专利名称：关中奶山羊表皮干细胞无血清培养基的制备方法
技术领域：
本发明涉及干细胞体外培养基领域，具体涉及一种关中奶山羊表皮干细胞无血清培养基的制备方法。
背景技术：
细胞培养是生产基因工程产品的重要环节。由于传统的含血清的细胞培养会给生产及科研带来许多不利因素，因此自50年代以来，国外就开始研制无血清培养基。80年代末90年代初，有商业应用价值的无血清培养基纷纷上市，而无血清培养基的一个主要特点是就是适用的细胞系谱窄，对特定的细胞株需自己摸索新的配方或最优条件。表皮干细胞是维持皮肤及其附属器结构和功能完整性的细胞源泉，研究表皮干细胞的增殖分化规律不仅为治疗皮肤性疾病开辟新的途径，而且将为体外构建具有生理功能的人工皮肤指明方向；关中奶山羊是优良的奶山羊品种是理想的生物反应器，分离纯化关中奶山羊表皮干细胞，建立其体外无血清培养体系是实现这一目标的关键。然而，长期以来，表皮干细胞体外扩增培养是借助有血清培养基实现的(Jones，et al Cell，1993 73(4)713-724.Bickenbach，Exp Cell Res，1998224(1)184-185.Papini et al.Stemcells，2003，21481-494)，且均需要以成纤维细胞作饲养层。经检索国外虽有针对人类皮肤基底层角质形成细胞的无血清培养基的专利(Wo03055990，2003-07-10。InventorIsaacs Richard John)，但该专利所述的培养基适合于含有干细胞的细胞群的扩增且仍需要与成纤维细胞共培养才能维持干细胞的无分化状态。因此，国内外还没有适用纯化的表皮干细胞长期扩增培养的无血清培养基。
发明内容
针对当前表皮干细胞传代培养仍需血清或成纤维细胞予以维持其干细胞状态的缺点，本发明的目的在于，根据表皮干细胞在体微环境对表皮干细胞增殖分化调控规律，提供一种不需滋养层细胞、无血清的表皮干细胞培养基。
实现上述目的采取的技术方案是，关中奶山羊表皮干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)成纤维细胞条件培养基A.无菌采取关中奶山羊颈部皮肤，用0.25％ Trypsin(胰蛋白酶1∶250，华美生物工程公司)+0.02％ EDTA(乙二胺四乙酸，Invitrogen，LOT1120193)处理皮肤块，4℃过夜，使表皮与真皮分离；B.将真皮与表皮间细胞冲洗干净，将真皮切成小块贴于玻璃皿中，每皿3-4块，加培养基，培养基的配方为F12(Initrogen CorporationLot1116568)+1％BSA(牛血清白蛋白Sigma，LOT 716H9310)+10ng/ml EGF(表皮细胞生长因子，Sigma，E-mailtechserv@sial.com，Product Number E9644)+10ug/mlinsulin(胰岛素，北京鼎国生物技术有限责任公司，http//www.digguo.com，Sigma分装，原产品编号为15500)+10ng/mlIGF-1(胰岛素类生长因子-1，Sigma E-mailtechserv@sial.com，productNumber I3769)+青链霉素100u/ml进行培养；C.当成纤维细胞铺满平皿后，去组织块，将成纤维细胞消化传代以1×105/ml，接种在50mm平皿中，培养48小时后收集培养基，在4000r/分条件下离心30分钟，0.22um滤膜过滤除菌，-20℃保存备用，标为山羊成纤维细胞条件培养基(goat skin fibroblast conditionalmedium，GSFCM)；2)IGF-1、EGF、GSFCCM适宜添加浓度的筛选在F12+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白Sigma，Lot 716H9310)为基础培养基中分别添加EGF(表皮细胞生长因子)，IGF-1(胰岛素类生长因子—1)，GSFCM的浓度梯度，按正交试验设计进行分组，培养所分离纯化的表皮干细胞，并进行细胞计数测其生长曲线，和细胞形态学变化，比较不同组合的优缺点；3)最后确定培养基配方为F12+1～1.2％BSA+20～25％GSFCM+20～25ng/ml EGF+5ug/ml insulin+15～20ng/ml IGF-1+0.4～0.6μg/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml。
本发明突破传统培养基只添加表皮生长因子的局限，添加了胰岛素样生长因子，并摸索出这种因子的适宜比例，采用在培养基添加成纤维细胞条件培养基的方法，替代用成纤维细胞共培养的方法。本发明用激素、细胞因子组合及成纤维细胞条件培养基和BSA补充了因不添加血清而导致的营养因子的不足，完全满足表皮干细胞体外长期扩增培养的营养需求，是一种理想的可商品化生产的无血清培养基。
图1是表皮干细胞在无血培养基中克隆性生长×100。
图2是单个表皮干细胞在无血清培养基中形成全克隆，β1-integrin阳性×100。
图3是无血清培养基培养表皮干细胞CK19阳性×100。
图4是无血清培养基培养表皮干细胞P63阳性×400。
具体实施例方式
以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细描述。
参见附图，本发明的关键是成纤维细胞条件培养基的制作及各种因子合理浓度的筛选。现以关中奶山羊表皮干细胞无血清培养基制作为例予以说明。
1.成纤维细胞条件培养基的制备无菌采取关中奶山羊颈部皮肤，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA处理皮肤块(4℃过夜)，使表皮与真皮分离。将真皮与表皮间细胞冲洗干净，将真皮切成小块贴于玻璃皿中(Φ＝50mm)。每皿3-4块，加培养基(F12+1％BSA+10ng/ml EGF+10ug/ml insulin+10ng/mlIGF-1+青链抗素100u/ml)进行培养。当成纤维细胞铺满平皿后，去组织块，将成纤维细胞消化传代以1×105/ml，接种在50mm平皿中，培养48小时后收集培养基，离心(4000r/分，30分钟)，0.22um滤膜过滤除菌，-20℃保存备用，标为GSFCM。
2.IGF-1、EGF、GSFCM适宜添加浓度的筛选在F12+1～1.2％BSA为基础培养基中分别设计添加EGF(10ng、15ng、20ng、25ng/ml)，IGF-1(10ng、15ng、20ng、25ng/ml)，GSFCM(10、15、20、25％)的浓度梯度，按正交试验设计进行分组，培养所分离纯化的表皮干细胞，并进行细胞计数测其生长曲线，和细胞形态学变化，比较不同组合的优缺点，最后确定培养基配方为F12+1～1.2％BSA+20～25％GSFCM+20～25ng/mlEGF+5ug/ml insulin+15～20ng/ml IGF-1+0.4～0.6μg/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml；用该培养基培养关中奶山羊表皮干细胞成克隆生长(图1)，经检测该类细胞CK19(角蛋白19)，integrin-β1(整合素-β1)，P63均为阳性(图2-4)是典型的表皮干细胞。
本发明针对山羊表皮干细胞将广泛用于转基因动物、生物反器、克隆动物的研究，最终生产安全的药用蛋白的广阔应用前景，建立了一种适合于关中奶山羊表皮干细胞的无血清培养基。
权利要求
1.关中奶山羊表皮干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)成纤维细胞条件培养基A.无菌采取关中奶山羊颈部皮肤，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA处理皮肤块，4℃过夜，使表皮与真皮分离；B.将真皮与表皮间细胞冲洗干净，将真皮切成小块贴于玻璃皿中，每皿3-4块，加培养基F12+1％BSA+10ng/mlEGF+10ug/mlinsulin+10ng/mlIGF-1+青链抗素100u/ml进行培养；C.当成纤维细胞铺满平皿后，去组织块，将成纤维细胞消化传代以1×105/ml，接种在50mm平皿中，培养48小时后收集培养基，在4000r/分条件下离心30分钟，0.22um滤膜过滤除菌，-20℃保存备用，标为GSFCM；2)IGF-1、EGF、GSFCM适宜添加浓度的筛选在F12+1～1.2％BSA为基础培养基中分别添加EGF，IGF-1，GSFCM的不同设计浓度梯度，按正交试验进行分组，培养所分离纯化的表皮干细胞，并进行细胞计数测其生长曲线，克隆形成率和细胞形态学变化，比较不同组合的优缺点；3)最后确定培养基配方为F12+1～1.2％BSA+20～25％GSFCM+20～25ng/mlEGF+5ug/mlinsulin+15～20ng/mlIGF-1+0.4～0.6μg/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml。
全文摘要
本发明公开了关中奶山羊表皮干细胞无血清培养基的制备方法，包括成纤维细胞条件培养基和IGF－1、EGF、GSFCM适宜添加浓度的筛选，最后确定培养基配方为F12+1～1.2％BSA+20～25％GSFCM+20～25ng/ mlEGF+5ug/ ml insulin+15～20ng/ml IGF－1+0.4～0.6μg/ml氢化可的松＋青链霉素100u/ml；本发明突破传统培养基只添加表皮生长因子的局限，添加了胰岛素样生长因子，并摸索出这种因子的适宜比例，采用在培养基添加成纤维细胞条件培养基的方法，替代用成纤维细胞共培养的方法。本发明用激素、细胞因子组合及成纤维细胞条件培养基和BSA补充了因不添加血清而导致的营养因子的不足，完全满足表皮干细胞体外长期扩增培养的营养需求，是一种理想的可商品化生产的无血清培养基。
文档编号C12N5/071GK1563360SQ200410025938
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月12日 优先权日2004年3月12日
发明者杨学义, 窦忠英 申请人:西北农林科技大学