RNAi表达构建体的制作方法

专利名称：：RNAi表达构建体的制作方法RNAi表达构建体
背景技术：
：利用双链RNA以序列特异性方式抑制基因表达彻底改革了药物发现工业。在哺乳动物中，RNA干扰，或RNAi通过被称为小干扰RNAs(RNAi因子)的15到49个核苷酸长度的双《连RNA分子介导。RNAi因子可以在细胞外化学或酶促合成，并随后被递送至细胞(参见，例如Fire,等人，Nature(自然),391:806-11(1998);Tuschl，等人，GenesandDev(基因与发育),13:3191-97(1999);和Elbashir，等人，Nature(自然)，411:494-498(2001));或者可以通过细胞内适当的载体在体内表达(参见，例如美国专利6,573,099)。作为有效治疗剂应用于人类的未^奮饰的RNAi因子的体内递送面临许多技术难题。首先，由于细胞和血清的核酸酶，注射入体内的認A的半衰期只有约70秒(参见，例如Kurreck，Eur.J.Bioch(欧洲生化杂志).270:1628-44(2003》。通过使用化学修饰增加被注射的RNA的稳定性的努力也进行了尝试；但是，在许多情况下，化学改变导致了细胞毒性效应的增加。在一个具体的例子中，细胞对将每个第二个磷酸酯替代为硫代磷酸酯的RNAi双链的剂量给药是不能忍受的(Harborth，等人，AntisenceNucleicAcidRev.(反义4亥酸药物回顾)13(2):83-105(2003))。其它的困难包括提供组织特异性的递送，以及能够递送足以引发治疗应答的而没有毒性的剂量的RNAi因子。已经开发RNAi的递送有几种选^奪，其包括使用以病毒为基础的和不以病毒为基础的、可以感染或是以其它方式转染靶细胞，并递送和原位表达RNAi分子的载体系统。通常，小RNAs从病毒或非病毒载体骨架作为短发夹RNA(shRNA)前体转录得到。一旦被转录，假定shRNA^皮核糖核酸降解酶(enzymeDicer)加工成适当的活性RNAi因子。以病毒为基础的递送的途径尝试开发病毒的靶向特性以产生组织特异性，一旦被适当地耙向，依靠内源性的细胞机制产生足够水平的RNAi因子以达到治疗有效剂量。RNAi治疗剂的一种有益用途是用做抗病毒因子。概括而言，RNA病毒依靠RNA依赖性的RNA聚合酶进行复制。该RNA聚合酶以相对低的保真度复制病毒基因组，其功能性的后果是产生具有异常大量毒因子的、进化了的病毒体后代。因此，与观察到的小分子治疗剂的效应相似，RNAi治疗剂的相应效力和效果作为在长期治疗过程中病毒进化的结果而降低了。在一个研究中，在递送表达的shRNA35天后，出现了含有单核苷酸改变的HIV逃避变异抹(Boden,等人，LVirol.(病毒学杂志).77(21):11531-11535(2003))。在另一个研究中，在被预先合成的RNAi转染的细胞中，在细胞感染短短54小时以内就可以检测到脊髓灰质炎病毒(poliovirus)逃避变异林(Gitlin等人JLVirol.(病毒学杂志)2005Jan;79(2):1027-35)。同样地，其它可能的RNAi耙目标，例如涉及肺瘤的基因具有序列可变异性。同时抗多个序列的两种或多种RNAi的递送可以对利用基因变异而抗抑制的任何疾病提供更好效果的治疗。在本领域需要发展可以递送多个RNAi因子的、稳定的、有效的、表达RNAi因子。
发明内容本发明涉及将RNAi因子递送到组织、器官，或细胞以治疗各种疾病或功能紊乱的基因构建体。在一个方面，本发明提供了新型的含有两种或更多种用于调节靶基因表达的RNAi因子的核酸分子。在另一方面，本发明提供了含有启动子和两种或更多种彼此被间隔子结构分隔的茎-环结构的表达盒(以下称为l-xRNA表达盒)。本发明在另一个方面提供了能够调节表达一种或多种基因的基因构建体，其中所述基因构建体包括两种或多种从单个启动子转录出的RNAi因子。同时，本发明的其它方面包括在组织、细胞或器官中治疗疾病或功能紊乱的方法，所述方法通过从单个启动子表达两种或多种RNAi因子以调节在细胞组织或器官中的基因表达。可以参照附图中描述的实施例获得在上文所筒要概括的本发明的更详细的描述，以获得并详细地理解包括本发明上述的特征、优点和目的的方式。但是，应该注意的是，附图只说明了本发明的某些实施方案，因此不能被认为是对本发明范围的限制，因为本发明可以包括其它具有等同效果实施例。图1是根据本发明将l-xRNAi表达盒递送到相关细胞、组织或器官的一个实施方案的简化模块图。图2A,2B,和2C显示根据本发明的l-xRNAi表达盒的三个实施方案。图3A和3B显示用于产生将含l-xRNAi表达盒的构建体递送到相关细胞、组织或器官的病毒粒子的可选择的方法。图4显示了在本文描述的实施例中使用的1-3RNAi表达盒的示意图。根据预先设定的人为控制(artgovening)的RNA千扰才几理作用，在每一种构建体下面列出了siRNA活性的预期结果。图5显示了本发明的1-3RNAi表达盒构建体对含HCV5'-8靶序列的Luc-HCV融合报导子构建体的抑制结果。图6显示了本发明的1-3RNAi表达盒构建体对含HCV编码-12靶序列的Luc-HCV融合报导子构建体的抑制结果。图7显示了在HCV基因组中所选择的RNAi靶序列的位置的示意图。十个保守的靶序列被鉴定为位于HCVIRES区，十二个位于ORF(开放阅读框)内，八个位于3'非编码区(3'UTR)。同时显示了用于评价l-xRNAi抑制的Luc-HCV融合才艮导子构建体。图8显示了用于评价l-xRNAi抑制的Luc-HCV融合报导子构建体。图9显示通过体外产生的被转染的RNA种类抑制一系列含有耙序列的Luc-HCV融合报导子构建体的结果。使用含有本发明的1-3RNAi表达盒构建体的DNA模板通过T7RNA聚合酶从失控转录(run-offtranscription)反应获得RNA。具体实施例方式在描述本组合物和方法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体的方法学、产物、仪器和因素。因为，这样的方法、仪器和制剂当然可以改变。还应当理解的是在这里使用的术语只是出于描述具体实施方案的用途，并不意在限制本发明的范围，只有所附的权利要求限制本发明的范围。如在本文所使用的,单数形式"一(a)","—(an)"，和"该(the)"包括复数指代物，除非上下文另有清楚的指示。因而，例如，所提及的"一因素(afactor)"是指一个因素或多个因素的混合。并且所提及的"生产方法"包括是指本领域技术人员已知的等同的步骤和方法，等等。除非另有限定，在本文使用的所有的技术和科学术语具有本发明所属的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文所述及的所有出版物通过引用没有限制地被并入本文，以用于描述和公开在出版物中所描述的，并可以与所描述的本发明结合使用的设备、制剂和方法。在以下的描述中，提供了大量具体的详细资料以便于对本发明有更完全的理解。但是，没有这些详细资料的一种或多种，实施本发明对本领域技术人员也是显而易见的。在另外的情况下，为了避免使本发明不清楚，没有描述公知特征和本领域技术人员公知的步骤。本发明涉及到新型的、活性强烈的基因组合物和使用新型RNAi盒治疗疾病或功能紊乱的方法。通常，本发明应用了本
技术领域：
范围内的分子生物学、微生物学、重组DNA技术、细胞生物学、和病毒学的方法。这些技术在文献中得到了全面地解释，参见，例如Maniatis,Fritsch和Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆:实验室手册)(1982);DNACloning:APracticalApproach(DNA克隆:实践方法)，巻I和II(D.N.Glover,编辑.1985);OligonucleotideSynthesis(寡核苷S羑合成)(M.J.Gait,编辑.1984);NucleicAcidHybridization(核酸杂交)(B.D.Hames和S.J.Higgins，编辑.(1984));AnimalCellCulture(动物细胞培养)(R.I.Freshney,编辑.1986);和脂AViruses:ApracticalApproach(RNA病毒:实践方法)，(Alan，J.Cann,编辑，OxfordUniversityPress(牛津大学出版社),2000)。"载体"为复制子，例如质粒、噬菌体、病毒构建体或科斯质粒(cosmid),在其上可以连接另一DNA片段。载体被用于在细胞中转导和表达DNA片段。术语"构建体"和"l-xRNAi表达构建体"通常是指与l-xRNAi表达盒结合的载体。"启动子"或"启动子序列"是能够结合细胞内的RNA聚合酶，并且启动转录多聚核苷酸或多肽编码序列的DNA调节区，所述多聚核苷酸或多肽编码序列例如为信使RNA,核糖体RNA,小核或核仁RNA或由任何种类的RNA聚合酶转录的任何类型的RNA。当外源性或异质性核酸或载体^^皮导入细胞内时，例如以与转染试剂混合或被包装入病毒粒子中方式，则细胞被这种核酸"转化"，"转导"或"转染"。转化DNA可以(共价结合)整合入细胞的基因组，也可以不整合入细胞的基因组。对于真核细胞而言，稳定的被转化细胞就是在其中转化DNA已经整合入宿主细胞染色体或被保持在染色体外，以使转化DNA在细胞复制期间被遗传给子代细胞的细胞，或者是在其中存在稳定的游离体的不复制的，差异的细胞。术语"RNA干扰"或"RNAi"通常是指一种方法，其中双链RNA分子改变与双链或短发夹RNA分子享有基本或全部的同源性的核酸序列的表达。术语"RNAi因子"是指引发RNAi的RNA序列；术语"ddRNAi因子"是指从载体转录的RNAi因子。术语"短发夹RNA"或"shRNA"是指具有一双链区域和一环区的RNA结构。在本发明一些实施方案中，ddRNAi因子起始表达为shRNA。术语"l-xRNAi表达盒"是指根据本发明的实施方案，具有一个启动子和xRNAi构建体的盒，其中x为二或三或四或五或更多，因而为l-2，1-3,1-4,1-5,等的RNAi表达盒。RNAi因子被起始表达为shRNA，并包括两种或多种被一个或多个间隔子区域分隔开的茎-环结构。术语"l-xRNAi表达构建体"或"l-xRNAi表达载体"是指含有l-xRNAi表达盒的载体。基因或核苷酸序列的"衍生物"是指含有与基因或核苷酸序列或是其一部分具有显著的序列相似性的任何单独的核酸分子。另外，'嗜亍生物"包括这种含有修饰的核苷酸或天然存在的核香酸的类似物的单独的核酸。图1是显示根据本发明的一个实施方案的方法步骤的简单流程图，其中可以使用l-xRNAi表达构建体。所述方法包括步骤200,在该步骤中，构建了靶向疾病或功能紊乱的l-xRNAi表达盒。然后，在步骤300中，将l-xRNAi表达盒连接入适当的病毒递送构建体内。之后在步骤400中将病毒l-xRNAi表达递送构建体包装入病毒粒子中，并且在步骤500中将病毒粒子递送到相关的细胞、组织或器官。在下文将提供这些每一个步骤和所涉及组分的细节。可以通过本领域技术人员公知的大量不同的方法合成或酶促产生根据本发明的以病毒为基础的1—xRNAi表达构建体，并且根据例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验室手册)第二版，ColdSpringHarborPress(冷泉港出版社)，ColdSpringHarbor(冷泉港)，纽约(1989)的描述，以及^t安照在例如美国i^康安全服务部(HHS),国立卫生研究院(NIH)关于重组DNA研究准则的规定，使用标准重组DNA技术进行纯化。图2A和图2B是根据本发明的实施方案分别含有三个和五个不同的RNAi茎-环结构的1-3和1-5RNAi表达盒的简化示意图。本领域技术人员应该懂得本发明的l-xRNAi表达盒可以包括两个，四个，六个或更多个茎-环结构，并且以在本图中所显示出的实施方案是示例性的。这些图显示了含有三个和五个由间隔子区域分隔的茎-环结构的1-3和1-5RNAi表达盒的实施方案。茎区1-5含有约17-21个碱基对，优选地为19个碱基对。环区1-5含有约3-20个核苦酸，优选地为5至9个核苷酸，更优选地为6个核苷酸。在RNAi茎之间的间隔子区域(NPN2.".)在约4-10核苷酸之间，优选地为6核苷酸。图2C显示了含有三个具有17-21个碱基对的茎-环结构，和一具有含2-17个之间的碱基对的更短茎区的第四茎-环结构的本发明l-xRNAi盒的一个具体实施方案。下文是本发明的多个发夹盒的序列的例子ggatccGTGCACGGTCTACGAGACCTCgaagcttgGAGGTCTCGTAGACCGTGCAtgtacaGCGAAAGGCCTTGTGGTACTgaagcttgAGTACCACAAGGCCTTTCGCccatggATTGGAGTGAGTTTAAGCTgaagcttgAGCTTAAACTCACTCCAATtttttctaga(序列号57).当使用l-xRNAi表达盒时，含有盒的两种或多种RNAi因子都具有不同的序列；它们是RNAil，RNAi2，RNAi3,RNAi4和RNAi5，例如它们彼此都不相同。另外，在一个优选的实施方案中，在l-xRNAi子元件来源于其所天然存在的同一基因。使用分子技术，或其它技术，在本发明一些实施方案中使用的启动子可以是组织特异性或细胞特异性的。术语"组织特异性"在用于启动子时是指能够介导针对特异类型的组织的相关核苷酸序列的选择性表达，所述核苷酸序列在不同类型的组织(例如脑)中相对缺乏相关的同样核苷酸序列的表达。术语"细胞特异性"在用于启动子时是指能够介导相关核苷酸序列在特异类型的细胞中的选择性表达的启动子，在相同组织内的不同类型的细胞中相对缺乏相关的同样核苷酸序列的表达(参见，例如Higashibata,等人，J.BoneMiner.Res(骨矿研究杂志)Jan19(1):78-88(2004);Hoggatt,等人，Circ.Res.(循环研究)，Dec.91(12):1151-59(2002);Sohal,等人，Circ.Res.Jul89(l):20-25(2001);和Zhang,等人，GenomeRes(基因组研究).Jan14〖l):79-89(2004))。术语"细胞特异性"在用于启动子时也意指能够促进相关核苷酸序列在单一组织内的某一区域内的选择性表达的启动子。可选择地，启动子可以是构成性的或可调节性的。另外，可以修饰启动子以具有不同的特异性。术语"构成性"在用于启动子时是意指能够在缺乏特异性刺激(例如热休克，化学制剂，光，等)时，介导可操作地被连接的核酸序列的转录。通常，构成性启动子能够介导基本上任何细胞和任何组织中编码序列的表达。用于转录RNAi因子的启动子优选地是构成性启动子，例如由RNA聚合酶II控制的泛素、CMV、p-肌动蛋白、组蛋白H4、EF-1alfa或pgk基因的启动子，或由RNA聚合酶I控制的启动子元件。在其它实施方案中，使用了PolII启动子，例如CMV、SV40、Ul、(3-肌动蛋白或杂合的PolII启动子。在其它实施方案中，使用了由RNA聚合酶III控制的启动子元件，例如U6启动子(例如U6-1，U6-8,U6-9)、Hl启动子、7SL启动子、人Y启动子(hYl,hY3，hY4(参见Maraia,等人，NucleicAcidsRes(核酸研究)22(15):3045-52(1994))和hY5(参见Maraia，等人，NucleicAcidsRes(核酸研究)24(18):3552-59(1994))、人MRP-7-2启动子、腺病毒VA1启动子、人tRNA启动子、5s核糖体RNA启动子，以及这些启动子功能性的杂合和组合。可选择地，在一些实施方案中，优选选择可以诱导包含在1-xRNAi表达盒中的多个RNAi因子表达的启动子。在本领域已知大量的使用这种启动子的用于可诱导表达的系统，包括但不限于四环素应答系统和lac操纵子-抑制子系统(参见出版物WO03/022052Al;和美国专利出版物2002/0162126Al)、蜕皮素调节系统，或由糖皮质激素、黄体酮、雌激素、RU-486、类固醇、甲状腺激素、环AMP、细胞因子、钙化醇家族调节子调节的启动子，或金属硫蛋白启动子(由无机金属调节)。在l-xRNAi表达构建体中也可以存在一种或多种增强子以增加相关基因的表达。适于在本发明的实施方案中使用的增强子包括最近被描述的ApoEHCR增强子、CMV增强子(参见，Xia等人，NucleicAcidsRes(核酸研究)31-17(2003))，以及本领域技术人员已知的其它增强子。在本发明中使用的递送RNAi因子的l-xRNAi表达盒具有两个或更多个茎-环结构，在所述结构中，每一个茎的双链RNA的末端由单链、环RNA连接。由本发明的l-xRNAi表达盒编码的RNAi序列导致表达小的干扰RNA,所述干扰RNA为短的双链RNA,在通常的哺乳动物细胞中没有毒性。对本发明l-xRNAi表达盒的长度没有特别限定，只要其不显示细胞毒性即可。RNAi的长度可以是17到21个bp(碱基对)，并且更优选地为19bp的长度。RNAi双链或茎部分可以是完全同源的，或可以含有由于序列错配而形成的非配对部分(每一条链上的对应核苷酸不互补)，凸起(在一条链上缺乏相对应的互补核苷酸)，等等。这种非配对部分可以容忍至其不显著干扰RNAi双《连的形成或功效的程度。shRNA单链环部分的长度可以是3到20个核苷酸，并且优选地为5到9个核苷酸的长度。在本发明表达盒中的两种或多种RNAi因子的茎结构的序列可以是相同或不同的，但是在每一个l-x表达盒中的RNAi因子的序列经常彼此不同。同样，在l-xRNAi表达盒中的不同RNAi因子的茎和环的长度可以与1-xRNAi盒中的其它茎和/或环的长度相同或不同。本发明的两个或更多个茎-环结构被间隔子区分隔。间隔子区由核苷酸组成，所述核普酸可以是天然存在的也可以是合成的。在茎-环结构之间的间隔子区的长度可以为约4到10个核苷酸，并且优选地为约6个核苷酸。在本发明表达盒中的三个或更多个RNAi因子之间的间隔子区可以具有相同的序列或不相同的序列，并且可以是相同或不同的长度。作为本发明l-xRNAi表达盒靶向的核酸序列包括病毒基因、癌基因、细菌基因、发育基因，并且基于基因序列的遗传序列进行选择；并且优选地基于保守的基因序列区域。用于对比的序列对比(alignment)的方法和RNAi序列选择的方法在在本领域是公知的。可以使用数学算法确定两种或多种序列之间的一致性百分比。优选地，这种数学算法的非限制性实施例是Myers和Miller的算法(1988);Pearson和Lipman的相似性4叟索法(search—for-similarity—method)(1988);以及Karlin和Altschul(1993)的方法。优选地，使用计算机完成这些数学算法。这些操作包括，但是不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从Intelligenetics，MountainView,加利福尼亚州获得)；ALIGN程序(2.0版本)，GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA,Megalign(使用JotunHein,Martinez,Needleman-Wunsch算法),DNAStarLasergene(参见www血astar.com)和威斯康星遗传学软件包(WisconsingeneticsSoftwarePackage)中的TFASTA,第8版(可从GeneticsComputerGroup(GCG)获得，575ScienceDrive,威斯康星州麦迪逊，美国)。可以使用缺省参数或由操作员选择参数进行使用这些程序的对比。Higgins详细地描述了CLUSTAL程序。ALIGN程序基于Myers和Miller的算法；BLAST程序基于Karlin和Altschul的算法。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获4寻。对于序列比较，通常由一种序列作为检测序列被比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将检测序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列等同物，并指定序列算法程序参数。随后序列比致性百分比。通常，RNAi对耙序列的抑制需要靶序列和RNAi分子的正义链之间具有高度的序列同源性。在一些实施方案中，这种同源性高于约70%,并且可以高于约75%。优选地，同源性高于约80%,并且高于85%或甚至90%。更为优选地，在靶序列和RNAi的正义链之间的序列同源性高于约90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%。在l-xRNAi表达构建体用于靶向病毒感染的实施方案中，在病毒的各种亚种的基因组之间，甚至在保守区之间，15到30个连续核苷酸的序列同源性也可以达不到90%以上或甚至80%以上。在这样的情况下，在一些亚种的耙序列和RNAi的正义《连之间的序列同源性可以为80%或更低。在另一方面，当生物体的靶向基因在种、亚种或变异抹之间不显示出高度序列同源性时，本发明l-xRNAi表达构建体的实施方案特别有益，因为在1-xRNAi表达盒中的每一个ddRNAi因子可以用于定位于靶基因或变异抹的亚型、亚种或变异的等位序列的不同部位。当前抗病毒疗法的主要问题的是出现了抗性变异抹，即通常所知的逃逸变异林(Gitlin等人J.ofVirol(病毒学杂志).79;1027-1035,2005)。本发明在一个方面中和了出现的逃逸变异林。在本发明一些实施方案中，基于因感染细胞RNAi单个序列的治疗而出现逃逸变异抹，选择多个RNAi序列治疗病毒感染。在细胞被病毒感染后，通过含RNAi单一序列的表达构建体的治疗确定出现的逃逸变异抹。收获含有出现的抗性病毒的细胞，并且对病毒基因组进行测序。测序显示出引起抵抗病毒抑制的重要突变。产生出本发明的1-xRNAi表达构建体，所述构建体含有基于靶基因的遗传序列和《1起抗RNAi治疗的点突变的另外序列的RNAi序列。除了基于基因的保守区选择RNAi序列，可以基于其它因素选择RNAi序列。尽管基于想定的靶序列的特征，对在RNAi中有效的识别序列的选择标准的设计进行了大量尝试(例如GC含量百分比，距翻译起始密码子的位置，或基于电子序列(silicosequence)数据库对所提出的RNAi的类似物的搜索的序列相似性，热力学配对标准)，但目前不可能对千变万化的序列中哪一个作为相对于基因的，实际上是引发最佳的RNA静息应答的候选RNAi序列作出有把握的预计(尽管这种途径有所进展目前Dharmacon公司声称有70%的成功率)。取而代之的是，通常合成单独的具体的候选RNAi多聚核苷酸序列，并检测在本发明的一些实施方案中，1-xRNAi表达盒的ddRNAi因子编码区可"t喿作地与终止子元件相连。在一个实施方案中，使用polIII启动子，终止子包括一段四个或更多个胸腺嘧咬残基。其它的终止子包括SV40聚A,AdVAl基因，5S核糖体RNA基因，和人t-RNA。另外，启动子和终止子可以混合和匹配，例如通常将RNApolII启动子和终止子混合和匹配。另外，1-xRNAi表达盒可以在总体上被配置成分布有多个克隆位点和/或特定的限制性内切酶位点，以使启动子，ddRNAi因子和终止子元件能被容易地移除或替换。可以使用在总体上分布的限制性内切酶位点和/或互补粘性末端，由小的寡核香酸组分装配l-xRNAi表达盒。根据本发明的实施方案的一个方法的基本载体由具有多重连接子的质粒构成，在所述多重连接子上所有的位点都是唯一的(尽管这并不绝对必需)。接着，在一皮设定的各唯一位点之间插入启动子产生具有可以改变方向的启动子的基本盒。接着，将退火引物对插入唯一的位点之间，所述位点位于产生单个、两个或多个l-xRNAi表达盒构建体的单体的下游。插入体可以一皮移动入，例如^f吏用侧端与单一、两个或多个的l-xRNAi表达盒插入体相连的两个唯一的酶切位点将插入体移动入例如载体主链中。在图1的步骤300中，l-xRNAi表达盒被连接入递送载体。被插入有l-xRNAi表达盒，并被用于在不同细胞类型中高效转导和表达1-xRNAi表达盒的所述载体可源自于病毒并适合于病毒递送；可选择地，可以使用非病毒载体。可以使用本领域公知的任何合适的基因工程技术完成所产生的含有载体和l-xRNA表达盒的构建体的制备，所述技术包括但不限于，PCR,寡核香酸合成，限制性核酸内切酶消化，连接，转化，质粒纯化和DNA测序的标准纟支术。如果构建体以病毒构建体为基础，载体优选地包括，例如，将l-xRNAi表达构建体包装入病毒粒子的必需序列和/或将l-xRNAi表达构建体整合入靶细胞基因组的序列。病毒构建体也可以包括允许病毒复制和增殖的基因，尽管在其它实施方案中，可以以反式(infra似)提供这样的基因。另外，病毒构建体可以包含以天然形式或经修饰被整合入的、来源于任何已知生物体的基因组的基因或遗传序列。例如，优选的病毒构建体可以包括用于在细菌中复制构建体的序列。构建体也可以含有另外的遗传元件。可以包括在构建体内的元件类型没有任何形式的限制，并且可以由本领域技术人员选择。例如，附加的遗传元件可以包括报导基因，例如一种或多种用基因，用于诸如GFP或RFP的荧光标记蛋白；易于4全测的酶，例如(3-半乳糖香酶，荧光素酶，(3-葡萄糖苷酸酶，氯霉素乙酰转移酶或分泌的胚胎石咸性磷酸酶；或可以容易地获得用于免疫检测的蛋白，例如激素或细胞因子。可以用于本发明实施方案的其它遗传元件包括那些编码可以赋予细胞以选择性生长优势的遗传元件，例如腺苷脱氨基酶，氨基糖苦磷酸转移酶，二氢叶酸还原酶，潮霉素-B-磷酸转移酶，药物抗性，或提供营养缺陷型所丟失的生物合成能力的蛋白的编码基因。如果一起包括报导基因与l-xRNAi表达盒，则可以包括内核糖体进入位点(IRES)序列。优选地，另外的遗传元件可操作性地与独立的启动子/增强子连接并被其控制。另外，可以使用在细菌中用于构建体增殖的适合的复制起点。复制起始序列通常与l-x表达盒和其它要在相关细胞，组织，或器官中表达的序列相分开。这样的复制起始在本领域是公知的，并且包括pUC，CoIEI,2-微米(2-micron)或SV40复制起点。基于任何适当病毒的病毒递送系统可以用于递送本发明的1-xRNAi表达构建体。另夕卜，也可以使用杂合病毒系统。根据不同的参数选择病毒递送系统，例如递送入相关细胞，组织，或器官的效率，系统的转导效率，致病性，相关的免疫性和毒性，等等。已知没有单一的病毒系统适合于所有应用。当选择在本发明中使用的病毒递送系统时，选择系统重要的是，其中，含有1-xRNAi表达构建体的病毒粒子优选地为l)可复制性和可稳定增殖；2)可以纯化到高滴度；和3)可以介导靶向递送(将1-xRNAi表达构建体递送到相关细胞，组织，或器官，而没有广泛扩散)。通常，在基因治疗中五个最常用的病毒系统种类根据其基因组是否被整合入宿主细胞染色质(肿瘤逆转录病毒和慢病毒)或主要作为染色体外游离体持续存在于细胞核中(腺相关病毒，腺病毒和疱渗病毒)可以被分为两类。如果在活跃地分裂的细胞中需要维持稳定的遗传改变，则将选择整合载体为工具。例如，在本发明的一个实施方案中，使用来自细小病毒科的病毒。细小病毒科是小单链，非包膜DNA病毒家族，其基因组约为5000核苷酸长度。包括在该家族中的成员为腺相关病毒(AAV),依赖型细小病毒，其根据定义需要与另一病毒(通常为腺病毒或疱渗病毒)共感染以启动和维持增殖性的感染循环。在缺乏这种辅助性病毒时，AAV仍然可以通过受体介导的结合和内在化而感染或转导靶细胞，穿入分裂细胞或非分裂细胞中的细胞核。一旦在细胞核中，病毒去衣壳，并且转基因以不同形式被表达一最稳定的形式为环状单体。AAV被整合入1-5%的被稳定转导的细胞基因组中(Nakai,等人，J.Virol.(病毒学杂志)76:11343-349(2002)。转基因表达的表达可以异常的稳定，并且在一个与AAV—起递送IX因子的研究中，在一单次与病毒直接融合后，狗模型持续表达治疗水平的蛋白超过5.0年。因为在缺乏辅助病毒时，AAV感染不产生后代病毒，转导的范围被限制为仅感染病毒的原始细胞。正是该特征使AAV成为本发明优选的基因治疗载体。另外，与反转录病毒，腺病毒，和单纯疱渗病毒不同，AAV显示出缺乏对人的致病性和毒性(Kay,等人，Nature(自然)424:251(2003)和Thomas,等人，NatureReviews,Genetics(自然综述，遗传学)4:346-58(2003))。通常，AAV的基因组只包括两个基因。"rep"基因编码至少四种独立的在DNA复制中使用的蛋白。"cap"基因产物被不同地剪切以产生含有病毒衣壳的3种蛋白。当将基因组包装入新生的病毒时，只有反转末端重复序列(ITRs)是必需的序列；rep和cap可以从基因组被删除，并且被所选择的异质序列取代。但是，为了产生复制和包装基于AAV的异质构建体进入新生的病毒粒子所需要的蛋白，必需以反式提供rep和cap蛋白。通常通过与辅助病毒共感染提供辅助功能，例如可以以一种或多种DNA表达质粒的形式以反式提供上文提及的腺病毒或疱渗病毒。由于基因组通常只编码两种基因，并不令人吃惊的是，作为递送载体，AAV包装能力被限制在单链4.5千碱基(kilobases)(kb)。但是，尽管该大小限制可以限制被递送用于替换基因治疗的基因，其对短序列例如RNAi的包装和表达没有副作用。在实验中说明了在RNAi应用中的AAV的用途，其中AAV被用于将shRNA体外递送以抑制p53和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)8的表达(Tomar等人，Oncogene(癌基因)22:5712-15(2003))。在将适当的序列克隆入被限制性内切酶消化的AAV-2载体后，在HEK293细胞中产生AAV病毒粒子并用于感染HeLaS3细胞。结果表明内源性的Caspase8和p53水平呈剂量依赖性降低。Boden等人也使用AAV对shRNA进行体外递送以抑制HIV在组织培养系统中的复制(Boden,等人，J.Virol.(病毒学杂志)77(21):115231-35(2003)),其通过在耗尽培养基中的p24产生进行评价。但是，当使用AAV作为l-xRNAi表达构建体时，必须克服技术障碍。例如，各种百分比的人群可以具有抗特定AAV血清型的中和抗体。但是，由于存在有几种AAV血清型，对于其中的一些血清型，具有中和抗体的个体的百分比大大减少，可以使用其它的血清型，或使用假型包装(pseudo-typing)。至少存在十种不同的已经被鉴定出的血清型(参见De等人MolTher(分子治疗).2006Jan;13(l):67-76),还有许多其它被分离出的但是缺少详细描述的血清型。另外一个限制是由于针对AAV的可能的免疫应答的结果，基于AAV的治疗可能只进行一次；但是，作为可选择的使用，非人类来源的血清型可能重复被使用。用药途径，血清型，被递送的基因组的成分都影响组织特异性(参见，例如Zhu等人，Circulation(循环).2005Oct25;112(17):2650-9)。在使用伴有l-xRNAi表达构建体的未修饰的AAV系统的另一个限制是转导可能是低效的。在体内的稳定的转导可能在细胞的5-10%的限度内。但是，不同的提升稳定转导水平的方法在本领域是公知的。一种途径是使用假型包装，其中用衍生于其它血清型的cap蛋白包装AAV-2基因组。例如，通过用AAV-5cap基因替代其AAV-2副本，Mingozzi等人将稳定的转导增加到肝细胞的约15%(Mingozzi，等人，J.Virol(病毒学杂志)76(20):10497-502(2002))。Thomas等人，使用AAV8衣壳基因转导小鼠肝细胞超过30%(Thomas,等人，JVirol.(病毒学杂志)2004Mar;78(6):3110-22)。Grimm等人(Blood.(血液)2003-02-0495)用尽用于组织培养研究的AAV-1,AAV-3B，AAV-4,AAV-5,和AAV-6以假型包装AAV-2。通过用AAV-6假型包装的病毒体诱导了最高水平的转基因表达；产生高于AAV-2几乎2000%的转基因表达。因而，本发明欲使用假型包装的AAV病毒以达到较高的转化水平，同时相应增加了l-xRNAi表达构建体的表达。根据本发明的实施方案，也可以使用自我互补的AAV载体。在标准AAV载体和自我互补载体之间最显著的区别是其基因组的形式和包装的大小。标准AAV载体具有4.6Kb的单链DNA,而自我互补AAV载体具有2.3Kb的双链DNA。通过在反转末端重复序列(ITR)中的一个中导入突变/删除可以将AAV载体转换为自我互补载体。每一个AAV基因组具有两个这样的位于5'和3'端的重复。复制通常在ITR中的一个处起始并通过整个基因组开始，并在另一个ITR解离。正是由于该原因，AAV载体含有正链或负链的基因组。最有效控制转录解离的序列是D-序列和终止解离位点(trs)。这些序列位点位于AAV2基因组的第122-144核苷酸之间(Wang等人(20(B)GeneTherapv(基因治疗)10:2106-2111),以及删除它们不能使转录在ITR解离。应该注意的是，由于AAV载体的ITR几乎等同，在两个ITR中任一个可以删除D-序列和trs。删除ITRD-序列和trs的结果是，延伸的复制复合体不再解离，并且复合体以相反于原始方向的方向延伸，即，如果复制复合体首先产生正链，则其在被删除的ITR处不能解离，并接着产生与正链互补的负链。这接着产生将被包装入AAV载体中的自我互补双链DNA分子，只要其长度不超过2.3kb,并且优选地更短。应该注意的是，由于AAV载体的ITR在复制过程中重新结合，可以产生回复体表型，即恢复到野生型序列的两个ITR。为了弱化这一问题，必需使用不同类型的AAV载体的ITR。例如，AAV2左ITR与AAV4删除的右ITR,等。控制选择要被结合的ITR唯一标准在于ITR血清型之间的序列一致性。血清型2和5的ITR几乎等同，以及血清型2和4的ITR具有81.6%的相似性。在删除D序列和trs之后，AAV2和AAV4的ITR之间的序列一致性下降到恰好超过50%。这两个ITR的结合因而产生分化的ITR的良好结合，并将产生自我互补的、不再重新产生具有野生型ITR的后代的AAV载体。凭借其高效地转导细胞的能力，自我互补载体比单链载体具有非常大的优势。当被AAV8的包膜蛋白假型包装化后，AAV载体显示出可以转导95%以上的被耙向的肝细胞(参见Nakai等人JVirol.(病毒学杂志)2005Jan;79(l):214-24和Grimm等人，JVirol.(病毒学杂志)2006Jan;80(l):426-39)。另一个可用于本发明l-xRNAi表达构建体的病毒递送系统是基于来源于反转录病毒科的病毒的系统。反转录病毒包括单链RNA动物病毒，其具有两个独特的特征。首先，反转录病毒的基因组是二倍体，由两个拷贝的RNA组成。第二，此RNA通过病毒体相关酶反转录酶被转录为双链DNA。之后该双链DNA或前病毒被整合入宿主基因组，并作为宿主基因组稳定整合的成分从父代细胞被传递至子代细胞。在一些实施方案中，慢病毒属是转录病毒科的在本发明中使用的优选成员。慢病毒载体经常由疱渗性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)假型包装化，并衍生于人类免疫缺陷性病毒(HIV),即人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子；梅迪和维斯纳病毒(visan-maedi),其在绵羊中引起脑炎(绵羊脱髓鞘性脑白质炎)或肺炎；马感染性贫血病毒(EIAV),其在马中引起自身免疫溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV),其在猫中引起免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其在牛中引起淋巴结病和淋巴球增多；以及猿免疫缺陷病毒(SIV)，其在非人的灵长类动物中引起免疫缺陷和脑病。基于HIV的载体通常保持<5%的父代基因组，并且<25%的基因组被整合入包装构建体中，其使产生能够回复复制的HIV的可能性最小化。通过开发自我灭活载体进一步增加了生物安全性，所述载体在长末端重复序列的下游具有调节元件的删除，除去了对于载体动员是必须的包装信号的转录。反转录病毒RNA基因组的反转录在细胞质中发生。与C-型反转录病毒不同，慢病毒属cDNA与其它病毒因子相复合一已知的启始前复合体—可以穿过核膜移动位置，并转导非分裂细胞。病毒cDNA的结构特征—DNA臂(flap)—似乎带来高效的核输入。所述臂依赖于位于病毒聚合酶基因内的中央聚。票呤区(cPPT)的完整性，所以大多数慢病毒-衍生载体都保持了该序列。慢病毒具有广泛的细胞嗜性，低炎症潜能，并产生完整的载体。主要的限制是在一些应用中整体可能诱导癌形成。应用慢病毒载体的主要优势是基因转移在大多数组织或细胞类型中持久。用于表达ddRNAi因子的以慢病毒为基础的构建体优选地包括自慢病毒5'和3'LTR的序列。更优选地，病毒构建体包括被灭活的或自我灭活的源自慢病毒的3'LTR。可通过在本领域任何已知方法进行3'LTR的自我灭活。在一个优选的实施方案中，3'LTR的U3元件包括删除其增强子序列，优选地为TATA盒，Spl和NF-KB位点。作为自我灭活3'LTR的结果，整合入宿主细胞基因组的前病毒将包括一皮灭活的5'LTR。LTR序列可以是来自任何种的慢病毒的LTR序列。以慢病毒为基础的构建体也可以结合用于MMLV或MSCV,RSV或哺乳动物基因的序列。另外，源自慢病毒5'LTR的U3序列可以被病毒构建体中的启动子序列所替代。这可以增加从包装细胞系获得的病毒的滴度。也可以包括增强子序列。本领域技术人员已知的其它的病毒或非病毒系统也可以用于将本发明的1-xRNAi表达盒递送至相关细胞，组织或器官，包括但不限于基因删除的腺病毒-转座子载体，所述载体通过整合入宿主细胞在体内稳定地保持病毒编码的转基因(参见Yant,等人，NatureBiotech(自然生物技术).20:999-1004(2002));衍生于辛德毕斯(Sindbis)病毒或塞姆利基森林(Semlikiforest)病毒(参见Perri,等人，J.Virol.(病毒学杂志)74(20):9802-O7(2002))的系统；衍生于新城疫病毒或仙台(Sendai)病毒的系统;或缺乏细菌DNA序列的小环状DNA(mini-circleDNA)载体(参见Chen,等人，MolecularTherapv(分子治疗).8(3):495-500(2003》。如在美国专利出版物2004/0214329所描述的小环状DNA公开了提供持续高水平蛋白的载体。环状载体的特征在于缺乏表达静息的细菌序列，并且包括单向的位点特异性的重组产物序列以及表达盒。另夕卜，杂合病毒系统可以用于将两种或更多种病毒系统的特点结合起来。例如，野生型AAV的位点特异性的整合机制可以伴以腺病毒的高效内在化和核耙向特点。在存在腺病毒或疱渗病毒时，AAV经历高产量复制循环；但是，在缺乏辅助子功能的情况下，AAV基因组整合入染色体19上的特异性位点。AAV基因组的整合需要AAVrep蛋白的表达。由于通常的rAAV载体被删除了病毒包括rep的所有基因，它们不能特异性地整合入染色体19。但是，可以在适当的杂合系统中开发该特征。另外，非病毒遗传元件可以用于达到病毒递送系统中所理想的特性，例如能够允许进行位点特异性重组的遗传元件。在图1步骤400中，l-xRNAi表达构建体被包装入病毒粒子。本领域任何公知方法可以用于产生感染性病毒粒子，所述病毒粒子的基因组包括病毒l-xRNAi表达构建体的一份拷贝。图3A和图3B显示可选择用于将本发明的l-xRNAi表达构建体包装入病毒粒子以进行递送的方法。图3A中的方法利用能以反式稳定表达病毒蛋白，以及其它的对于具体的病毒递送系统是必需或优选的序列(例如，复制、结构蛋白和病毒装配所需的序列)，和用于进入组织的或衍生于病毒或人工的配体的包装细胞，所述病毒蛋白对于将病毒1-xRNAi表达构建体整合入病毒粒子而言是必需的。在图3A中，l-xRNAi表达盒被连接于病毒递送载体(步骤300),并且生成的病毒l-xRNAi表达构建体被用于转染包装细胞(步骤410)。之后包装细胞复制病毒序列，表达病毒蛋白，并且将病毒1-xRNAi表达构建体包装入感染病毒粒子(步骤420)。包装细胞系可以是能够表达病毒蛋白的任何细胞系，所述细胞系包括但不限于293,HeLa,A549,PerC6，D17,MDCK,BHK，bingcherry,phoenix,Cf2Th,或由本领i或4支术人员所^>知或开发出的任何其它细胞系。一种包装细胞描述在例如美国专利6,218,181中。可选择地，不稳定表达必需的病毒蛋白的细胞系可以与两种或多种构建体共转染以达到功能粒子的高效生产。构建体中的一种包括病毒1-xRNAi表达构建体，其它质粒包括编码蛋白的核酸，所述蛋白对于细胞产生功能性病毒(复制和包装构建体)以及其它辅助功能而言是必需的。在图3B显示的方法利用不能稳定表达病毒复制和包装基因的细胞进行包装。在这种情况下，l-xRNAi表达构建体被连接于病毒递送载体(步骤300),之后与一种或多种表达对于感染病毒粒子复制和生产是必需的序列的载体共转染(步骤415)。细胞复制病毒序列，表达病毒蛋白并将病毒RNAi表达构建体包装入感染病毒粒子(步骤420)。包装细胞系或复制和包装构建体可以不表达包膜基因产物。在这些实施方案中，可以在单独的、与病毒l-xRNAi表达构建体共转染的构建体上提供编码包膜基因的基因。包膜蛋白部分负责病毒粒子的宿主范围，病毒可以被假型包装。如前文所述，"假型包装，，病毒是这样一种病毒粒子，它的包膜蛋白来自不同于产生其基因组的病毒的一种病毒。本领域技术人员可以选择适当的假型包装用于所使用的病毒递送系统和待革巴向的细胞。除了赋予具体的宿主范围，所选择的假型包装可以允许要被浓缩的病毒达到非常高的滴度。病毒可选择地用限制对具体种类感染的单嗜性包膜蛋白进行假型包装化(例如单嗜性包膜只可以感染，例如鼠细胞，双嗜性包膜可以感染，例如人和鼠细胞)。另外，遗传修饰的配体可以用于细胞特异性靶向，例如肝细胞用脱唾液酸糖蛋白，或用于受体介导结合用转铁蛋白。在包装细胞系中生产之后，纯化和定量(滴定)含有l-xRNAi表达盒的病毒粒子。纯化策略包括密度梯度离心，或优选地，柱层析方法。在图l的步骤500中，l-xRNAi表达构建体被递送至相关细胞，组织，或器官。本发明的1-xRNAi表达构建体可以在体外(&)或离体()被导入细胞内，之后一皮放入动物体内以实现治疗，或通过体内用药直接给药至生物体，器官或细胞。通过病毒感染的递送是优选的递送方法；但是，可以使用任何适当的方法递送l-xRNAi表达构建体。使用任何常规的方法可以将含盒的载体用药于哺乳动物宿主，其中在本领域已知有大量不同的这样的方法。装配有适当的启动子和终止子，例如源自T7或T3噬菌体的启动子和终止子，或本领域技术人员已知的其它的启动子和终止子的1-xRNAi表达构建体可以用于模板的体外转录。因而，可以在体外生产长度可变的RNA发夹分子(具有2,3,4或更多个功能性的单个发夹)，可以根据下文对其进行纯化和给药。可以有各种技术用于将核酸递送入细胞并且是公知的，例如脂质体或胶束-介导的转染或转化，用减毒病毒粒子转化细胞或细菌细胞，对本领域技术人员是公知的细胞接合，转化或转染步骤或微注射。最普通的转染试剂是能够穿越细胞膜的带电的亲脂性化合物。当它们与核酸混合时，它们可以携带DNA穿越细胞膜。可以商业获得大量的这样的化合物。聚乙烯亚胺(PEI)是一类新的转染试剂，其化学特性明显不同于以类似方式作用的亲脂性化合物，但是具有可以穿越核膜的优势。这样的试剂的一个实例是ExGen500(Fermentas)。可以在合成的脂质体或胶束内以线性片段包装根据本发明的构建体或合成基因以用于递送入耙细胞。使用电穿孔法可以转化组织培养细胞。这是考虑到在细胞膜上产生瞬间的孔，DNA或RNA通过这些孔进入细胞。另夕卜，使用试剂例如PEG或磷酸4丐可以化学转化动物细胞。可选4,地，可以通过其它途径，包括樣t注射或嚢泡融合将含有l-xRNAi表达盒的ddRNAi表达构建体导入到相关细胞，组织或器官。如Furth等人Anal.Biochem.(分析化学)115(205):365-368(1992)所描述，也可以使用注射进行肌肉内用药。可以将核酸涂敷在金微粒子上，并通过粒子轰击装置经皮内递送，或根据文献(参见，例如，Tang等人，Nature(自然)356:152-154(1992》中描述的"基因枪，，，其中金微粒被涂敷以DNA,之后被轰击进入相关细胞，组织或器官。另一种用于本发明方法的递送方法包括使用授权给Davis等人的美国专利6,509,323中所描述的CyclosertTM技术。CyclosertTM技术平台是基于被称为环糊精的糖的杯状环形重复分子。环糊精分子的"杯"可以与其它分子形成"包含复合体"，使其可以用其它部分结合Cyclosert聚合物以提高稳定性或增加靶向配体。另外，发现环糊精脉内用药药物的溶解性)，并且可以以低成本大量购得制药级别的环糊精。这些聚合物有非常高的水溶性，在治疗剂量上甚至重复用药时是非毒性和非免疫原性的。聚合物可以容易地适应以显著高于脂质体的药物荷载携带广范围的小分子治疗剂。含本发明l-xRNAi表达盒的载体可配制成注射制剂，或通过在水性溶剂或非水性溶剂，例如油，合成的脂肪酸甘油酯，高级脂肪酸或丙二醇的酯中溶解，悬浮或乳化用药；并且如果需要，伴以常规的添加剂，例如增溶剂，等渗剂，悬浮剂，乳化剂，稳定剂和防腐剂。另外，可以通过与适当的，制药学可接受的载体或稀释剂结合，将含有本发明RNAi表达盒的载体制备成药物组合物。在制药学剂型中，含有l-xRNAi盒的载体可以被单独用药或与其它制药学活性化合物结合用药。实施例为选择由本发明1-xRNAi盒定向的候选序列，对所有发表的独立全长的或接近全长的HCV序列进行对比；目前可获得约100个这样的代表所有基因型的序列。目前存在有几个用于选择和开发RNAi治疗剂的候选区域，并且被详细地记载5'和3'UTR区在HCV基因组中属于最为高度保守的区域之列。尽管考虑到由于与细胞转移复合体蛋白或调节蛋白的空间位阻的可能，这些非编码序列可能不代表靶向的最佳序列，Yokota等人已经鉴定出定向复制子系统中的5'UTR的高度功能性的RNAi(EMBORep.(欧洲分子生物学学会报导)4(6):602-608(2003))。尽管其有利于鉴定出在单独21个核苦酸段(在shRNA种类中靶向序列相对应的大小)内具有绝对一致性的几个区域，目前的分析显示在特定基因型的不同亚型内不出现这样的保守程度，更不用说全部的基因型。因而，选择可以包括基因组的片段，在所述片段中，大于80%的区域保持绝对的保守。三个独立的shRNA的表达补偿了序列变异性，可以允许包含在单一递送载体中的结合治疗。可选择地，如果没有鉴定出在所有HCV基因型分析中满足选择标准的保守区，序列分析可以限定到基因型l(la和lb),其在美国的感染人群占到近3/4,除非洲外，其在全世界是优势基因型。另外，当前最有效的抗HCV治疗，即聚乙二醇干扰素(pegylateinterferon)与利巴韦林(鸟噤呤核苷类似物)的结合，对抗基因型l相当没有效力，但是抗其它基因型具有高度效力。因而，其它可选择疗法的最大需要存在于最多数的病人群中。由于序列对比只显示出同源性，在选择要进行测试的最终RNAi因子时，使用其它选择标准，例如GC相对含量和查询序列数据库时的交叉特异性的缺乏。例如，对于一个实验，对来自HCV亚型la和lb的多个序列进行对比。鉴定出一些保守区，从该区域有足够的长度以选择用于检测的RNAi因子(>19核苷酸)。5'NTR和3'NTR区是最保守的区域。由于被鉴定出的同源区相当长，在不同亚型之间也进行对比。结合两种对比可以选择普遍保守的区域。去除一些区域免于考虑，例如A或U,或G和C的长段区，剩下"合格的"区域进行进一步选择。在所考虑的HCV的所有基因型的整个编码区(开放阅读框)中只鉴定出一个普遍保守的区域；因此，在大多数情况下所选择的用于定向的序列是在亚型la和lb中保守的序列。一旦鉴定出"合格的"区域，应用RNAi因子反义链5'端的自由能应该低于3'端的标准选择单个的RNAi序列。使用"邻近配对自由能"规则以计算迄今为止选择的所有潜在的RNAi因子的5'和3'两端的末尾五个核苷酸的自由能。结果是，鉴定出56个潜在的RNAi因子三十个在5'NTR(5'-n)，十二个在开放阅读框(c-n),以及十四个在3'NTR(3'-n)(参见表1)。序列号1-10和31-50的序列的位置在图7中示意性地示出。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>C6-C9國C12-3'1编码-6,编码-9,编码-12,3'1实施例l:抗疾病或功能紊乱的l-xRNAi表达盒的选才奪和4企测用作抗疾病或功能紊乱的治疗剂的shRNA的选择不是一个直截了当的主题。除了在治疗病毒感染中出现逃逸变异抹，病毒和癌基因的高突变率在感染个体的种群中导致相当大程度序列分化。例如，感染肝炎病毒的个体可以携带基因型不同的病毒，其核苷酸序列有31-34%的不同，并且亚型(在给定的基因型内的种)基于全长基因组序列的比较可以有20-23%的不同。因而，对于HCV,鉴定出高度保守的病毒基因组区域并选择以保证最广泛的治疗剂应用。为选择候选序列，将所有发表的独立全长或接近全长的序列进行排列比较。总结分析结果，得出候选RNAi序列的列表。为了根据相对的力度对序列进行分级，检测单个的预合成的RNAi因子抑制靶基因活性的能力。当定向癌基因、发育基因等类似基因时，使用同样的方法。为检测所选RNAi因子的效力，通过标准技术和试剂将预合成的RNAi因子转染入相关细胞，组织或器官。不相关的RNAi种类被转染入平行的一套培养皿中以作为阴性对照。通过包含入转染混合物的末端标记有荧光素酶或藻红蛋白的小量非特异性的RNAi监控转染效率。在下调效力分析之前通过荧光显微镜相对转染效率进行测量。在转染后的不同时间点，通过多种方法之一测量靶基因活性。单个地，以及在本发明的l-xRNAi盒的背景中选择和测量高度功能性的ddRNAi因子。在使用l-xRNAi表达盒的实施方案中，验证RNAi因子，并且每一相关shRNA的编码序列由长的、互补的自我退火的寡核苷酸产生并一皮克隆入l-xRNAi盒的单个位点。根据本文描述的方法，之后该盒被插入进病毒载体，并且之后该构建体被包装入病毒粒子。由于l-xRNAi表达盒每一shRNAi组分的总长度较短(~70个核苷酸)；将达五个RNAi组分连在一起产生小于等于大约350个核苦酸的长度，并且甚至包括l-xRNA表达盒的启动子和终止子，总长度远远低于例如，自我-互补AAV和其它病毒的有效负荷极限的上限。在Huh-7细胞上检测病毒粒子的抑制活性。表达不相关shRNA种类的l-xRNAi构建体的产生用于阴性对照。通过上述的分析技术监控shRNA序列的效力。实施例2:1-xRNAi表达构建体的开发1-xRNAi表达构建体的构建包括启动子，所述启动子驱使三个或更多个单一的shRNA种类以类似充分的水平表达。由RNA聚合酶III(polIII)在pol111-特异性启动子的控制下指导小核RNA和转运rRNA的合成。由于由这些调节元件指导的相对高丰度的转录，polIII启动子，包括这些衍生于U6和HI的基因被用于驱动l-xRNAi的表达。(参见，例如Domitrovich和Kunkel.Nucl.AcidsRes.(核酸研究)31(9):2344-52(2003);Boden,等人Nucl.AcidsRes.(核酸研究)31(17):5033-38(2003a);和Kawasaki,等人Nucl.AcidsRes.(核酸研究).31(2):700-7(2003))。在图4显示了使用U6启动子4全测1-3RNAi表达构建体(#251-#256)。它们包括三个定向HCV基因组不同区域的RNAi因子。在盒中的序列是不同的以为了检测siRNA功能所需要的不同结构的要求。在图4中，根据预先建立的控制RNA干扰机制作用的技术，在每一构建体下方列出了预期的结果。预期的成功的siRNA功能结果显示为"+",以及预期的不成功的siRNA功能结果显示为"-"。在预期结果产生失败的情况下，该预期的原因是由于序列删除或错配。问号标记显示问题可能是或不是足够显著以终止发夹构建体的活性。为检测所选择的RNAi序列的效力，本发明l-xRNAi表达构建体与Luc-HCV报导子质粒一起被直接递送到培养细胞。所使用的Luc-HCV质粒是在图7显示的构建体，并且包括与各种100,90,80,70,60，50,40,30或20bp的HCV耙序歹'J(注意对于在一个寺艮导子中的多个草巴，100Bp是正确的，同时，对于大多数单一的草巴报导子，此序列相应于靶在5'和3'端加上5个核苷酸)融合的荧光酶序列，其中RNAi序列从所述HCV靶序列衍生出。定向于lOObp以内的序列片段的RNAi因子，如果有效，将降解HCV-焚光素酶转录产物，因而降低(可能消除)荧光素酶的表达。表1列出了RNAi因子，对其中一些进行了检测。表2列出了一些相关的Luc-HCV报导子质粒和所使用的定向HCV靶区域。图7显示了表1中的RNAi因子的靶目标的HCV基因组中位置的示意图。如图5和6所示，通过共转染荧光素酶报导子活性的降低在体外评价每一个1-xRNAi构建体的相对强度。使用标准的技术将测试和报导子构建体转染入许可的细胞。在图8中示出的Luc-融合报导子质粒被与图4中的编码三个发夹shRNA种类的表达质粒共转染入Huh-7细胞。用于海肾荧光素酶表达的质粒也被包括进去用以规格化样品到样品的转染效率。在每一个状况下使用总数萨4的独立的转染。在转染后72小时，收获样品并分析萤火虫的荧光素酶活性的相对水平。含有驱动抗5'-8或C-12靶序列的单一shRNAU6表达的启动子的质粒作为这些实验的阳性对照，含有U6启动子，但没有下游shRNA序列的质粒，作为阴性对照，因此被作为标准，通过其评价由从单一或三个发夹质粒表达的shRNA诱导的抑制水平。含有定向于HCV的5'UTR的5'8区域和编码12区域的RNAi的1-3RNAi构建体与含有5'8或cl2靶位点的荧光素酶HCV报导子质粒共转染。只有当发夹定向于如预期形成的相对应的靶位点时(即在预期的发夹中只有一个或没有错配)，荧光素酶的活性才被有效抑制。实施例3.三个发夹的构建体的体内评价使用水力尾静脉注射方法，通过鼠肝细胞与适当的luc-融合报导子质粒和1-3RNAi构建体251，252,253,254,255,256,阳性对照质粒，或阴性对照质粒共转染体内评价三个发夹的构建体。另外，用表达人al抗胰蛋白酶(a1-AT)的质粒注射小鼠，所述al抗胰蛋白酶被用于转染效率的规格化。注射后48小时，收集动物血清，处死动物，收获肝脏。使用Promega公司荧光素酶试剂盒分析肝裂解物的萤火虫的荧光素酶活性，并且使用ELISA分析血清样本的al-AT。相对于阴性对照评价由从发夹构建体表达的l-xRNAi的诱导的抑制水平。实施例4l-xRNAi表达盒也可以用作模板生产RNAi种类，通过使用前述核酸递送技术中的一种可将所述RNAi种类直接定向给药于细胞或组织。为显示这种类型方法的应用，将T7启动子导入含有三个shRNA发夹的l-xRNAi表达盒的上游，所述shRNA发夹,皮定向于含有HCV5'-8，5'6或C-12靶序列的独立的报导子构建体。为了使用失控转录技术以在体外产生含有RNAi序列的RNA，使用限制性内切酶消化制备模板，导致正好在l-xRNAi表达盒的下游质粒被切开。T7RNA聚合酶被加入反应用于产生含有1-x表达盒序列的RNA转录产物。在当前的实施例中，使用亲脂化合物作为转染试剂，失控转录物被以各种浓度与一套浓度的一系列的相关荧光素酶报导子构建体一起被导入细胞。编码海肾的荧光素酶蛋白的单独DNA质粒表达物被用于不同样品间的转染效率差异的规格化。在每一状况下使用总量N=4的转染，并用一套样品计算每一报导子构建体的抑制百分比，所述样品用只包含适当的报导子构建体和海肾质粒的混合物转染。结果如图9所示，显示通过体外转录的l-x表达构建体所有三个报导子构建体呈剂量依赖性降低。通过不可靶向的报导子构建体(C91uc融合)监控非特异性的抑制，并且显示响应体外转录的三重发夹的抑制非常低。尽管本发明已经参照具体的实施方案进行了描述，然而本领域技术人员应该懂得，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种变化和等同替代。另外，可以进行许多修正以适应针对本发明的目的、精神和范围的具体情况、材料或方法。所有这样的修正都将位于本发明的范围内。在本文引用的所有参考文献是为了帮助理解本发明，并且被全文并入以用于没有限制的所有用途。权利要求1.一种包含RNAi表达盒的遗传构建体，所述RNAi表达盒包含一个启动子和x个RNAi构建体，其中x为二或更多。2.根据权利要求1所述的遗传构建体，其特征在于，x为2，3,4,或5。3.根据权利要求1所述的遗传构建体，其特征在于,所述xRNAi构建体提供x个RNAi因子，并且所有x个RNAi因子彼此具有不同的序列。4.才艮据权利要求1所述的遗传构建体，其特征在于，RNAi构建体提供RNAi因子，并且包括两个或更多个由一个或多个间隔子区分隔开的茎-环结构。5.根据权利要求4所述的遗传构建体，其特征在于，RNAi因子被表达为shRNA。6.根据权利要求4的方法，其特征在于，RNAi因子耙向保守的基因序列区域。7.根据权利要求4的方法，其特征在于，RNAi因子靶向HCV基因组的多个区域。8.根据权利要求4所述的遗传构建体，其特征在于，RNAi因子革巴向如序列1-56中任意序列所显示的一种或多种序列。9.根据权利要求1所述的遗传构建体，其特征在于，RNAi表达盒进一步包括终止子。10.根据权利要求9所述的遗传构建体，其特征在于，启动子和终止取自同一基因。11.一种修饰一种或多种基因的表达的方法，所述方法包括将包含RNAi表达盒的遗传构建体导入相关细胞、组织，或器官，所述RNAi表达盒包含一个启动子和x个RNAi构建体，其中x为二或更实夕。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，x为2,3,4,或5。13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，将遗传构建体导入到相关细胞、组织，或器官，包括将遗传构建体连接入病毒递送载体，以形成病毒RNAi表达构建体；将病毒RNAi表达构建体包装入病毒粒子；以及将病毒粒子递送到相关细胞、组织，或器官。14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，RNAi构建体提供RNAi因子，并且包括两个或更多个由一个或多个间隔子区分隔开的茎-环结构。15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，RNAi因子靶向保守的基因序列区域。16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，RNAi因子靶向HCV基因组的多个区域。17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，RNAi因子靶向如序列1-56中任意序列所显示的一种或多种序列。18.—种修饰一种或多种基因的表达的方法，所述方法包括将RNAi因子导入相关细胞、组织，或器官，所述RNAi因子是含有RNAi表达盒的遗传构建体的体外转录产物，所述RNAi表达盒包含一个启动子和x个RNAi构建体，其中x为二或更多。19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，RNAi因子靶向如序列1-56中任意序列所显示的一种或多种序列。20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，RNAi因子包括三个发夹结构，并且启动子为T7启动子。全文摘要本发明提供了适合于表达在体外或体内抗相关细胞、组织或器官中的1-xRNAi因子以治疗疾病或功能紊乱的组合物和方法。文档编号C12N15/113GK101180394SQ200680010811公开日2008年5月14日申请日期2006年2月3日优先权日2005年2月3日发明者A·A·科雷哈洛夫,D·A·苏海,L·科托,P·W·罗尔温克申请人:贝尼泰克有限公司