有效保证了葡萄胚性 愈伤组织的顺利诱导，保证了苗/根的形成、且组织本身在器官形成部位的生长调节物质 的平衡；
[0019] (3)本发明步骤简单，耗时短，诱导率高，建立高效的葡萄胚性愈伤组织培养体系， 提高葡萄胚性愈伤组织的产量，有效地解决了葡萄胚性愈伤组织诱导困难、诱导率低的问 题，为建立葡萄组织培养体系、快速繁育葡萄组培苗奠定基础，是一条提高葡萄组培苗产量 的有效途径。
【附图说明】
[0020] 图1所示的是本发明培养得到的初级培养葡萄愈伤组织的照片；
[0021] 图2所示的是本发明培养得到的葡萄愈伤组织的照片；
[0022] 图3所示的是本发明培养得到的胚性愈伤组织的照片。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示 性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语 具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
[0024] 本实施例葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，包括以下步骤：
[0025] L外植体的选取
[0026] 选取抗病、早熟、优质高产的葡萄品种金手指的嫩梢为材料（采集自宁波九龙湖 镇葡萄园），从大田中取回当年生半木质化葡萄嫩茎，剪掉叶柄和叶片，剪成长约l-2cm的 茎段，用洗洁精洗净葡萄茎段后用自来水冲洗lh，再用无菌纸吸干表面的水分。然后在超净 工作台上进行以下步骤：将茎段浸入70%酒精30s后，用无菌水冲洗一次，放入盛有0. 1 % 升汞的广口瓶中浸泡7min，在消毒的过程中不时的摇动广口瓶，使材料的各个部分与消毒 液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底，7min后用无菌水将材料冲洗4~5次，用无菌纸吸干葡 萄茎段表面的水分，得到无菌的葡萄茎段。
[0027] 2.愈伤组织的诱导培养
[0028] 将上述无菌的葡萄茎段切成长约I. 5cm左右的小段，接种到葡萄愈伤组织诱导培 养基中进行培养。培养条件：温度（25± I) °C、湿度60-70%，暗培养两周后转移到光照强度 20001x下培养，光照时间16/8h的光/暗条件下交替培养，培养1个月后得到初级培养葡萄 愈伤组织。经过以上诱导培养后在葡萄茎段的切口处出现愈伤组织，所得结果见图1。
[0029] 以上愈伤组织的诱导培养共进行8个处理，每个处理接种10瓶，每瓶接种5个外 植体，重复3次，以统计其平均愈伤诱导率及生长状态。每个处理使用的葡萄愈伤组织诱导 培养基配方如表1所示，pH值5. 8,培养基的制备方法如下：以MS为基本培养基（配方如表 5所示），添加3 %的蔗糖，0. 7 %的琼脂，煮沸，再添加适宜浓度的聚乙烯吡咯烷酮、6-苄氨 基腺嘌呤（6-BA)、a-萘乙酸（NAA)，调pH，分装，最后高温高压灭菌。不同激素对茎段诱导 愈伤组织的影响见表2。
[0030] 表1 8个处理使用的培养基配方
[0031]
【主权项】
1. 一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 外植体的选取：取葡萄植株的嫩梢为外植体，经过修剪、消毒洗涤，得到无菌葡萄 莖段； (2) 愈伤组织的诱导培养：将无菌葡萄茎段置于葡萄愈伤组织诱导培养基上进行诱 导培养，得到初级培养葡萄愈伤组织；将得到的初级培养葡萄愈伤组织再转接至葡萄愈 伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的葡萄愈伤组织，所述葡萄愈伤组织诱 导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖30g/L、琼脂7g/L、聚乙烯吡咯烷酮 L0-3. 0g/L、6-苄氨基腺嘌呤I. 0-2. 5mg/L、a-萘乙酸 0? 1-0. 5mg/L，pH值 5.8; (3) 胚性愈伤组织的培养：将得到的葡萄愈伤组织转接至胚性愈伤组织培养基中进行 培养，得到胚性愈伤组织，所述胚性愈伤组织培养基以MS培养基为基础培养基，并添加蔗 糖30g/L、琼脂7g/L、聚乙烯吡咯烷酮L0-3. 0g/L、2, 4-二氯苯氧乙酸0? 5-1. 5mg/L、6-苄 氨基腺嗓呤 〇? 5-2.Omg/L、a-萘乙酸 0? 05-0. 5mg/L，pH值 5.8。
2. 根据权利要求1所述的一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于：所 述步骤（2)中诱导培养的培养条件为：培养温度（25±1)°C、湿度60-70%，先暗培养两周， 再光培养25-35天，光培养按光照强度20001x下16h、暗条件下8h交替进行。
3. 根据权利要求1所述的一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于：所 述步骤（2)中继代培养的培养条件为：培养温度（25±1)°C、湿度60-70%，先暗培养两周， 再光培养55-65天，光培养按光照强度20001x下16h、暗条件下8h交替进行。
4. 根据权利要求1所述的一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于：所 述步骤（3)中的培养条件为：培养温度（25±1)°C、湿度60-70%，暗培养55-65天。
【专利摘要】本发明提供一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，它包括以下步骤：取葡萄植株的嫩梢为外植体，经过修剪、消毒洗涤，得到无菌葡萄茎段；将无菌葡萄茎段置于葡萄愈伤组织诱导培养基诱导培养，再转接继代两次，得到葡萄愈伤组织，葡萄愈伤组织诱导培养基含6-苄氨基腺嘌呤1.0-2.5mg/L、a-萘乙酸0.1-0.5mg/L；将葡萄愈伤组织转接至胚性愈伤组织培养基培养，得到胚性愈伤组织，胚性愈伤组织培养基含2,4-二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5-2.0mg/L、a-萘乙酸0.05-0.5mg/L。该方法以葡萄幼嫩茎段为外植体进行诱导，有效解决了葡萄胚性愈伤组织诱导难、诱导率低的问题。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104686361
【申请号】CN201510124438
【发明人】吴月燕, 饶慧云, 刘蓉, 钱萍仙
【申请人】浙江万里学院
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月20日