专利名称：与铵盐吸收相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域中的一种蛋白质及其编码基因与应用，特别涉及与 铵盐吸收相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
氮素是植物必须的矿质营养元素之一，是合成蛋白质、核酸和许多生物活性物质 的必需组分。氮素缺乏通常导致植物生长迟缓，成熟叶片失绿并伴随着花青素的积累(Diaz et al. ,2006, Plant Cell Physiology 47:74-83)。氮肥在农业生产中的大量使用极大地 提高了作物产量。当前全球每年施用大约8 9千万吨氮肥，经预测到2050年可增加至 2. 4 亿吨(Tilman et al. , 1999, Proc Natl Acad Sci USA96 :5995-6000)。能源费用的提 高导致了氮肥价格的不断上涨，从而增加了农业生产成本，同时氮肥的流失也在逐步恶化 生态环境。基于经济效益和环境保护的双重考虑，在现代农业生产中种植氮高效作物品种 已日益重要。玉米是重要的饲料、经济及生物能源作物，其在国际范围内的需求量与日俱增。 在我国玉米生产中，氮肥的施用量高、利用率低是普遍存在的现象(Ju et al. ,2009, Proc Natl Acad Sci USA, 106 =3041-3046) 0由于氮肥的大量施用，随之也带来了环境问题(张 维理等，1995，植物营养与肥料学报1( :80-87) 0种植氮高效的玉米品种，是解决氮肥利 用率低，降低生产成本，减小环境污染的有效途径，也是农业可持续发展和增强产品国际竞 争力的基本要求。传统选育新品种是个非常长期的过程，现如今基因工程，特别是玉米转基 因技术的成熟，使得我们有可能通过基因工程的手段快速获得氮高效品种，但是能否快速 有效地获得转基因氮高效新品种在很大程度上取决于是否具有良好的功能基因。大量研究表明，在适度低氮供应条件下，玉米氮高效的主要限制因子是氮素吸收 會邑力(Bohme, et al. ,2002, Isotopes in Environmental Health Studies 38:95—102)。 植物氮素吸收系统主要分为硝酸盐转运蛋白介导的硝酸盐吸收系统和铵转运蛋白介导的 铵盐吸收系统，另外还有很少部分可能通过尿素转运蛋白吸收。生理学研究结果表明植物 根内存在两种不同的氮素吸收系统高亲和和低亲和氮素转运系统(Wang et al.，1993， Plant Physiology 103 :1259-1267 ；Kronzucker et al.，1996，Plant Physiology 110 773-779)。当生长介质浓度较低时，根系吸收铵/硝依赖于高亲和系统，具有饱和动力学特 征(Km值通常低于100 μ Μ)。低亲和系统则在生长介质浓度达到毫摩尔范围才起主要作用。 铵盐的浓度在土壤中通常很低(不超过50 μ Μ)，所以土壤中铵盐的吸收主要依赖高亲和系 统。通过研究模式植物拟南芥得到的一系列证据表明，铵转运蛋白(AMT)介导了根系高亲 和力的铵的吸收(Gazzarrini et al.，1999，Plant Cell 11 :937-947 ；Yuan et al. ,2007, Plant Cell 19 :2636-2652) 0所以在生产上克隆和利用铵转运蛋白基因对于提高植物对 土壤中铵态氮素的吸收具有非常重要的实用价值。拟南芥中的铵转运蛋白AMT已经被克隆 并被美国专利保护(专利号分别United States Patent 6620610)。最近在小麦中的研究 结果发现水通道蛋白家族中的一个分支TIP2也具有高亲和铵吸收的功能，相应的3个成员TaTIP2 ；l，TaTIP2 ；2和TaTIP2 ；3也被美国专利保护(专利号:US20090005296)。在中国， 南开大学的王宁宁等人用AtPRP3启动子驱动拟南芥铵转运蛋白AtAMTl ； 1在拟南芥和番茄 中表达来提高转基因植物对氮素的吸收效率(中国专利号CN1737148)。而在玉米上，仅有 通过酵母功能互补系统从玉米根cDNA文库中筛选得到了一个玉米铵转运蛋白ZmAMTl ；1， 并申请了中国专利(申请号201010198912. 6)，除此之外，没有其它的玉米铵转运蛋白被 克隆，也没有其它的玉米铵转运蛋白的文章和专利报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与铵盐吸收相关蛋白，命名为ZmAMTl ；3，来源于玉米 属的玉米(Zea mays L.)，是如下1)或2)的蛋白1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与玉米铵盐吸收相关的由1)衍生的蛋白质。序列表序列1为ZmAMTl ；3的氨基酸序列，包括488个氨基酸，在该蛋白质序列中， 疏水氨基酸占139个，亲水氨基酸占281个，碱性氨基酸占37个，酸性氨基酸占27个，该蛋 白质的分子量为51. 8KD，等电点为7. 54。为了使1)中的ZmAMTl ；3便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组 成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列
权利要求
1.一种蛋白，是如下1)或幻的蛋白质1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与玉米铵盐吸收相关的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)-4) 中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列2自5’端第M4-1710位所示的基因；2)其核苷酸序列是序列表中的序列2；3)在严格条件下与1)或幻的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因。4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体的构建方法 如下是将权利要求2或3所述的基因插入pPT-Hyg表达载体的多克隆位点之间构成的重 组表达载体；所述pPT-Hyg表达载体是将潮霉素抗性基因插入pPTKan表达载体的多克隆位点之间 构成的载体。
7.一种培育转基因酵母的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的酵母中， 得到转基因酵母；所述转基因酵母对铵盐的吸收能力强于所述目的酵母。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述的编码基因是通过 重组载体导入所述目的酵母中的；所述重组载体的构建方法为将权利要求2或3所述的 基因插入PDR195载体的多克隆位点之间构成的重组载体。
9.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物中， 得到转基因植物；所述转基因植物对铵盐的吸收能力和/或生物量均高于所述目的植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述的编码基因是通过 权利要求5或6所述的重组表达载体导入所述目的植物中的。
全文摘要
本发明公开了一种来源于玉米的与植物根系铵盐吸收相关的蛋白ZmAMT1；3及其编码基因与应用。该蛋白是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与玉米铵盐吸收相关的由1)衍生的蛋白质。该蛋白的编码基因ZmAMT1；3在拟南芥中的表达可以显著增强拟南芥的铵吸收能力。本发明为农作物的铵高效吸收研究提供了更有特色的基因资源，在基因工程改良植物的营养高效性能研究中将发挥重要作用。
文档编号C12N15/63GK102146125SQ20101060623
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者张福锁, 段凤莹, 袁力行, 顾日良 申请人:中国农业大学