检测松材线虫的方法、检测引物及其lamp检测试剂盒的制作方法

检测松材线虫的方法、检测引物及其lamp检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测松材线虫的方法、检测引物及其LAMP检测试剂盒。本发明提供一种检测松材线虫的方法，包括：（1）提取松树木材样品中松材线虫DNA；（2）建立LAMP反应体系，进行环介导等温扩增；（3）根据扩增产物荧光或浊度的变化，判定松树木材样品中是否存在松材线虫。本发明还提供了一种操作简便、成本低、稳定性强的从松树木材中提取松材线虫DNA的方法。本发明进一步提供了检测松材线虫的特异性强、灵敏度高的LAMP引物组。本发明还提供了松材线虫LAMP检测试剂盒，包括：LAMP引物组，反应缓冲液，DNA链置换酶和荧光染料/特异探针。本发明检测试剂盒具有特异性强、灵敏度高、检测方便快捷等优点。
【专利说明】检测松材线虫的方法、检测引物及其LAMP检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及检测植物线虫的试剂盒，尤其涉及一种检测松材线虫(Bursphelenchus xylophilus)的方法、专用的LAMP检测引物及LAMP检测试剂盒,属于松材线虫的检测领域。
【背景技术】
[0002]松材线虫(Bursphelenchus xylophilus)病又称松树萎蔫病,可在短时间导致松树死亡，是松树上的一种毁灭性病害。该病寄主包括黑松、赤松和马尾松等数十种松属植物，也危害少数非松属针叶树(朱克恭，朱正昌，严敖金.松材线虫的流行与研究进展[c].中国松材线虫病的流行与治理[M].北京:中国林业出版社，1995.)。日本1905年首次报道了该病在长崎县引起松树大面积枯死。目前该病分布于美国、加拿大、墨西哥、葡萄牙、韩国、日本及中国等多个国家，其中在日本、中国和韩国发生最为严重(Khan F A, GbadegesinR A.0n the occurrence of nematode induecd pine wilt disease in Nigeria[J].Pakistan Journal of Nematology,1991(9):57-58.Mota M M, Braasch H, Bravo M A, etal.First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe[J].Nematology，1999，1:727-734.)。中国自1982年在南京中山陵首次发现该病短短30年时间里，疫情已扩大到江苏、安徽、广东、浙江、山东、福建、江西、广西、四川等16个省区，每年发生面积近10万hm2，累计致死松树5000多万株，直接经济损失25亿元，间接损失250亿元。因此，加强对松材线虫病的检疫，防止其远距离传播是治理松材线虫病工作的主要任务。
[0003]松材线虫检疫方法主要有形态学观察和分子生物学检测两种。形态学检测方法存在以下缺点:(1)由于寄主、环境、地理位置等外部因素的影响，松材线虫种内和种间的形态都有了较大的变化，作为形态鉴定特征重要依据的雌虫尾尖突、尾形、雄虫交合伞形状等常常会发生一些变化，给准确鉴定带来很大难度。(2)由于线虫形态学鉴定必需有具有专业知识人才和仪器设备的机构进行，致使形态学观察的应用范围受到很大的限制。随着分子生物学的发展，许多基于遗传物质的分子检测方法快速发展起来，由于其具有准确、快速、高效等优点，为有效地开展检测和控制工作提供了很好的方法，逐渐成为主要的检测方法之一。分子生物学检测方法不仅具有准确、快速、成本低的优点，而且由于可以直接从枯死松木中检出松材线虫,大大节省了时间 ，因此,近年来已被广泛应用于松材线虫的检疫检测工作中，具有非常好的应用前景。
[0004]松材线虫分子检测是通过分析松材线虫DNA特有的基因组区域而对其做出准确的鉴定。因此，获得高质量的松材线虫基因组DNA是分子检测过程中最关键的步骤。传统提取木片中松材线虫的方法为CTAB法，这种方法的主要缺点是:需要较多的样本、提取时间长、过程繁琐、必需在实验室进行、不能应用于野外环境，因此无法满足实际检测需要。公布号为CN 102016030 A的中国发明专利申请公开了一种直接从木片中提取松材线虫DNA的方法，这个方法虽然具有需要样品量少，检测时间短的优点，但存在检测试剂不易保存、检测费用昂贵的缺点。松材线虫病的检验检疫部门多在基层单位，试验条件相对较差，公布号为CN 102016030 A的专利申请使用的DNA提取液中含有酶类物质，必须_20°C保存，而偏远山区的检测检疫部门可能不具备试剂储存条件。另外，该申请方法使用的DNA提取试剂盒(ISOHAIR，nipp0ngene)价格昂贵(50元人民币/样品)，在实际工作中，检测样品量大，一般检测检疫部门无法承担使用这种方法产生的高昂检测费用。本领域迫切需要稳定性强、成本低、操作方法简便的从木块中提取松材线虫基因组DNA的方法。 [0005]环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术是针对革巴基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换型DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温65°C左右保温几十分钟快速进行核酸扩增的方法。由于其具有快速、简便、特异性好、灵敏度高、成本低等优点，已经应用于临床诊断、食品卫生检疫及基因芯片的开发。采用环介导等温扩增技术成功检测松材线虫的关键是需要针对松材线虫的靶基因设计出特异性强、灵敏度高的LAMP引物组，现有的用于检测松材线虫的LAMP引物组，不同程度的存在着特异性差、灵敏度低的缺陷，有待改进。

【发明内容】

[0006]本发明的目的之一是提供一种检测松材线虫的方法；
[0007]本发明的目的之二是提供用于检测松材线虫的LAMP引物组；
[0008]本发明的目的之三是提供检测松材线虫的LAMP检测试剂盒。
[0009]本发明的上述目的是通过以下技术方案来是实现的:
[0010]本发明首先提供了一种检测松材线虫的方法，该方法包括以下步骤:
[0011](I)从待检测的松树木材样品中提取松材线虫DNA ；(2)以提取的DNA为模板，加入包括LAMP引物组、Bst DNA聚合酶在内的组分建立LAMP反应体系，进行环介导等温扩增；
(3)根据扩增产物荧光的有无或浊度的变化，判定待检测的松树木材样品中是否存在松材线虫。
[0012]松材线虫分子检测是通过分析松材线虫DNA特有的基因组区域而对其做出准确的鉴定。因此，获得高质量的松材线虫基因组DNA是分子检测过程中最关键的步骤。传统提取松树木片中松材线虫的方法为CTAB法，这种方法的主要缺点是:需要较多的样本、提取时间长、过程繁琐、必需在实验室进行、不能应用于野外环境，因此无法满足实际检测需要。本领域迫切需要稳定性强、成本低、操作方法简便的从松树木块儿中提取松材线虫基因组DNA的方法。
[0013]本发明通过大量的实验发现，采用2-10% (w/v)的Chelex-100作为提取缓冲液，特别是采用5% (w/v)的Chelex-100作为提取缓冲液提取松树木材中的松材线虫基因组DNA，不仅步骤简捷，而且所提取的DNA质量较高。本发明通过进一步的实验非常意外的发现:先用异硫氰酸胍提取缓冲液处理木材样品，再加入2-10% (w/v)的Chelex-100进行提取，能够非常有效的提高松材线虫基因组DNA的得率和纯度。
[0014]更优选的，本发明的一种从待检测的松树木材样品中提取松材线虫基因组DNA的方法，包括以下步骤:
[0015]( I)向待检测的松树木材样品中加入异硫氰酸胍提取缓冲液搅拌混匀，冰上放置3-10min,沸水煮 3-lOmin ； (2)加入 2-10%(w/v) Chelex-100 搅拌混匀，沸水煮 5_15min,离心，取上清液，即得；
[0016]其中，步骤(1)中所述的冰上放置时间优选为5min，沸水煮的时间优选为5min ;步骤(2)中所述的沸水煮的时间优选为8min。
[0017]本发明中所述的异硫氰酸胍提取缓冲液的组成优选为:异硫氰酸胍2-4mol/L ；Tris-HCl 0.01-0.lmol/L ；EDTA 0.01-0.05mol/L；Triton X-1000.05%-2% ;更优选为:异硫氰酸胍 3mol/L ;Tris-HCl 0.05mol/L(pH8.0) ；EDTA 0.02mol/L(pH8.0) ；TritonX-1001%o
[0018]本发明从松树木材中提取松材线虫基因组DNA的方法也适用于以松材线虫为对象，直接提取其基因组DNA，采用该方法直接提取松材线虫的DNA，同样具有DNA得率和纯度高等优点，适用于各种检测或研究；此外，本发明中所述的松材线虫是包括表1在内的任何一种株系的松材线虫。
[0019]本发明中所述的松树可以是任何一种被松材线虫侵染的松树，包括但不限于:马尾松、白皮松、樟子松、五针松、黑松、红松、油松、乔松、赤松、琉球松、欧洲黑松、海岸松、欧洲山松、辐射松、西黄松、西部白松、台湾黑松、湿地松、刚松、扭叶松、北美乔松、火炬松、长叶松、北美短叶松、刺叶松、加勒比松等。
[0020]采用LAMP方法扩增松材线虫，筛选获得特异性高、灵敏度好的LAMP组是准确、灵敏、特异性扩增出松材线虫的关键；为了筛选获得特异性高、灵敏度好的LAMP引物，本实验克隆比较了松材线虫和拟松材线虫核糖体的28S、18S、IGS区、mtCO1、HSP70、β -tubulin和SYG-2基因。在28S、18S、mtCOI基因中无法找到满足LAMP引物设计相似度低于80%的原则的区域，因此弃用28S、18S、mtCOI基因；IGS因其保守性差，种间种内都有极大差异也被弃用；在肥?70基因、β-tubulin基因和SYG-2基因中，可以找到用于设计LAMP引物的区域，于是分别以这三个基因为靶基因进行了 LAMP引物设计。以HSP70为靶基因设计了 2对LAMP引物组，以β -tubulin`基因为靶基因设计了 5对LAMP引物组，以SYG-2基因为靶基因设计了 8对LAMP引物组；分别以HSP70和β -tubulin为靶基因设计的LAMP引物组经试验验证后，因其扩增量不够或者特异性不高而弃用；以SYG-2基因为靶基因设计的8对LAMP引物组经试验验证，4号引物组、18号引物组、IF引物组、8号引物组和13号引物组均能特异的扩增出松材线虫，且最好的引物组是4号引物组(由上游外部引物SEQ ID N0.13、下游外部引物SEQ ID N0.14、上游内部引物SEQ ID N0.15和下游内部引物SEQ ID N0.16组成)，能在40分钟内检出含有松材线虫的木样，加上环引物后可在35分钟内检出；其次是8号和18号引物组，均能在50分钟内检出含有松材线虫的木样，加上环引物后可在40分钟内检出。
[0021 ] 本发明以4号引物组为LAMP扩增弓丨物进行了 7个温度梯度(57-63°C )下的LAMP扩增，结果发现4号引物组在60°C下扩增松材线虫的效果为最好，加入环引物在35min左右即可出峰。
[0022]为了检测4号引物组扩增松材线虫的特异性，本发明选取34个样品进行了特异性检测试验。样品具体为:八种伞滑刃属线虫,包括九个松材线虫种群、七个拟松材线虫种群、两个豆伞滑刃线虫种群及五种伞滑刃属线虫各一个种群；三种属外线虫；六种真菌，其中灰葡萄孢和柿盘多毛孢是两种用于人工培养松材线虫的真菌，另外四种真菌分别属于木霉、青霉、轮枝霉和镰刀菌，在马尾松和黑松树干内曾经分离获得过这四个属的真菌；两种易感病松树(表1)。特异性验证结果表明，所有松材线虫样品均能得到阳性结果，其他样品结果为阴性，特异性高。同时，本发明运用Kikuchi (2008)等针对松材线虫ITS区设计的LAMP引物组扩增34个样品，伪伞滑刃线虫和豆伞滑刃线虫在50min左右开始能被检出，拟松材线虫在90min左右也开始能被检出，其引物组特异性明显低于4号引物组。
[0023]表1供试线虫、真菌和植物种群和株系的详细信息
【权利要求】
1.一种检测松材线虫的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (I)从待检测的松树木材样品中提取松材线虫基因组DNA ；(2)以提取的DNA为模板，加入包括LAMP引物组、Bst DNA聚合酶在内的组分建立LAMP反应体系，进行环介导等温扩增；(3)根据扩增产物荧光的有无或浊度的变化，判定待检测的松树木材样品中是否存在松材线虫。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)采用2-10%的Chelex-1OO作为提取缓冲液提取松树木材样品中松材线虫DNA，优选的，采用5%的Chelex-100作为提取缓冲液提取松树木材样品中的松材线虫DNA ;更优选的，先用异硫氰酸胍提取缓冲液处理松树木材样品，再加入2-10%的Chelex-100提取松树木材样品中的松材线虫DNA。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)中所述的从待检测的松树木材样品中提取松材线虫DNA的方法，包括以下步骤: (O向待检测的松树木材样品中加入异硫氰酸胍提取缓冲液搅拌混匀，冰上放置后，沸水煮3-10min ;(2)按w/v计,加入2-10%Chelex-100搅拌混匀,沸水煮5_15min,离心,取上清液，即得；其中，步骤(1)中所述的冰上放置时间优选为3-10min，更优选为5min，沸水煮的时间优选为5min ;步骤(2)中所述的沸水煮的时间优选为8min。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的LAMP引物组选自以下5组引物中的任意一组: 4号引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.13、下游外部引物SEQ ID N0.14、上游内部引物SEQ ID N0.15和下游 内部引物SEQ ID N0.16组成； 18号引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.17、下游外部引物SEQ ID N0.18、上游内部引物SEQ ID N0.19和下游内部引物SEQ ID N0.20所示的引物组成； IF引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.21、下游外部引物SEQ ID N0.22、上游内部引物SEQ ID N0.23和下游内部引物SEQ ID N0.24所示的引物组成； 8号引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.25、下游外部引物SEQ ID N0.26、上游内部引物SEQ ID N0.27和下游内部引物SEQ ID N0.28所示的引物组成； 13号引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.29、下游外部引物SEQ ID N0.30、上游内部引物SEQ ID N0.31和下游内部引物SEQ ID N0.32所示的引物组成。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于:在所述5组引物组中还含有一条SEQIDN0.33所示的环引物。
6.用于检测松材线虫的LAMP引物组，其特征在于，选自以下5组引物中的任意一组: 4号引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.13、下游外部引物SEQ ID N0.14、上游内部引物SEQ ID N0.15和下游内部引物SEQ ID N0.16组成； 18号引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.17、下游外部引物SEQ ID N0.18、上游内部引物SEQ ID N0.19和下游内部引物SEQ ID N0.20所示的引物组成； IF引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.21、下游外部引物SEQ ID N0.22、上游内部引物SEQ ID N0.23和下游内部引物SEQ ID N0.24所示的引物组成； 8号引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.25、下游外部引物SEQ ID N0.26、上游内部引物SEQ ID N0.27和下游内部引物SEQ ID N0.28所示的引物组成； 13号引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.29、下游外部引物SEQ ID N0.30、上游内部引物SEQ ID N0.31和下游内部引物SEQ ID N0.32所示的引物组成。
7.一种检测松材线虫的LAMP试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下各组分:LAMP引物组，LAMP反应缓冲液，DNA链置换酶和荧光染料； 其中，所述的LAMP引物组选自以下5组引物中的任意一组: 4号引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.13、下游外部引物SEQ ID N0.14、上游内部引物SEQ ID N0.15和下游内部引物SEQ ID N0.16组成； 18号引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.17、下游外部引物SEQ ID N0.18、上游内部引物SEQ ID N0.19和下游内部引物SEQ ID N0.20所示的引物组成； IF引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.21、下游外部引物SEQ ID N0.22、上游内部引物SEQ ID N0.23和下游内部引物SEQ ID N0.24所示的引物组成； 8号引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.25、下游外部引物SEQ ID N0.26、上游内部引物SEQ ID N0.27和下游内部引物SEQ ID N0.28所示的引物组成； 13号引物组:由上游外部引物SEQ ID N0.29、下游外部引物SEQ ID N0.30、上游内部引物SEQ ID N0.31和下游内部引物SEQ ID N0.32所示的引物组成。
8.按照权利要求7所述的LAMP试剂盒，其特征在于:所述5组LAMP引物组中各含有一条SEQ ID N0.33所示的环引物。
9.权利要求7或8所述LAMP试剂盒在检测松材线虫中的应用，包括:(I)建立LAMP反应体系；(2)将LAMP反应体系在57-63°C的温度下水浴60到120min，最后在80°C温度下温育3-10min ；(3)将LAMP扩增产物通过浊度仪实时检测白色沉淀以判别待检测样品中是否含有松材线虫。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于:步骤(2)中将所建立的LAMP反应体系在60°C的温度下反应60到120min，最后在80°C温度下温育3_10min ;其中，所述的LAMP反应体系参照以下方式建立:待检测的DNA提取液2 μ L，上游外部引物和上游内部引物各5pmol，下游内部引物和下游外部引物各40pmol，环引物20pmol，2XLAMP反应mixl2.5yL，DNA链置换酶I μ L，荧光染料I μ L0
【文档编号】C12Q1/68GK103555840SQ201310538469
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】汪来发, 王曦茁, 苟大平, 田国忠, 朴春根 申请人:中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所