专利名称：Npm1基因突变检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体是NPMl基因突变检测方法及其试剂盒。
背景技术：
NPMl是一种广泛表达的磷蛋白质，其作用为在细胞核与细胞浆之间穿梭，可与 ALK, RARa和MLF-I等形成融合基因，参与多种白血病或淋巴瘤的发病。近来，多项研究显示46-62%的正常核型AML患者存在NPMl基因的突变，成为正常核型AML患者最常见的基因突变，而在异常核型AML患者中也有25%以上存在NPMl突变(BLOOD. 2006 107 4514-4523 ；BLOOD. 2007 109:874-885)。目前，国际上有报道的NPMl突变类型有30种以上，其中最常见的类型为12号外显子发生4个碱基的重复导致蛋白C端结构改变，A型 (TCTG插入)占接近80%，B型(CATG插入)占6%左右，D型(CCTG插入)占6%左右。携带NPMl突变的AML患者表现出NPMl蛋白异常的胞浆内分布(正常情况下分布于细胞核内)，多发生于女性，骨髓原始细胞比例、血LDH、白细胞及血小板计数高于野生型患者，其白血病细胞的CD34呈低表达或缺如。由于NPMl基因具有肿瘤抑制基因的功能，可调节p53 信号通路，有学者推测NPMl基因的突变可影响p53信号并进而导致遗传学不稳定性，因此 NPMl基因的突变使得AML细胞能够获得其它的遗传学改变。大约40%伴NPMl突变的AML 患者可同时检测到FLT3-ITD，不伴有FLT3-ITD而携带NPMl突变(NPMllmut/FLT3_ITDneg) 的患者治愈后良好。伴有NPMl突变的AML患者FLT3基因突变(包括ITD和点突变)的检出率大约是NPMl野生型AML患者的2倍。NPMl基因突变诊断对AML的诊断及分型具有重要临床意义。2007年，美国国立综合癌症网络(NCCN)将NPMl突变诊断作为AML患者检查项目，对于NPMl突变患者具有不同的治疗方案。目前，国内还没有对NPMl基因进行一个大标本量的检测，传统的检测方法只能检测A、B、D即12号外显子发生4个碱基的重复导致蛋白C端结构改变的突变类型。
发明内容
本发明正是针对以上技术问题，自行设计了 PCR扩增引物和测序引物，并研制了一种检测范围广，检测费用低，检测灵敏度高的NPMl基因突变检测方法及其试剂盒。本发明通过以下技术方案来实现本发明提供NPMl基因突变检测方法，包括以下步骤(e)提取待检样本的DNA ；(f)用自行设计的用于检测NPMl基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA进行PCR扩增；(g)用自行设计的用于检测NPMl基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的测序引物对步骤(b)中扩增后的DNA进行测序；(h)将步骤(c)中的测序结果与标准NPMl基因12号外显子开放阅读框进行比较， 并进行序列分析，即可找出突变类型与突变位点。
本发明根据人5号染色体基因组序列登录号NT_023133. 13设计NPMl基因12号外显子开放阅读框相关引物如下，NPMl基因12号外显子开放阅读框PCR扩增引物NPMlF 5' -TCGGGAGATGAAGTTGGAAGTA-3 ‘ (NT_023133. 13 :15648494 15648515)；NPMlR 5' -CATTTATCAAACACGGTAGGGA-3 ‘ (NT_023133. 13 :15648943 15648964)；NPMl基因12号外显子开放阅读框测序反应引物NPM1R2 :5，-GGACAGCCAGATATCAACT-3’ (ΝΤ_023133· 13 :15648899 15648917)。本发明还提供NPMl基因突变检测试剂盒，包括PCR Amplification Mixture ； Primer (sense, antisense) > HotStarTaq Sl^ffl^bBS^ Sequencing Mixture。本发明提供的NPMl基因突变检测试剂盒采用HotStarI1aq DNA Polymerase作为热启动酶，扩增反应体系为每50μ 1中含5μ 1的10倍扩增缓冲液、2 μ 1浓度为25mM的 Mg2+、2y 1浓度为IOmM的dNIPs、l. 5μ 1浓度为10 μ M的正向引物、1. 5 μ 1浓度为10 μ M的反向引物、0. 3μ 1的Taq DNA聚合酶、1 μ 1的DNA模板、余量为mH20，测序反应体系为4μ 1 的 BigdyeV3. 1、3μ 1 的 πιΗ20、1μ 1 浓度为 10 μ M 的 kquencing 引物(F，R)、2y 1 的 PCR 产物。本发明提供的NPMl基因突变检测试剂盒采用的扩增反应步骤为先95°C反应 15min，进入循环，循环中先94°C反应0. 5min,然后56°C反应0. 5min,然后72°C反应Imin为一个循环，共反应35个循环然后72°C反应7min，最后4°C保存。本发明提供的NPMl基因突变检测试剂盒采用的测序反应步骤为先94°C反应 0. 5min，然后50°C反应0. 5min，然后60°C反应2. Omin为一个循环，共反应M个循环。
具体实施例方式下面以几例检测到的新型突变样本为例对本发明做进一步说明。(a)提取待检样本的DNA ；(b)用自行设计的用于检测NPMl基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA进行PCR扩增；(c)用自行设计的用于检测NPMl基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的测序引物对步骤(b)中扩增后的DNA进行测序；(d)将步骤(c)中的测序结果与标准NPMl基因12号外显子开放阅读框进行比较，并进行序列分析，共找出两种新型突变，根据基因登陆号NM_002520 —种新型突变为在1016与1017位碱基之间插入ATCC，且1021与1022位碱基从AG置换为CC突变。一种新型突变为在1022与1023位碱基之间插入AGCC，且1026-10 位碱基从AGG置换为CCC 突变。此两种突变在国际国内上均属首次报道。
权利要求
1.本发明提供NPMl基因突变检测方法，包括以下步骤(a)提取待检样本的DNA；(b)用自行设计的用于检测NPMl基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA进行PCR扩增；(c)用自行设计的用于检测NPMl基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的测序引物对步骤(b)中扩增后的DNA进行测序；(d)将步骤(c)中的测序结果与标准NPMl基因12号外显子开放阅读框进行比较，并进行序列分析，即可找出突变类型与突变位点。
2.本发明根据人5号染色体基因组序列登录号NT_023133.13设计NPMl基因12号外显子开放阅读框相关引物如下，NPMl基因12号外显子开放阅读框PCR扩增引物NPMlF :5’ -TCGGGAGATGAAGTTGGAAGTA-3’ (NT_023133. 13 :15648494 15648515)；NPMlR :5’ -CATTTATCAAACACGGTAGGGA-3’ (NT_023133. 13 :15648943 15648964)；NPMl基因12号外显子开放阅读框测序反应引物NPM1R2 :5，-GGACAGCCAGATATCAACT-3’ (ΝΤ_023133· 13 :15648899 15648917)。
3.本发明还提供NPMl基因突变检测试剂盒，包括PCRAmplification Mixture ； Primer (sense, antisense) > HotStarTaq Sl^ffl^bBS^ Sequencing Mixture。
4.根据权利要求3述NPMl基因突变检测试剂盒，其特征在于NPMl基因突变检测试剂盒采用HotStarTaq DNA Polymerase作为热启动酶，扩增反应体系为每50 μ 1中含5 μ 1 的10倍扩增缓冲液、2 μ 1浓度为25mM的Mg2+、2 μ 1浓度为IOmM的dNTPs、1. 5 μ 1浓度为 ΙΟμΜ的正向引物、1. 5μ 1浓度为ΙΟμΜ的反向引物、0. 3μ 1的Taq DNA聚合酶、1 μ 1的DNA 模板、余量为mH20，测序反应体系为4μ 1的BigdyeV3. 1、3μ 1的πιΗ20、1μ 1浓度为ΙΟμΜ 的 kquencing 引物(F，R),2y 1 的 PCR 产物。
5.根据权利要求3述NPMl基因突变检测试剂盒，其特征在于NPMl基因突变检测试剂盒采用的扩增反应步骤为先95°C反应15min，进入循环，循环中先94°C反应0. 5min，然后 56°C反应0. 5min，然后72°C反应Imin为一个循环，共反应35个循环然后72°C反应7min， 最后4 °C保存。
6.根据权利要求3述NPMl基因突变检测试剂盒，其特征在于NPMl基因突变检测试剂盒采用的测序反应步骤为先94。°C反应0. 5min，然后50。°C反应0. 5min，然后60。V反应2. Omin为一个循环，共反应M个循环。
全文摘要
NPM1是一种广泛表达的磷蛋白质，其作用为在细胞核与细胞浆之间穿梭，可与ALK、RARα和MLF-1等形成融合基因，参与多种白血病或淋巴瘤的发病。NPM1基因突变诊断对AML的诊断及分型具有重要临床意义。本发明自行设计了PCR扩增引物和测序引物，并研制了一种检测范围广，检测费用低，检测灵敏度高的NPM1基因突变检测方法及其试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102382896SQ20111039916
公开日2012年3月21日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者费敏 申请人:苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公司