土曲霉zrv2011f5及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株新菌株-土曲霉菌(Aspergillus?terreus)ZRV2011F5及其应用，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?NO.8746，保藏日期为2014年1月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；该菌株能够生产莫纳可林K，其中分泌到培养基中的含量为116μg/ml，并且其代谢产物能够对sEH的两个酶具有抑制活性：水解酶与磷酸酶均有较高的抑制作用，5％添加量的抑制率分别为72％和93％。
【专利说明】土曲霉ZRV2011F5及其应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种来自米醋发酵过程的能够生产莫纳可林K(monacolin K)的丝状 真菌，特别涉及同时能够生产可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase, sEH) 抑制剂的土曲霉（Aspergillus terreus)ZRV2011F5 及其应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 他汀（statin)类化合物是抑制胆固醇合成的优良药物，能有效地降低LDL-胆 固醇水平，并升高HDL-胆固醇水平，有效地阻止动脉粥样硬化斑的形成，全球销售额达 至IJ 140亿美元以上，居治疗类药物的第三位（李师翁和冯琳，药物生物技术，2011，18 (6)， 536-68)。莫纳可林K，亦称为洛伐他汀，于1979年和1980年先后从Monascus ruber和 Aspergillus terreus中发现，1987年由FDA批准上市。莫纳可林K的工业生产菌株为源 于土壤的 A. terreus。
[0003] 莫纳可林K已经被证明具有多种药理作用，除了能显著降低血LDL-胆固醇，还具 有调节炎症反应、抑制血栓形成，从而到达调控动脉硬化进程的作用。此外，莫纳可林K还 具有促进葡萄糖代谢、增加胰岛素敏感性的作用，对代谢性疾病有治疗作用；还能刺激骨形 成，对骨质疏松有一定的预防与治疗作用；具有免疫调节作用，能够阻止风湿性关节炎的发 展，降低组织硬化性疾病的发生。
[0004] 可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase, sEH)是近几年出现的具 有交叉功能的心血管疾病新靶标，该酶的抑制剂被认为是最具前景的心血管疾病靶标药 物，不仅有抗高血压、抗炎症功能，还有保护心肌、肾脏、大脑等与高血压和粥样动脉硬化 相关的终末器官的作用（Marino, J.P·，Jr. (2009) Soluble epoxide hydrolase, a target with multiple opportunities for cardiovascular drug discovery. Curr Top Med Chem, 9, 452-63.) 〇
[0005] sHl是由两个60Kda的单体以反平行方式组成的同型二聚体，具有双重酶活性。每 个单体有两个结构域，C末端有环氧化物水解酶活性，而N末端含有磷酸酶活性位点。sHl的 主要生理功能是将环氧化二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acides，EETs)等环氧化合 物水解成相应的二醇化合物，EETs被证明是内皮源性超极化因子，具有抗高血压、维持血管 稳态平衡和抗炎症等作用，而这些环氧化合物的二醇化合物几乎不具备这类生理功能。因 此抑制sEH的活性就能够增进EETs的心血管保护功能。
[0006] sEH的N末端磷酸酶活性，尽管功能尚未完全明确，已被认为是一个潜在高胆固醇 血症的治疗靶标，而且sEH单核苷酸多态性的研究表明，拥有N末端Ly S55Arg的人群，即使 C末端的环氧化物水解酶活性不高，其较高的磷酸酶活性依然会增加冠心病的风险。
[0007] 寻找sEH抑制剂已经成为世界各大制药公司新药研发的热点，已经有一个 sEH的人工合成抑制剂1，3-二取代脲类化合物AR9281进入临床二期a研究（Imig，J. D. &B. D. Hammock(2009)Soluble epoxide hydrolase as a therapeutic target for cardiovascular diseases. Nature Reviews Drug Discovery, 8, 794-805. ) 〇 而具有 sEH 抑制作用的天然化合物尚未见报道。 (三）
【发明内容】
[0008] 本发明目的是从米醋发酵醋醪中分离到一株能够生产莫纳可林K的土曲霉 ZRV2011F5,其中分泌到培养基中的含量为116 μ g/ml。并且发现其代谢产物能够对sEH的 两个酶具有抑制活性：水解酶与磷酸酶均有较高的抑制作用，体积终浓度5%添加量的抑 制率分别为72 %和93%。
[0009] 本发明采用的技术方案是：
[0010] 本发明提供一株新菌株一 土曲霉（Aspergillus terreus)ZRV2011F5,保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0. 8746,保藏日期为 2014年1月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所，邮编100101。
[0011] 本发明还涉及所述土曲霉ZRV2011F5在制备莫纳可林K中的应用，具体所述的应 用为：将土曲霉ZRV2011F5接种至M6培养基，25?30°C培养11?13天，获得含莫纳可 林K的培养液，将培养液分离纯化，获得莫纳可林K;所述M6培养基的终浓度组成为：甘油 70-110g/L，葡萄糖 10-30g/L，豆柏 30-50g/L，蛋白胨 8g/L，硝酸钠 2g/L，硫酸镁 0· 5-lg/L， 橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
[0012] 优选，所述培养液经 24h 冷冻干燥（Freeze Dry System，LABC0NC0, USA)。
[0013] 优选，所述M6培养基的终浓度组成为：甘油70g/L，葡萄糖30g/L，豆柏30g/L，蛋 白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁lg/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
[0014] 所述土曲霉ZRV2011F5接种至M6培养基前，先接种至斜面培养基进行活化，所述 活化方法为：将土曲霉ZRV2011F5接种至PDA斜面，25?30°C培养5天，获得菌体斜面；所 述PDA培养基的组成：马铃薯浸出粉10. Og/L，葡萄糖20. Og/L，琼脂13g/L，氯霉素0. lg/L， 溶剂为去离子水，pH值为自然。
[0015] 本发明所述含莫纳可林K的培养液分离纯化的方法为：取培养液冷冻干燥后， 加入培养液1倍体积的90%甲醇水溶液（体积浓度），经涡旋混匀，置于超声波清洗仪 (KUDOS，上海科导）中超声lOsec后，在4°C浸提12h，获得甲醇浸提液，将浸提液离心取上 清液，利用HPLC，收集莫纳可林K峰的组分，减压脱溶，获得莫纳可林K。
[0016] 本发明还涉及所述土曲霉ZRV2011F5在抑制可溶性环氧化物水解酶活性中的应 用，具体所述的土曲霉ZRV2011F5抑制剂为：将土曲霉ZRV2011F5接种至M6培养基，25? 30°C培养11?13天，获得含莫纳可林K的培养液，将培养液冷冻干燥后，加入培养液1倍 体积的体积浓度90%甲醇水溶液，在4°C静置浸提12h，获得甲醇浸提液，即获得抑制剂。
[0017] 进一步，所述抑制剂的体积终浓度为1?5% (该浓度是指抑制剂在SH1酶活测定 反应体系中的体积终浓度）。
[0018] 本发明利用高效液相（HPLC)检测甲醇浸提液中的莫纳可林K含量；利用多孔板酶 标仪检测甲醇浸提液对sEH的两种酶活性抑制情况：水解酶与磷酸酶的抑制作用。
[0019] 目前尚未见到关于莫纳可林K能够抑制sffi活性的文献报道，因此本发明所述土 曲霉的代谢产物既包含莫纳可林K，又具有抑制sffi活性的作用，表明不仅能够从抑制胆固 醇合成的途径去控制血脂异常等心血管疾病，还能够从抑制sEH活性的途径去控制血压、 抑制动脉硬化的发生与发展。
[0020] 本发明所述土曲霉ZRV2011F5能够产生莫纳可林K，同时能够产生抑制环氧化物 水解酶与环氧化物磷酸酶的活性物质，进而可以将该菌株的培养液应用于功能食品，从减 少胆固醇合成，控制血压、抑制动脉硬化等多种途径，达到预防与控制心血管疾病的目的。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株--土曲 霉（A. terreus) ZRV2011F5,该菌株来自传统米醋发酵醋醪，不仅能够生产莫纳可林K，而且 该菌培养产物对可溶性环氧化水解酶活性具有抑制作用，对sEH的水解酶与磷酸酶均有较 高的抑制作用，尤其是对sHl磷酸酶的抑制率，在体积终浓度5 %添加量时达到了 93%，因 此，土曲霉（A. terreus) ZRV2011F5能够用于生产抑制心血管疾病靶标sHl酶的抑制剂，从 而起到多角度预防和治疗心血管疾病的作用。 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为莫纳可林K的紫外图谱，A为三种形式莫纳可林K的HPLC紫外吸收图谱，B 为三种形式的莫纳可林K经二极管阵列检测器（DAD)获得的紫外吸收光谱，其中a是开环 酸钠盐形式的莫纳可林K，b为开环酸形式的莫纳可林K，c是内酯形式的莫纳可林K。
[0023] 图2为实施例1中菌株ZRV2011F5的M6培养液的紫外图谱，A为HPLC紫外吸收 图谱，B为20. Olmin峰（A中方框所示峰）的放大图，C为M6培养液的DAD光谱。
[0024] 图3为实施例2中菌株ZRV2011F5的M6培养液的紫外图谱，A为HPLC紫外吸收 图谱，B为20. 02min峰（A中方框所示峰）的放大图，C为M6培养液的DAD光谱。
[0025] 图4为实施例3中菌株ZRV2011F5的M6培养液的紫外图谱，A为HPLC紫外吸收 图谱，B为20. 03min峰（A中方框所示峰）的放大图，C为M6培养液的DAD光谱。
[0026] 图5为实施例4中菌株ZRV2011F5的M6培养液对sEH的水解酶和磷酸酶活性的 抑制作用图。 (五）
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0028] 实施例1.菌株ZRV2011F5的分离鉴定及其莫纳可林K的检测
[0029] 1.菌株的分离纯化
[0030] 利用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA)培养基从米醋固态发酵醋醪（大米糖化阶段的料 饼）中分离丝状真菌。采用无菌水将醋醪配制成质量浓度20%的悬浊液，进一步用无菌水 稀释10倍，100倍和1000倍，分别涂布在虎红PDA平板，25°C -30°c培养5天，从能够挑出 单个菌落的平板上，挑选不同形态的菌落于PDA平板进行划线培养，25°C_30°C培养3-5天， 从划线培养的平板上挑选单个菌落，保存于PDA斜面。从PDA斜面挑取菌落接种到PDA平 板进行划线培养，25-30°C培养3天，重复划线培养2次进行进一步的分离纯化，从划线培养 的平板上挑选单个菌落，命名为菌株ZRV2011F5。
[0031] 2.培养基的配制
[0032] PDA培养基的具体成分如下：马铃薯浸出粉10. Og/L，葡萄糖20. Og/L，琼脂13g/L， 氯霉素0. lg/L，溶剂为去离子水，pH值为自然。虎红PDA培养基在PDA培养基的基础上添 加终浓度0. 〇5g/L的虎红。
[0033] 3. HPLC检测分离菌株培养液中的莫纳可林K
[0034] 利用HPLC的二极管阵列检测器（Diode Array Detector, DAD)检测莫纳可 林K是近几年发展起来的较为简便的莫纳可林检测方法（Li, Y. G.，Zhang, F.，Wang, Z. T. , Hu, Z. B. J. Pharma. Biomed. Anal. 35 (2004) 1 101 - 1 1 12. ) 〇 以 C18 柱 PEGSIL-0DS(4. 6X250, 7μ , Senshu Scientific Co. , Tokyo, Japan),采用 L-2000 系 列高效液相色谱仪（Hitachi，日本），流动相为甲醇与0. 1 %磷酸，流速为lml/ min，采用梯度方法在20分钟内甲醇的比例从10 %上升到100%，利用DAD检测器 L-2455 (Hitachi, Ibaraki, Japan)在220nm处进行DAD分析。在此条件下对内酯形莫纳可 林K、开环酸形莫纳可林K及开环酸钠盐形莫纳可林K三种标准品进行DAD分析，获得3个 独立峰，保留时间分别为20. 36min，19. 94min和19. 34min (图1中A)，并且在236nm处均获 得相同的莫纳可林K的山形特征峰（图1中B)。
[0035] 将菌株ZRV2011F5接种于M6培养基中，25°C _30°C培养13天，将培养液冷冻干燥， 然后加入培养液等量体积的90%甲醇水溶液（体积浓度），涡旋混匀，置于超声波清洗仪 (KUDOS，上海科导）中超声lOsec，4°C浸提12h，将浸提液离心取上清液，利用HPLC的紫外 检测器分析上清液，检测到一个峰（保持时间20. Olmin)与开环酸形莫纳可林K(保留时间 19. 94)具有相同的保留时间（图2中B)，同时DAD检测器在236nm处检测到莫纳可林K的 山形特征峰（图2中C)，表明菌株ZRV20115能够生产莫纳可林K。
[0036] M6培养基组成为：甘油70g/L，葡萄糖10g/L，豆柏30g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠 lg/ L，硫酸镁0. 5g/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
[0037] 4.菌株ZRV20115的真菌ITS rRNA基因序列的分析
[0038] 利用真菌ITS rRNA基因序列进行ZRV2011F5菌株的分子鉴定。采用真菌DNA 提取试剂盒（Omega)提取 DNA，利用真菌 ITS 引物 ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3'）和 ITS4(5'TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'）进行ITS rRNA基因序列的PCR扩增。扩增体系：反 应体系 25μ L，DNA模板 100ng，10XPCR Buffer 2· 5μ L，dNTP mix(10Mm)0. 5μ L，10μΜ 上 下游引物各〇. 5 μ L，Taq酶（5U/ μ L) 0. 2 μ L，加去离子水补足至25 μ L。扩增条件：预变性 94°C 5min，循环 94°C lmin，50°C lmin，72°C 2min，共 30 个循环，72°C延伸 10min。
[0039] PCR产物纯化后送至上海桑尼生物工程有限公司（中国）进行DNA测序（SEQ ID NO :1所示），将测序结果提交NCBI数据库中进行Blast比对，比对结果显示该菌株与 Aspergillus terreus 同源性为 100%，将菌株ZRV2011F5鉴定为土曲霉菌（A. terreus)，命 名为土曲霉菌（A.terreus)ZRV2011F5。
[0040] SEQ ID NO :1 序列为：
[0041] GTCGACGATTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAA CCTGGAAAAAAACAAGTTGCAAATAAATGCGTCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACGGAGCGGAAGACGAAGCCCCA TACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGAGCCGGGGGACGAGGGCCCA ACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGT GCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGA TGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCAAAGAATCACACTCAGACTGCAAGCTTTCAG AACAGGGTTCATGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGCGAGTCGCCCCCCGGCGGCCAGCAACGCTGG CGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACAATAGTCACGGGTGGGAGGTTGGGCCATAAAGACCCGCACTCGGTAATGA TCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA
[0042] 实施例2. 土曲霉ZRV2011F5生产莫纳可林K
[0043] 将土曲霉ZRV2011F5接种至PDA斜面，25-30°C培养5天，获得菌体斜面；从菌体斜 面挑取菌体接种至M6培养基，25-30°C培养13天，取培养液冷冻干燥后，加入培养液1倍体 积的体积浓度90%甲醇水溶液，涡旋混匀，在超声波清洗仪中超声lOsec，在4°C静置浸提 12h，获得甲醇浸提液，离心取上清液，采用实施例1步骤3所述方法进行HPLC检测。
[0044] 在M6培养基中检测到了开环酸形莫纳可林K，保留时间为20. 02min(图3中B)， 含量达到了 40yg/ml。
[0045] M6培养基的终浓度组成如下：甘油110g/L，葡萄糖30g/L，豆柏50g/L，蛋白胨8g/ L，硝酸钠2g/L，硫酸镁lg/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
[0046] 实施例3
[0047] 将实施例2中M6培养基的组成改为：
[0048] 甘油70g/L，葡萄糖30g/L，豆柏30g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁lg/L，橄 榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
[0049] 其它操作同实施例2,结果见图4所示。结果表明，在M6培养基中检测到了开环 酸形莫纳可林K(图4中B和C)，含量为115μ g/ml。结合实施例2，表明土曲霉ZRV2011F5 能够在较广泛的培养基中生产莫纳可林K，有潜在的获得最优化生产条件的可能性。
[0050] 实施例4 土曲霉ZRV2011F5对sHl酶活性的抑制作用
[0051] 1、高通量sHl活性检测方法
[0052] 利用人工底物经sEH酶切后，其产物能够形成荧光的特点，采用多孔板检测仪 SPECTRAMAX M5(MD，美国）动态监测酶反应过程中反应液的荧光强度，以反应的初速度来表 示sHl活性的大小。在相同的100μ L反应体系中，以添加缓冲液（25mM bis-tris HC1，ImM MgCl2,0. lmg/ml BSA，pH 7.0)替代样品为空白对照，其活性计为100%，以添加样品为实验 对象，分别检测sEH酶活性，从而获得抑制剂对sEH酶活性的抑制率。
[0053] 2、sHl酶活性检测条件
[0054] (1)磷酸酶活性检测
[0055] 对照：以缓冲液（25mM bis-tris HC1, ImM MgCl2,0. lmg/ml BSA，pH7.0)为 反应介质，以终浓度为300ng/ml的人源sHl酶为催化剂，加入终浓度为5μΜ的底物 Attophos (promega)，在30°C反应30分钟，以激发波长450nm、发射波长545nm进行突光动 态检测。
[0056] 实验：
[0057] 以缓冲液（25mM bis-tris HC1, ImM MgC12,0. lmg/ml BSA, pH 7.0)为反 应介质，以终浓度为300ng/ml的人源sHl酶为催化剂，加入终浓度为5μΜ的底物 Attophos(promega)，再分别加入体积终浓度1 %，3%和5%的实施例3获得的土曲霉 ZRV2011F5培养液的甲醇浸提液作为抑制剂，在30°C反应30分钟，以激发波长450nm、发射 波长545nm进行动态荧光检测。
[0058] ⑵水解酶活性检测
[0059] 对照：以缓冲液（25mM bis-tris HC1, ImM MgC12, 0· lmg/ml BSA, ρΗ7· 0)为反应介 质，以终浓度为12. 5 μ Μ的PHOME (Cayman)为底物，以终浓度为80ng/ml人源sHl酶为催化 齐[J，30°C反应20分钟，以激发波长330nm，发射波长465nm进行荧光动态检测。
[0060] 实验：
[0061] 以缓冲液（25mM bis-tris HC1, ImM MgC12,0. lmg/ml BSA，pH 7.0)为反应介质， 以终浓度为80ng/ml的人源sHl酶为催化剂，加入终浓度为12. 5 μ M的PHOME为底物，再分 别加入体积终浓度1%，3%和5%实施例3获得的土曲霉ZRV2011F5培养液的甲醇浸提液 作为抑制剂，在30°C反应30分钟，以激发波长330nm，发射波长465nm进行荧光动态检测。
[0062] 结果：利用96孔板进行荧光检测，每个样品重复2次，分别计算每个孔板中的酶活 性，与空白对照比较计算抑制率，取平均值。如图5所示，当的甲醇浸提物添加量为5% (V/ V)时，其对sEH水解酶与磷酸酶的抑制率分别为72%和93%。
【权利要求】
1. 土曲霉（Aspergillus terreus)ZRV2011F5,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 8746,保藏日期为2014年1月20日，保藏地址为北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
2. 如权利要求1所述土曲霉ZRV2011F5在制备莫纳可林K中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将土曲霉ZRV2011F5接种至 M6培养基，25?30°C培养11?13天，获得含莫纳可林K的培养液，将培养液分离纯化，获 得莫纳可林K ;所述M6液培养基组成为：甘油70?110g/L，葡萄糖10?30g/L，豆柏30? 50g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0. 5?lg/L，橄榄油5g/L，溶剂为去离子水，pH值 自然。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述M6液培养基终浓度组成为：甘油70g/ L，葡萄糖30g/L，豆柏30g/L，蛋白胨8g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁lg/L，橄榄油5g/L，溶剂为 去离子水，pH值自然。
5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述土曲霉ZRV2011F5接种至M6培养基前， 先接种至斜面培养基进行活化，所述活化方法为：将土曲霉ZRV2011F5接种至PDA斜面， 25?30°C培养5天，获得菌体斜面；所述PDA培养基的组成：马铃薯浸出粉10. Og/L，葡萄 糖20.0g/L，琼脂13g/L，氯霉素0. lg/L，溶剂为去离子水，pH值为自然。
6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述含莫纳可林K的培养液分离纯化的方法 为：取培养液冷冻干燥后，加入培养液1倍体积的体积浓度90%甲醇水溶液，在4°C静置浸 提12h，获得甲醇浸提液，将浸提液离心取上清液，利用HPLC，收集莫纳可林K峰的组分，减 压脱溶，获得莫纳可林K。
7. 如权利要求1所述土曲霉ZRV2011F5作为可溶性环氧化水解酶活性抑制剂的应用。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的抑制剂为：将土曲霉ZRV2011F5接种 至M6培养基，25?30°C培养11?13天，获得含莫纳可林K的培养液，将培养液冷冻干燥 后，加入培养液1倍体积的体积浓度90 %甲醇水溶液，在4°C静置浸提12h，获得甲醇浸提 液，即获得抑制剂。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于所述抑制剂的体积终浓度为1?5%。
【文档编号】C12N1/14GK104140933SQ201410384286
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】朱立颖, 冯纬, 王欣, 周利南 申请人:浙江省农业科学院