添加 TEA(0.205ml，1.474mmol)，然后添加异丙基磺酰氯(0.050ml，. 442mmol)。将反应混 合物在室温搅拌2h，此后将完成的反应用DCM(lOmL)稀释，然后用饱和的NaHC03(5mL)和盐 水（5mL)洗涤。有机层用Na2S〇4干燥，过滤并浓缩，然后经硅胶（Biotage SP4 . Column Interchim 25g，庚烷中的30μΜ 6%-50%Et0Ac)纯化，在将所需产物部分浓缩、在真空中浓 缩和干燥之后，获得白色固体的ER-898760(3.7mg，9.93μπιο 1，3.37 %收率）。
[0324] 以与ER-898760相似的方法制备ER-899672 · HCL(25mg，0 · 055mmol，37 · 6 % 收率）， 其中以ER-888840-2HCl(50mg，0.147mmol)和3-(二甲基氨基）丙烷-1-磺酰氯盐酸盐 (65.5mg，.295mm 〇l)开始。以与其它实例中所描述的相似方式制备盐酸盐。
[0325] ER-899669-HC1:向ER-888840-2HC1(200mg，·59mmol)在DCM(2·0ml，31·083mmol) 中的经搅拌的溶液添加 ΤΕΑ(0.41 lml，2.948mmol)，然后添加2-(1，3-二氧代异吲哚啉-2-基）乙烷磺酰氯(323mg，1.179mmol)。将反应混合物在室温搅拌2h，此后将完成的反应用DCM (5mL)稀释，用饱和的NaHC03 (2mL)和盐水(2mL)洗涤。有机层经Na2S〇4干燥，过滤并浓缩，然 后经硅胶（Biotage SP4.Column BiotageSNAP Ultra 50g，30yM.12%-100%Et0Ac/庚烷） 纯化。将所需部分在真空下浓缩并干燥以获得N-((3R，5S)-1-(8-氰基喹啉-5-基)-5-甲基 哌啶-3-基)-2-(1，3-二氧代异吲哚啉-2-基）乙烷磺酰胺(26611^，0.528臟〇1，90%收率）。
[0326] 将^((31?，53)-1-(8-氰基喹啉-5-基)-5-甲基哌啶-3-基)-2-(1，3-二氧代异吲哚 啉-2-基）乙烷磺酰胺（100mg，. 199mmol)添加至含一水合肼（0.096mL，1.986mmol)的THF (2.00mL)。将反应混合物在室温搅拌过夜，此后将完成的反应通过Celite 545垫过滤并且 用THF(5mL)冲洗。将粗产物经硅胶（Biotage SP4.Column Biotage SNAP Ultra 25g，30y M. 1 % -40 % MeOH/DCM)纯化，并且将所需的部分合并，在真空中浓缩并干燥以提供黄色固体 的ER-899669 (52mg，0 · 139mmol，70 · 1 % 收率）。
[0327] 将ER-899669(52mg，0.139mmol)溶于 1,4-二噁烷（2.0ml)，并且用含4.00M HC1 的 二噁烷（0.037mL)在室温下处理30min。用甲苯（2mL)稀释混合物并浓缩。将产物与甲苯 (2mL)共沸。在真空栗上干燥产物以获得橙色固体的ER-899669-HCl(57mg，0.139mmol， 100.0%收率)。
[0328] ER-899671-HC1:将ER-899669(50mg, · 134mmol)和37% 甲醛水溶液（109mg, 1.339mmol)在甲酸(0.11111，2.607臟〇1)中的溶液在80°(：搅拌811。将完成的反应与甲苯(每次 2mL)共沸两次。将残余物溶于MeOH(5mL)，然后添加 Amberlite IRA400氢氧化物形式，搅拌 lOmin直到获得中性pH。过滤Amber 1 ite，用MeOH冲洗，并将滤液浓缩，然后与甲苯(2mL)共沸 两次至干燥。将残余物经硅胶（Biotage SP4.Column Biotage SNAP Ultra 25g，30yM.l%_ 40%Me0H/DCM)纯化，并且将所需的部分合并，在真空中浓缩并干燥以提供ER-899671 (28mg，0 · 070mmol，52 · 1 % 收率）。
[0329] 将ER-899671 (28mg，0 · 070mmo 1)溶于 1，4-二噁烷（2 · 0ml)，并且用含4 · 0M HC1 的二 噁烷(0.017mL，.066mmol)在室温下处理30min。将混合物与甲苯(每次2mL)共沸三次。在真 空中干燥产物以获得橙色固体的ER-899671-HC1 (30mg，0.068mmo 1，100 %收率）。
[0330] 其它实例：
[0331 ] ER-889591:将ER-888840 (15mg，0 · 056mmo 1)、甲酸（0 · 0 · 64mL，mmo 1)和37 % 甲醛水 溶液(〇.〇42mL，mmol)合并，并在80°C下微波8h，此后将冷却的反应浓缩。将粗产物在MeOH (2mL)中稀释并且经C-18反相HPLC(用含有0.1%TFA的10%-100%乙腈水溶液洗脱)纯化。 将所需部分浓缩，溶于MeOH(lml)并经过碱性硅胶柱(Biotage Isolute SPE，lg SiC〇3,用 MeOH洗脱），然后在真空中浓缩并干燥以提供ER-889591 (2. lmg，0.007mmo 1，12.7 %收率）。
[0332] ER-895386:在0°C下向（R)-(l，5-二羟基-4,4-二甲基戊-2-基）氨基甲酸叔丁酯 (636mg，2 · 571_〇1)和TEA( 1 · 434mL，10 · 286mmol)在 Et0Ac( 10mL)中的溶液逐滴添加甲磺酰 氯(0.421mL，5.40mmol)，此后将混合物在0°C搅拌2h。用NaHC0 3水溶液(5mL)淬灭反应，将层 分离并用EtOAc(每次5mL)对水层萃取三次。将合并的EtOAc层用水（5mL)洗涤，经MgS〇4干 燥，过滤并浓缩至干燥。产物为(R)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2,2-二甲基戊烷-1,5-二基 二甲磺酸酯（1.018,2.503111111 〇1，97%收率），其不需纯化而进行使用。
[0333] 将苄胺（0.819ml，7.50mmol)升温至50°C，然后在15min内逐滴添加（R)-4-((叔丁 氧基羰基）氨基）-2,2-二甲基戊烷-1，5_二基二甲磺酸酯（1.009 8,2.50111111〇1)在01^ (1.501111，14.431111111〇1)中的溶液。在完成添加之后，将混合物在50°(：搅拌2011。将完成的反应 冷却至室温并用饱和的NaHC0 3(10mL)和EtOAc(lOmL)稀释，然后剧烈搅拌lOmin。将所得的 混合物中的有机部分用盐水（5mL)洗涤，经MgS(k干燥，过滤并浓缩。将残余物经过硅胶 (Biotage，用含0至10%Et0Ac的庚烷洗脱)纯化，在将所需部分合并、在真空中浓缩和干燥 之后，提供（R)-(l-苄基-5,5-二甲基哌啶-3-基）氨基甲酸叔丁酯（50〇11^，1.57〇111111 〇1， 62.8%% 收率）。
[0334] 将（（3R，5S)-1-苄基-5-甲基哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯（500mg，1.642mmol)溶于 乙醇（50ml，856 · 335mmol)，并且在45°C和50bar下，使用5%Pd/C介质催化剂（catcart)与H2 气体在H-Cube上进行氢化，溶液流速为lmL/min，持续7h。将溶液浓缩以提供白色粉末的 ((31?，55)-5-甲基哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯（35〇11^，1.633111111 〇1，99.5%收率），并且不需 进一步纯化而进行使用。
[0335] 向（（3R，5S)-5-甲基哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯（890mg，4.153mmol)和5-溴喹啉-8-甲腈（1452mg，6·229mmol)在DMAC(14mL)中的经搅拌的溶液添加 DIPEA(2·176mL， 12.459mmo 1)，然后密封并加热至110 °C，同时搅拌48h。将完成的反应冷却至室温，用水 (20mL)稀释，然后用E tOAc (每次1 OmL)萃取三次。将合并的有机层用水（1 OmL)和盐水（1 OmL) 洗涤，经MgS〇4干燥，过滤并浓缩至干燥。将粗产物经过硅胶（Biotage，SP4，用含0至10 % EtOAc的庚烷洗脱)纯化，在将所需部分合并、在真空中浓缩和干燥之后，提供（（3R，5S)-1- (8-氰基喹啉-5-基)-5-甲基哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(81711^，2.229111111〇1，53.7%收率）。
[0336] 用含4M HC1 的二噁烷(2ml，8.00mmol)处理(R)-(l-(8-氰基喹啉-5-基)-5,5-二甲 基哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(70mg，. 184mmol)，并且在室温下搅拌lh。将完成的反应在真 空中浓缩并干燥，不需进一步纯化，提供作为二盐酸盐的ER-895386(51.6mg，0.184mmol， 100%收率)。
[0337] ER-897810:向（（3R，5S)-1-(8-氰基喹啉-5-基)-5-甲基哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁 酯54(75mg，0.205mmol)在乙醇（4.5ml)中的经搅拌的溶液添加0.5M氢氧化钠（4.503mL, 2.251mmol)，然后添加60%过氧化氢水溶液(0.233mL, 2.281mmol)。将反应混合物升温至50 °C，并且然后搅拌4h。将完成的反应冷却至室温，然后添加5%硫代硫酸钠水溶液（lmL)，搅 拌5min，并且添加 IN HC1至pH 7-8。将混合物浓缩至50%体积，然后用DCM(每次5mL)萃取三 次。将合并的有机层用水（5mL)洗涤，经MgS0 4干燥，过滤并浓缩至干燥。将粗产物经硅胶 (l〇g，用含0_60%Et0Ac的庚烷洗脱)纯化，在将所需部分收集、在真空中浓缩并干燥之后， 提供（（3R，5S)-1-(8-氨基甲酰基喹啉-5-基)-5-甲基哌啶-3-基）氨基甲酸叔丁酯（57mg， 0.148謹〇1，72.4%收率）。
[0338] 向（（3R，5S)-1_(8-氨基甲酰基喹啉-5-基）-5_甲基哌啶-3-基）氨基甲酸叔丁酯 (57mg,. 148mmol)在DCM(5mL)中的经搅拌的溶液添加 TFA(0.5ml，6.49mmol)，此后将混合物 在室温下搅拌lh。将完成的反应浓缩，然后溶于Me0H(2mL)并用0.5g碳酸氢盐树脂处理。在 室温下搅拌30min之后，将悬浮液过滤，用MeOH( lmL)洗涤两次，并且将合并的滤液浓缩为淡 黄色固体。将该固体溶于EtOAc(lmL)，用含4MHC1的二噁烷(0.029mL，0.115mmo 1)处理，搅拌 15min。通过过滤收集所得的固体，并且在真空中干燥以提供ER-897810-HCl(37mg， 0.115mmol，78% 收率）。
[0339] 一般筛选测定和药理学策略
[0340]为了鉴定有效的和选择性的TLR7/8化合物，故对全部人TLR4、TLR7和TLR9报告物 系的基于细胞的组进行初始筛选(更多细节参见"材料与方法"）。在原代人PBMC测定中，还 测试了对TLR7有效和选择性的至少一种化合物对TLR8的活性(见以下表2)和对TLR7/8的效 能(更多细节参见"材料与方法"）。将某些化合物推进入短期体内（STIV)测定以测定对小鼠 TLR7的剂量依赖性活性和作用持续时间（更多细节参见"材料与方法"）。然后评估所选择的 化合物对以下小鼠狼疮疾病模型BXSB-Yaa、NZBxNZW和Pr i s tane: DBA/1中的一种或多种的 影响。
[0341] 当在细胞系或原代细胞上表达的这些受体受到合成的小分子(CL097，R848)或核 酸(RNA)配体刺激时，本文中的实施方案报道的许多化合物显示了对人TLR7和小鼠 TLR7及 人TLR8的纳摩尔效能。相反地，本文的实施方案中所报道的大多数化合物对TLR9途径是无 活性的。
[0342] 目前，狼疮S0C药物包括诸如氯喹和羟氯喹(HCQ)的抗疟药物，其已经显示可在体 内抑制TLR7/9活性。这可以至少部分地解释这些药物在控制狼疮突发中的有效性。然而，本 公开内容的实施方案已经显示出提供更显著有效的抑制。这通过以下表1中显示的结果得 以证实。
[0343] 表1.化合物ER-888840相对于轻氯喹(Plaquenil)的效能和选择性。
[0344]
L0346」表2.在HEK-293测定形式中所选化合物对人TLR8的效能（史多细节参见"材料与方 法"）。
[0347]
[0348] 短期体内（STIV)测定：为了在体内评估化合物对于小鼠 TLR7的效能，利用了短期 体内（STIV)测定。简而言之，将化合物口服给药于小鼠，然后小鼠在各个时间点皮下注射激 动剂R848以刺激TLR7。然后在R848刺激之后，通过ELI SA检测了血浆IL-6水平以评估化合物 效能和作用持续时间。重要的是，利用TLR7缺失的小鼠，在用R848进行体外或体内刺激之 后，细胞因子的产生显示出完全为TLR7依赖性的。因此，可以确信化合物在STIV测定中的活 性归因于对TLR7途径的调节。在以下表3中示出了 一组化合物的STIV测定效能的汇总。
[0349] 表3.所选化合物的短期体内（STIV)测定数据的汇总。
[0350]
[0351]
[0352] 小鼠狠抢佚柄悮型。选徉网柙个冋的狠抢佚柄悮型（NZB/W和婼i又烷）用t化甘物 P0C评估，因为（1)NZB/W品系发展为具有多基因病因学的自发性疾病，显示出人狼疮的许多 标志，例如DNA相关的自身反应性、蛋白尿和免疫复合物介导的肾炎，以及(2)已经报道了对 于两种疾病模型的阳性TLR7和/或TLR9靶标确认结果。
[0353] 在SLE疾病模型中对于ER-888840的关键发现如下（参见图6和图7):
[0354] l)ER-888840在姥鲛烷模型中抑制多种自身抗体特异性。ER-888840还剂量依赖性 地显著降低了干扰素调节的基因在姥鲛烷诱导的患病动物中的表达，正如在干扰素评分中 所体现的。
[0355] 结果汇总:这些数据显示了所述化合物对在人狼疮的重要方面中所涉及的过程的 调节作用。包含核酸的免疫复合物可以通过树突状细胞驱使1型干扰素产生，并且反映干扰 素的存在和干扰素调苄基因的后续表达的"干扰素信号"与疾病的严重程度有关。在姥鲛烷 模型中ER-888840抑制干扰素驱动的基因的上调。ER-888840限制若干自身抗体特异性的产 生。结果表明这些化合物具有控制狼疮症状和在人类患者中进展的潜力。
[0356] 药理学材料与方法：
[0357] 体外药理学：
[0358] 将HEK-293细胞(ATCC)设计成稳定表达NF-kappaB转录因子可诱导的E-选择素 (ELAM-1)荧光素酶报告物，所述荧光素酶报告物来源于包含来自人E-选择素基因（登记号 NM_000450)的启动子的碱基对-2241bp至-254bp的质粒pGL3(Promega)。随后将这些细胞设 计成稳定地并分别地表达人TLR4、TLR7或TLR9全长ORF cDNAs。将人TLR4cDNA(登记号NM_ 138554)克隆至pcDNA 3.0表达载体（Invitrogen)中。还将TLR4转染的细胞设计成表达人 MD-2共受体[将MD-2cDNA(登记号NM_015364)克隆至pEF-BOS载体]，并且在培养基中补充 10nM可溶的CD14(R&D Systems)以使LPS响应性最优化。将人TLR9cDNA(登记号NM_017442) 克隆至pBluescript II KS载体（Agilent)中。从OriGene获得人TLR7cDNA(登记号匪_ 016562)。稳定表达人TLR8(登记号NM_138636)或小鼠 TLR7(登记号NM_133211)的HEK-293细 胞购自于InvivoGen，并且然后用口附？丨72(册-1?^^313)-焚光素酶报告物质粒（111￥；^〇6611) 稳定转染。将在包含10%胎牛血清(FBS)的Dulb ecCO改良Eagle培养基(DMEM)中密度为2.22 X 1〇5个细胞/ml的各个细胞类型接种至384孔板中，并且在37°C、5%⑶2下孵育2天。然后添 加不同浓度的拮抗剂化合物。然后将细胞再孵育30分钟，之后添加以下适当的TLR激动剂 (显示为最终浓度）：10ng/ml的脂多糖(LPS; Sigma)用于TLR4、3μg/ml的CL097(InvivoGen) 用于人TLR7和人TLR8以及小鼠 TLR7、以及0·6μΜ的CpG-2006-2A[序列： TCGTCGTTAAGTCGTTAAGTCGTT(SEQ ID NO: 1)，具有硫代磷酸酯骨架，由Sigma-Aldrich合成] 用于TLR9。然后将细胞孵育过夜，并且按照制造商建议的方案通过用SteadyG丨 (Promega)或Steadylite?(Perkin Elmer)试剂测量发光对NF-kappaB依赖性焚光素酶报告 物活化进行定量。
[0359] 基于人PBMC细胞的测定。从新鲜抽取的肝素化（10USP单元/ml，Hospira， LakeforestJL)的健康供体的全血中通过密度梯度分离人外周血单核细胞（PBMC)( Histopaque? 1077，Sigma，Inc.，St. Louis，M0)。简而言之，将25ml血液在50ml圆锥管中用 15ml PBS(不含Ca2+、Mg2+)稀释，并且使用脊椎穿刺针将12ml Histopaque置于下面。将管以 1200rpm( 350xg)离心45分钟，并且从血沉棕黄层收集PBMC。然后将细胞在roS中洗涤两次， 并且使红细胞在室温下通过在5ml氯化铵溶液（IX红细胞裂解缓冲液，eBioscience)中悬浮 5分钟而裂解。在PBS中最终洗涤之后，将PBMC以最终浓度2X10 6/ml重悬浮于具有L-谷氨酰 胺（Invitrogen)的RPMI-1640培养基中，并且补充25mM HEPES(Mediatech，Inc，Manassas VA)、10%胎牛血清(办(：1〇1^，1^&11，1]1')和青霉素-链霉素-谷氨酰胺(1^(^仏吐），并且以 100μΙ/孔(2 X 105个细胞/孔)接种于组织培养物处理过的96孔板(Falcon)中。
[0360]将溶解和连续稀释于100 %DMS0中的拮抗剂化合物以一式三份添加至细胞以获得 0. l%DMS0(v/v)的最终浓度。将溶解和连续稀释于PBS中的轻氯喹(Acros Organics)以一 式三份添加至细胞。将PBMC与拮抗剂化合物或HCQ在37°C、5%⑶2下孵育30分钟，之后以每 孔100μ1完全培养基添加以下各种TLR激动剂试剂(显示为最终浓度）中：ΙμΜ的R848(瑞喹莫 德；GLSynthesis，Worcester，ΜΑ)用于TLR7 和 TLR8，50ng/ml 的 Pam3CSK4( InvivoGen)用于 TLRl/2，10ng/ml的LPS(Sigma)用于TLR4,以及5μg/ml的CpG-2216(InvivoGen)用于TLR9。为 了制备模拟狼疮患者中包含RNA的自身抗体免疫复合物的TLR7/8激动剂，合成具有来自人 UlsnRNA茎环IV[(序列：GGGGGACUGCGU-UCGCGCUUUCCC(SEQ ID N0:2)，具有硫代磷酸酯骨 架]的序列的26-mer RNA(Dharmacon, Inc.，Lafayette，C0)，其在之前已显示为有效的TLR7 和TLR8激动剂。将这种RNA分子在无血清的RPMI中稀释至2.5μΜ，并且以1:25稀释或lμg/ml 添加的小鼠抗人单链0嫩单克隆抗体(]\^83034，]^11丨？〇代，111(3.，8丨1164〇3，]\^)，其还与 RNA交叉反应。在被添加至细胞之前，将产生的"RNA-Ig"刺激物在室温下孵育15-30分钟。将 PBMC与各种TLR激动剂在37 °C、5 %⑶2下孵育20小时。收集细胞培养上清液，并且根据制造 商(BD Biosciences,Inc.，San Diego,CA)建议的方案通过标准ELISA程序所示来评估各种 人细胞因子的水平。在表4中显示了结果。
[0361]表4-所选化合物的PBMC测定数据的汇总
[0362]
[
[0364] 基于小鼠脾细胞的测定。从通过C〇2安乐死的雌性BALB/c小鼠 （Jackson Labs，Bar Harbor，ME)获得脾脏。通过将脾脏经过40μπι尼龙细胞过滤器而获得单细胞悬浮液。用50ml PBS(Mediatech，Inc.，Manassas，VA)对细胞洗涤两次，并且将红细胞在5ml RBC裂解缓冲液 中裂解，在室温下保持5分钟。将细胞在roS中再洗涤两次，并且最终以2.5 X106个细胞/ml 重悬浮于补充的RPMI-1640中。将细胞以100μΙ/孔(2.5 X 105个细胞/孔)接种于组织培养物 处理过的96孔板中（Falcon)。将溶于100%DMS0中的连续稀释的化合物以一式三份添加至 细胞，以获得〇. 1 %DMS0的最终浓度。将细胞用化合物在37 °C、5 %⑶2下孵育30分钟，然后添 加 100μΙ/孔的在完全培养基中的740nM R848(瑞喹莫德;GLSynthesis，Worcester，MA)至最 终浓度为370nM R848。使细胞在37°C、5%⑶2下孵育20小时。收集培养上清液，根据制造商 (BD Biosciences，Inc.，San Diego，CA)建议的方案通过标准ELISA方法评估IL-6的水平。
[0365] 体内药理学：
[0366] 短期体内（STIV)测定：通过灌胃口服200ul体积的在0.5 %甲基纤维素水溶液 (Sigma，St. Loui s，M0)中配制的拮抗剂化合物对六周龄至八周龄的雌性BALB/c小鼠 (Jackson Labs，Bar Harbor，ME)给药。在之后的各时间点，向小鼠皮下（s. c.)注射100μΙ体 积的15yg R848(瑞喹莫德;GLSynthesis，Worcester，ΜΑ)以刺激TLR7。通过心脏穿刺收集血 浆，然后根据制造商（R&D Systems)建议的方案通过标准ELISA方法评估在TLR7刺激之后 1.5小时的IL-6的水平。
[0367] 小鼠狼疮疾病模型品系。从Jackson Labs (Bar Harbor，ME)购买雄性BXSB-Yaa小 鼠和雌性NZBWF1/J小鼠，两者都显示具有自发性狼疮疾病。从Harlan Laboratories (Indianapo 1 is，IN)购买雌性DBA/1小鼠，并且在指定鼠龄给予腹膜内注射0.5ml姥鲛烷(2， 6，10，14-四甲基十五烷；Sigma，St. Louis，M0)以化学诱导狼疮疾病，或腹膜内注射0.5ml PBS以产生鼠龄一致的未患病的对照小鼠。
[0368] 通过ELISA评估自身抗体滴度。通过标准ELISA方法评估抗-dsDNA滴度、抗-Sm/ nRNP滴度、抗-RiboP滴度和抗组蛋白滴度。简而言之，用100μΙ如下的含稀释的抗原的PBS (显示最终浓度)对96孔EIA/RIA ELISA板(Corning)进行涂覆，在室温下保持90分钟：10U/ ml Sm/nRNP复合物（Immunovision)、10μg/ml小牛胸腺dsDNA( Sigma)、5U/ml RiboP (Immunovision)和5μg/ml组蛋白（Immunovision)。将板用PBS/0 · 05%Tween20(洗涤缓冲 液)进行洗涤，并且用PBS/1%BSA(封闭缓冲液)在4°C封闭过夜。对板进行洗涤，将在封闭缓 冲液中稀释的小鼠血浆样品(根据模型和抗原，以1:25-1:10，000进行稀释）以每孔100μΙ体 积添加至孔，并且