专利名称：含芳基硼酸香豆素类化合物及其在糖检测中的应用的制作方法
含芳基硼酸香豆素类化合物及其在糖检测中的应用
技术领域：
本发明涉及糖检测技术领域，具体地说，是一种含芳基硼酸香豆素类化合物及其在糖检测中的应用。
背景技术：
哺乳动物细胞表面的糖主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。这些糖基化的生物分子与许多生理和病理过程密切相关，如细胞间的信息交流、胚胎早期发育、细胞凋亡、炎症反应以及某些癌症转移等。通过在细胞上标记对糖类化合物有特异性响应的探针分子可以帮助研究上述生理或病理过程。硼酸因可与单糖分子中的二醇发生特异性共价键合常被用作糖识别单元。利用硼酸共价键合不同的发色团对糖进行特异性识别的荧光探针已诸见报道，但已有探针的发射波长大多较短，限制了它们在生物试样中的应用，因此发展具有长发射波长、高灵敏的糖探针具有较高的应用价值。香豆素因其荧光量子产率高、稳定性好、Stokes位移较大，是荧光探针分子设计时常用的发色团。如果扩大该荧光团的共轭体系、增加分子的电子推-拉作用，可以使得最大吸收和发射波长红移，基于此本发明设计了新型的香豆素类荧光分子探针，通过将α，β-不饱和酮共轭连接在香豆素分子上以延长共轭体系，分子上吸电子的乙烯基酮基和给 电子的N，N-二乙基氨基组成的电子推拉体系也有利于发射和激发波长的红移。将苯硼酸通过共价键连接至发色团上作为糖分子受体，与糖结合后探针分子的电子和能量状态的改变将导致其光谱性质的变化，从而实现对糖类化合物的检测。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含芳基硼酸香豆素类化合物及其在糖检测中的应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种含芳基硼酸香豆素类化合物，其结构通式
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O式中R为N，N- 二烷基氨基、羟基或者烷氧基。一种含芳基硼酸香豆素类化合物的合成方法，其具体步骤为(1)4-溴苯乙酮，双(频哪醇合)二硼，醋酸钾以及1，Γ -双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和溶剂加入到反应器中，其中，4-溴苯乙酮与双(频哪醇合)二硼的摩尔比为1.0 : I. O 1.8 ;4_溴苯乙酮与醋酸钾的摩尔比为1.0 2.0 3.0;[1，1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯与4-溴苯乙酮的摩尔量之比为I 3 100 ;4_溴苯乙酮，双(频哪醇合)二硼，醋酸钾以及I，r -双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯的混合物与溶剂的固液比为I : 3 5(g/mL);加热回流，TLC点板跟踪反应至原料消失；除去溶剂，硅胶柱提纯，得淡黄色粘稠状产物1，产率92. 5% ；所述的溶剂为二氧六环；(2)4_R基取代水杨醛，丙二酸二乙酯和溶剂加入到反应器中，其中4-R基取代水杨醛与丙二酸二乙酯的摩尔比为I : 2 3 ;4-R基取代水杨醛与溶剂的固液比为I : 5 7(g/mL)，加热回流13h ;旋转蒸发除去溶剂后向烧瓶中加入I : I的浓盐酸和冰醋酸的混合酸，4-R基取代水杨醛与混合酸的固液比为I : 6 8(g/mL)，继续搅拌回流7h ;将反应液冷却至室温后倒入去离子水中，用NaOH溶液调节溶液的pH至5左右，析出沉淀，抽滤，得茶绿色固体；粗产物经硅胶柱分离，得米黄色固体2，产率81. 4% ;所述的溶剂为乙醇与二氧六环，体积比为30 I ;R基为N，N-二烷基氨基、羟基或者烷氧基；(3)在N2保护下，向装有POCl3的反应器中滴加DMF，将由步骤2所得的米黄色固体2的DMF溶液缓慢滴加到上述试样中，溶液颜色逐渐由橙黄色变为深红色；加热搅拌，在 60 70°C反应15 25h ;将反应液倒入冰水中，用NaOH溶液调节pH至5左右，抽滤，得红褐色固体，干燥；粗产物经硅胶柱分离，旋蒸去溶剂，得橙红色结晶物3，产率61.0% ；(4)将由步骤3得到的橙红色结晶物3，步骤I得到的淡黄色粘稠状产物I以及溶剂加入到反应器中，然后向反应液中滴加几滴吡咯烷，其中橙红色结晶物3与淡黄色粘稠状产物I的摩尔比为I : I. 5 2. 5，橙红色结晶物3和淡黄色粘稠状产物I的混合物与二氯甲烷与无水乙醇混合溶剂的固液比为I : 10 20 (g/mL)，室温反应4天；旋干溶剂后产物用石油醚/乙酸乙酯的固液比为I : 100 200 (g/mL)的混合溶液洗涤，抽滤，得鲜红色固体4，产率22. 0% ；所述溶剂为二氯甲烷与无水乙醇的混合液，体积比I : I;(5)在由步骤4得到的鲜红色固体4和20%的盐酸水溶液加入到反应器中，固液比为I : 100(g/mL)，室温搅拌，TLC点板跟踪至原料消失；将反应液倒入去离子水中，用NaOH溶液调节pH至2 3，有大量红色沉淀析出，静置、过滤，滤饼用水洗至中性后干燥，得红色结晶物，粗产率77. 9% ;用硅胶柱对产物进一步提纯得到纯品目标产物含芳基硼酸香豆素类化合物。一种含芳基硼酸香豆素化合物在糖检测中的应用，其具体步骤为(I)制备含芳基硼酸香豆素化合物的二甲基亚砜(DMSO)溶液，为储备液I ;(2)制备葡萄糖、果糖、山梨醇糖、半乳糖和甘露糖的水溶液，分别为储备液2、储备液3、储备液4、储备液5和储备液6 ；(3)准确移取100 μ L储备液I至IOmL容量瓶中，用pH = 7. 4的O. 05M磷酸缓冲溶液稀释至刻度，再滴加储备液2至上述溶液，使得糖的最终浓度为I 300mM，测定溶液在不同浓度糖存在时的紫外和荧光光谱，即为葡萄糖对芳基硼酸化合物的滴定曲线；以储备液3、储备液4、储备液5或储备液6代替储备液2，重复上述操作，即为果糖、山梨醇糖、半乳糖和甘露糖对芳基硼酸化合物的滴定曲线。与现有技术相比，本发明的积极效果是新型的荧光分子探针具有良好的水溶性，较大的Stokes位移，其发射波长616nm位于红光区，有利于消除生物背景的干扰。在生理pH条件下(pH = 7. 4)，该探针对D-果糖和D-山梨醇具有较高的检测灵敏度，对它们的检测限分别为O. 05mM和O. ImM。
图ID-果糖对探针CSP吸收(a)与发射(b)光谱的影响；I % DMS0_50mM磷酸缓冲溶液(pH = 7. 4)，[CSP] = ΙΟμΜ,荧光激发波长为465nm。图2糖浓度对探针CSP荧光强度的影响；I % DMS0-50mM磷酸缓冲溶液，pH = 7. 4，[CSP] = 1(^11，激发波长为46511111，荧光发射波长为61611111。图3 —种含芳基硼酸香豆素类化合物的结构式。
具体实施方式以下提供本发明一种含芳基硼酸香豆素类化合物及其在糖检测中的应用的具体实施方式
。 实施例I
权利要求
1.一种含芳基硼酸香豆素类化合物，其特征在于，其结构通式
2.一种含芳基硼酸香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，其具体步骤为 (1)4-溴苯乙酮，双(频哪醇合)二硼，醋酸钾以及1，1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和溶剂加入到反应器中；加热回流，TLC点板跟踪反应至原料消失；除去溶剂，硅胶柱提纯，得淡黄色粘稠状产物I ; (2)4-R基取代水杨醛，丙二酸二乙酯和溶剂加入到反应器中，其中4-R基取代水杨醛与丙二酸二乙酯的摩尔比为I : 2 3 ;4-R基取代水杨醛与溶剂的固液比为I : 5 7(g/mL)，加热回流13h ;旋转蒸发除去溶剂后向烧瓶中加入I : I的浓盐酸和冰醋酸的混合酸，4-R基取代水杨醛与混合酸的固液比为I : 6 8 (g/mL)，继续搅拌回流7h ;将反应液冷却至室温后倒入去离子水中，用NaOH溶液调节溶液的pH至5左右，析出沉淀，抽滤，得茶绿色固体；粗产物经硅胶柱分离，得米黄色固体2 ;R基为N，N- 二烷基氨基、羟基或者烷氧基； (3)在N2保护下，向装有POCl3的反应器中滴加DMF，将由步骤2所得的米黄色固体2的DMF溶液缓慢滴加到上述试样中，溶液颜色逐渐由橙黄色变为深红色；加热搅拌，在60 70°C反应15 25h ;将反应液倒入冰水中，用NaOH溶液调节pH至5左右，抽滤，得红褐色固体，干燥；粗产物经硅胶柱分离，旋蒸去溶剂，得橙红色结晶物3 ； (4)将由步骤3得到的橙红色结晶物3，步骤I得到的淡黄色粘稠状产物I以及溶剂加入到反应器中，然后向反应液中滴加吡咯烷，其中橙红色结晶物3与淡黄色粘稠状产物I的摩尔比为I : I. 5 2. 5，橙红色结晶物3和淡黄色粘稠状产物I的混合物与二氯甲烷与无水乙醇混合溶剂的固液比为I : 10 20 (g/mL)，室温反应4天；旋干溶剂后产物用石油醚/乙酸乙酯的固液比为I : 100 200 (g/mL)的混合溶液洗涤，抽滤，得鲜红色固体4 ； (5)在由步骤4得到的鲜红色固体4和盐酸水溶液加入到反应器中，室温搅拌，TLC点板跟踪至原料消失；将反应液倒入去离子水中，用NaOH溶液调节pH至2 3，有红色沉淀析出，静置、过滤，滤饼用水洗至中性后干燥，得红色结晶物；用硅胶柱对产物进一步提纯得到纯品目标产物含芳基硼酸香豆素类化合物。
3.如权利要求2所述的一种含芳基硼酸香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤⑴中，4-溴苯乙酮与双(频哪醇合)二硼的摩尔比为1.0 1.0 1.8;4_溴苯乙酮与醋酸钾的摩尔比为1.0 2·0 3·0;[1，Γ -双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯与4-溴苯乙酮的摩尔量之比为I 3 100 ;4_溴苯乙酮，双(频哪醇合)二硼，醋酸钾以及1，Ρ -双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯的混合物与溶剂的固液比为I : 3 5(g/mL)。
4.如权利要求2所述的一种含芳基硼酸香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(I)中，所述的溶剂为二氧六环。
5.如权利要求2所述的一种含芳基硼酸香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的溶剂为乙醇与二氧六环，体积比为30 I。
6.一种含芳基硼酸香豆素化合物在糖检测中的应用，其特征在于，其具体步骤为 (1)制备含芳基硼酸香豆素化合物的二甲基亚砜(DMSO)溶液，为储备液I; (2)制备葡萄糖、果糖、山梨醇糖、半乳糖和甘露糖的水溶液，分别为储备液2、储备液.3、储备液4、储备液5和储备液6 ； (3)准确移取100μ L储备液I至IOmL容量瓶中，用pH = 7. 4的O. 05M磷酸缓冲溶液稀释至刻度，再滴加储备液2至上述溶液，使得糖的最终浓度为I 300mM，测定溶液在不同浓度糖存在时的紫外和荧光光谱，即为葡萄糖对芳基硼酸化合物的滴定曲线；以储备液3、储备液4、储备液5或储备液6代替储备液2，重复上述操作，即为果糖、山梨醇糖、半乳糖和甘露糖对芳基硼酸化合物的滴定曲线。
全文摘要
本发明涉及一种含芳基硼酸香豆素类化合物及其在糖检测中的应用，新型的荧光分子探针利用芳基硼酸与多元醇特异性结合的性质，其与糖反应前后化合物的光谱发生明显变化，对D-果糖和D-山梨醇具有较高的检测灵敏度，发射波长达620nm、位于红光区，适用于生物体内糖含量的检测。
文档编号G01N21/64GK102887914SQ201210396468
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者钱俊红, 张凌怡, 柏红艳, 张维冰, 田海玉, 孙倩 申请人:华东理工大学