[0039] 8:0乂-811畑1?/胖1'和(^-811畑1?/]\〇转基因后代？〇?鉴定图
[0040] 泳道M为DL2000的核酸Marker;泳道1，2为OX-BnRDR阳性质粒；泳道3-10为OX-化畑R/WT转基因阳性植株;泳道11-18为OX-BnRDR/MI转基因阳性植株;泳道19为野生型拟 南芥。
[0041] 图5为一种转基因后代花蕾中RDR基因表达水平图
[0042] A图：RNAi-At畑R转化干扰转基因MI后代中畑R基因表达水平。
[0043] B图：过表达OX后代中畑R基因表达水平。
【具体实施方式】
[0044] 根据W下实施例，可W更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本 发明，而不是对本发明的限制。本发明所用试剂如未特别说明，均来源于商业渠道，所述技 术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。
[0045] 实施例1:
[0046] 甘蓝型油菜化畑R基因的获得：
[0047] W甘蓝型油菜（Brassica napus L.)中双九号的cDNA为模板，针对化RDR序列的 ORF 区域设计引物：Bn 畑 RS: ATGGACCGACCAGCTGACGGA 和化畑 RA: TTAGAAGGAAGTAAACCGG，进行 扩增。扩增产物大小为1605bp(图1)，PCR反应程序为94°C5分钟，94°C 1分钟，60°C 1分钟，72 °C2分钟，33个循环，72°C10分钟，16°C3小时。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回 收试剂盒纯化回收后，连接到PMD18-T载体，热激法转化gold菌株的感受态细胞，涂布于含 有氨节青霉素50yg/mL的LB固体培养基平板上，37 °C培养过夜，挑选白斑6个。采用M13引物 (5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3'和5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3')做菌落PCR检测。扩增大小为 2284bp，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小。将PCR检测大小正确的菌斑接种到含氨节青 霉素50iig/mL的液体LB培养基，37 °C下20化/min振荡培养过夜，小量碱法提取质粒，1.0 %琼 脂糖凝胶电泳检测质粒DNA大小正确后，采用KpnIAba I酶对质粒进行双酶切，1.0%琼脂 糖凝胶电泳检巧U。将检测正确的阳性重组克隆命名为PMD18-化畑R，将pMDlS-BnRDR送上海 英驗公司进行测序，分析结果显示，获得了一种分离的油菜RDR基因CDS全长，其序列为SEQ ID NO: 1所示核巧酸序列，编码SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列。BLAST发现油菜RDR与AtRDR CDS核巧酸同源性大于80%，氨基酸同源性达到87%，油菜畑R基因是At畑R(拟南芥RDR)的 同源基因。
[004引实施例2:
[0049] 畑R基因在控制植株开花时间中的应用：
[0050] 1、At畑R基因人工微RNA干扰植物表达载体RNAi-At畑R的构建
[(K)引]为了研究本发明中RDR基因的功能，采用了amiRNAi(artificial microRNA interference，人工微RNA干扰，W下相同）技术。由于油菜RDR和拟南芥的RDR具有相似的基 因结构、保守VIT结构域、跨膜结构W及85% W上的蛋白同源性，推测两者具有相同的功能， 因此油菜化RDR的功能是通过研究拟南芥AtRDR的功能获得的。人工微RNA干扰载体的构建 原理如图2中A所示（Schwab R.,Ossowski S.,Riester M.,et al.Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis.Plant Cell,2006,18(5): 1121-1133)。选取的祀序列为4优01?基因中特异的一段序列:441'1]1'17^141'1]17161'1]646,569 10^: 3所示RNA序列。在此方法基础上化n等发明提出了一种快速高效的植物人工微RNA表达载体 的构建方法（Yan H. ,Den 邑 X.,et al.A novel approach for the construction of plant amiRNA expression vectors. Journal of Biotechnology ,2011,151:9-14)，参照 上述文献报道方法完成了本实验中人工微RNA干扰载体RNAi-AtRDR的构建。
[0052]通过冻融法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第= 版)科学出版社，W下相同）将含有上述获得的RNAi-AtRDR载体的质粒转化农杆菌EHAl05: [0化3] 步骤如下：
[0054] 1:取0.2ml感受态农杆菌，于冰中缓慢融化。
[0055] 2:加入约化g重组质粒DNA，轻轻混匀，冰浴SOmin后，投入液氮速冻Imin，然后37 °C 水浴5min，融化细胞。
[0化6] 3:加入80化1不含抗生素LB液体培养基，28 r轻摇培养4-化。
[0化7] 4:1200化pm，30s，去上清，细胞重悬于0.2ml LB液体培养基培养基。
[0化引5:将培养物均匀涂布在含Rif (利福平，50mg/L)和Str (链霉素，50mg/L)的LB固体 培养基琼脂板上，28 °C培养2天，待平板上出现转化子后挑菌，W BarF: 5 / -TTTCGGTGACGGGCAGGAC-3'和BarR: 5' -CTGCACCATCGTCAACCAC-3'为引物进行菌落PCR检测。 检测方法如下:是用灭菌的牙签挑取少量菌斑做模板，反应体系为IOyl内含:模板DNA模板1 化（约 100ng)，10Xl'aq buffer(含MgCl 2)化l，1.5mmol/L dNTP(10mmol/LH山，5'引物（10 皿01/L)0.扣1，3'引物（10皿01/L)0.5山，Taq巧UAU)0.扣1，dd肥0 5.扣1。反应条件为94°C 5分钟，94°C30秒，55°C80秒，72°C1分钟，32个循环，72°(：10分钟，扩增大小为102869。将 RNAi-At畑R转入根癌农杆菌EHA105，用利福平巧化g/mU抗性平板筛选，挑取菌斑，菌落PCR 检测验证。
[0059] 2、RNAi -At畑R在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选：
[0060] 采用花序侵染法进行拟南芥转化。制备含有重组载体RNAi-AtRDR的根癌农杆菌 EHA105菌液，在转化前一天转入含有利福平50iig/ml的LB液体培养基中，28 °C过夜培养。第 二天，用紫外分光光度计于276nm纳米波长下检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值达到在 1.6-2.0之间时取出。室溫下W4000g离屯、IOmin，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5 %薦糖溶液 中。将浑浊的薦糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0.02% (体积比）的Silwet 1-77。混匀后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在薦糖中，默数15秒，取出植株。转化 后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋掲开，放在光强的地方 培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5 天。
[0061 ]将转化收获的TO代种子播在混有PNS营养液的赔石中。转移到溫度20-25°C，光照 强度5000-10000流明，光周期为16小时光照/8小时黑暗，空气湿度大于80% W上的培养间 中，正常管理。根据表达载体上特有的草胺憐(Bar)抗性筛选阳性植株。拟南芥长出一片真 叶后，喷洒30ppm的除草剂Basta。一星期后，喷洒50ppm的Basta,获得拟南芥转基因阳性苗。 筛选得到的转化植株，称Tl代转化植株。叶片长到足够大小时(3-4叶期），取少许绿苗叶片， 提取DNA，进行转化材料的PCR阳性检测。所用引物为BarF和BarR，反应体系为IOiil。反应条 件为94 °C 5分钟，94 °C 30秒，55 °C80秒，72 °C 1分钟，32个循环，72 °C 10分钟，扩增大小为 1028bp。用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明（图3)，RDR基因人工微RNA干扰植物表达载 体RNAi-AtRDR已经成功转入拟南芥，共获得了11株转基因阳性植株，分别命名为MI-I，MI-2 等。
[0062] 3、At畑R基因过表达植物表达载体OX-At畑R的构建和转化、筛选
[0063] 在生长间收集拟南芥花蕾，投入液氮速冻后按照Trirol提取试剂盒要求提取RNA， W获得的RNA为模板，根据Promega公司逆转录酶的说明进行逆转录，得到的CDNA分装后于-80°C保存备用。W拟南芥花蕾CDNA为模板进行At畑R基因（A巧g24290)cDNA片段的PCR扩增。 所用引物为AtRDRF : CGCggatcc-ATGGAAAAGTCAAACCAACCAGTT和AtRDRR: ACAtctaga-AAAGGAAGTAAACCGGCACTCCTC。引物序列的5^末端分别引入了BamHI和XbalI限制性内切酶位 点。PCR反应体系为25化。PCR反应程序如下：94°C5min;94°C30sec，55°C45sec，72°Clmin，35 个循环;72 °C延伸Smin。扩增片段大小为1668bp。PCR产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检:J则。完 成后用凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段，获得AtRDR基因CDNA全长片段。
[0064] 用获得的AtRDR基因CDNA全长片段替换pBim植物表达载体中的GUS基因序列（图 2中B)，获得AtRDR基因的植物过表达载体OX-AtRDR。
[0065] 为完成此目的，首先用BamHI/SacI双酶切At畑R基因cDNA片段，同时用BamHI/SacI 酶切地1121质粒的GUS片段。酶切体系为IOiil，酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时 之后，用1 % (质量体积比）琼脂糖胶电泳检测。
[0066] 将AtRDR基因CDNA片段的酶切产物和克隆载体pBI 121上切下的大片段用DNA凝胶 回收试剂盒回收。按AtRDR基因CDNA片段的酶切产物比PBI121载体片段（ISOngAtRDR基因 CDNA片段:5化g载体片段）=3:1的比例(摩尔浓度比）混合样品，加入T4DNA连接酶5单位，10 X反应缓冲液，无菌水补充体积至20化，16°C连接过夜。转化后，在含有卡那霉素固体LB平 板上筛选，挑斑后 Wnpt n F和NPT n R引物(NPT n F: 5' -GATGGATTGCACGCAGGT-3'和NPT n R: 5^ -TCAGAAGAACTCGTCAAG-3/ )进行菌落PCR检巧U。反应条件为94 °C 5分钟，94°C 1 分钟，55 °C 30 秒，72 °C 2分钟30秒，33个循环，72 °C 10分钟，扩增大小为80化P，1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测 大小正确后，选择阳性菌株提质粒，酶切验证正确的重组质粒命名为OX-AtRDR。然后利用冻 融法将OX-AtRDR转入根癌农杆菌EHA105,卡那霉素巧化g/mU和利福平巧化g/mU双抗性平 板筛选，挑斑，进行菌落PCR检测验证。
[0067] 采用花序侵染法进行将获得的OX-AtRDR质粒转化野生型拟南芥。将转化收获的TO 代种子用70% (体积比）酒精和0.01% (体积比）的升隶表面消毒10分钟后用蒸馈水洗涂数 次巧~7次），然后均匀地吹打到MS固体筛选培养基表面。4