一种病毒rna检测引物的设计方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种病毒RNA检测引物的设计方法及试剂盒，尤指一种新型的病毒RNA小片段引物设计方法和以此方法设计的HCV?RNA检测试剂盒，属于临床检验学领域。本发明通过对HCV?RNA的5’–UTR区不同位置的引物设计，发现在HCV?RNA降解的患者血清中，目的片段为小片段的检测效率明显高于长片段；并用上述最小片段的引物建立了相应的检测试剂盒。本发明的特点是：本发明所描述的小片段引物设计方法提供了一种新型的、涉及二级结构的、可靠的小片段引物设计原则；尤其适用于RNA降解标本的检测；可以推广到其他病毒RNA的检测中；可降低对标本采集、运输、保存中的要求，提高检测效率。
【专利说明】-种病毒RNA检测引物的设计方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型的病毒RNA小片段引物设计方法和以此方法设计的HCV RNA 检测试剂盒，属于临床检验学领域。
【背景技术】
[0002] 病毒RNA定量检测是病毒感染辅助诊断和疗效观察的重要依据。然而，诸多研究 证实：病毒RNA在标本采集、运输、保存、检测前处理等过程中存在降解现象，若RNA降解， 以目前的试剂盒来看，检测效率将普遍降低，进而影响诊断治疗。这是由于：以HCV为例， 目前国内外检测HCV RNA的商品化试剂盒通常是扩增5' -UTR的150-250bp左右的片段。 5'-UTR是HCV RNA的最保守序列，长341nt，其保守性使其成为引物设计最集中的区域。然 而，商品化试剂盒通常忽略了 5' -UTR的二级结构降解时对检测的影响。
[0003] HCV RNA的5' -UTR大部分序列自身互补，因而形成了充满了"茎环"的二级结构。 ①该结构存在热不稳定性，运输和保存中环境温度的变化会导致5' -UTR二级结构打开，使 得靠近其5'端的序列容易被外切酶降解。目前商品化试剂盒检测片段普遍较长，不可避免 地靠近5'端而易被外切酶降解，使得检测效率降低。
[0004] ②该结构存在酶不稳定性，在"环"的区域常常比"茎"区更容易被多种内切酶降 解，使RNA 5'-UTR被酶降解成长短不一的小片段。若引物刚好设计在"环"上充满酶切位 点的区域，则当RNA被内切酶降解，引物无法和模板结合，检测效率也将降低。目前商品化 试剂盒的检测片段普遍较长，不可避免地含盖诸多"茎"区而易被内切酶降解，使得检测效 率降低。
[0005] 因此，对于RNA降解标本，目前商品化试剂盒的检测效率都会有不同程度的降低， 检测结果可能会影响用药和疗效观察，或者造成HCV RNA阳性献血者血液漏检。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的第一个技术问题是建立一种新型的病毒RNA检测的小片段引物 设计方法。
[0007] 本发明要解决的第二个技术问题是以HCV为例，用上述方法设计引物，建立HCV RNA小片段检测试剂盒。
[0008] 本发明要解决的第三个技术问题是提供上述试剂盒的应用，并和其他试剂盒进行 检测性能比较。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] 一种病毒RNA检测引物的设计方法，由以下原则组成：
[0011] (1)选择病毒基因组RNA最保守区域，通常为5' -UTR区进行引物设计；
[0012] (2)将该病毒各型别在5' -UTR区的共同序列作为引物设计的选择区域，并将共 同序列在二级结构中定位；
[0013] (3)共同序列中位于5' -UTR二级结构的"茎"上的区域作为引物设计的首选区， 尽量避开"环"结构；
[0014] (4)正反引物设计应尽量靠近5' - UTR的3'端；
[0015] (5)将最靠近5' - UTR的3'端，位于"茎"上的18-21nt的序列选为forward引 物互补区；
[0016] (6)将第二靠近5' -UTR的3'端，位于"茎"上的18-21nt的序列选为probe探 针的互补区；
[0017] (7)将第三靠近5' - UTR的3'端，位于"茎"上的18-2lnt的序列选为reverse弓| 物；
[0018] (8) forward引物、probe探针、reverse引物之间不要有重合区域；
[0019] (9)扩增的目的片段跨越的"环"越少越好，即目的片段越小越好。
[0020] 所述⑴的5' -UTR的二级结构为各RNA病毒专属的、国际公认的二级结构。
[0021] 所述⑵共同序列是该病毒各亚型的RNA序列通过clustalX多重序列比对程序 比对所得的共同序列。
[0022] -组检测HCV病毒RNA的核苷酸序列，包括引物序列、探针序列和阳性序列，其中 引物序列为序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所不的核昔酸序列，探针序列为序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，阳性序列为序列表SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
[0023] 本发明通过对HCV RNA的5' - UTR区不同位置的引物设计，发现在HCV RNA降解 的患者血清中，目的片段为小片段的检测效率明显高于长片段；并用上述最小片段的引物 建立了相应的检测试剂盒。
[0024] -种HCV病毒RNA检测试剂盒，由以下检测试剂组成：
[0025] (l)HCV RNA 提取试剂：
[0026] 1)裂解液：含异硫氰酸胍的溶液；
[0027] 2) RNase inhibitor :含有 RNase 抑制剂的溶液；
[0028] 3)去蛋白液：含有异丙醇的溶液；
[0029] 4)漂洗液：含有75%的乙醇的溶液；
[0030] 5)洗脱液：RNase free water ;
[0031] 6) RNA 吸附柱；
[0032] (2)0neSt印RT-PCR荧光检测试剂：
[0033] 1)PCR 反应液（PCR buffer);
[0034] 2) dNTP 混合液（dNTP mix);
[0035] 3)引物 A(primer forward) :5, -GCTGCACGGTCTACGAGAC-3,（SEQ ID No. 1);
[0036] 4)引物 B(primer reverse) :5, -GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3'（SEQ ID No. 2);
[0037] 5)荧光探针（probe) :5, -CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3'（SEQ ID No. 3);
[0038] 6)酶混合物（Enzyme Mix):含有Taq酶和逆转录酶；
[0039] (3)对照品
[0040] 1)阴性对照：HCV阴性的健康人血清；
[0041] 2)强阳性对照：含有3 X 107的HCV5 ' -UTR的非传染性体外转录RNA (SEQ ID No. 4)；
[0042] 3)弱阳性对照：含有3 X 103的HCV5 ' -UTR的非传染性体外转录RNA (SEQ ID No. 4) 〇
[0043] 阳性对照（SEQ ID No. 4):
[0044] 5 ' -AGGCCUU⑶GGUACUGCCUGAUAGGGUGCUUGCGA⑶GCCCCGGGAG⑶CUCGUAGACCGUGCAC C-3 ,
[0045] 所述（2)中引物A为5 ' -GCTGCACGGTCTACGAGAC-3 '，是根据本发明的引物设计原 则选出的最靠近5' -UTR的3'端区域的互补序列。
[0046] 所述（2)中引物B为5 ' -GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3 '，是根据本发明的引物设计 原则选出的第三靠近5' -UTR的3'端的序列。
[0047] 所述（2)中荧光探针（probe) : 5 ' -CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3 '，是根据本发明的 引物设计原则选出的第二靠近5' -UTR的3'端区域的互补序列。
[0048] 所述的一种病毒RNA检测引物的设计方法在HCV RNA发生降解的血清检测中的应 用、在临床上检测HCV感染患者血清中的应用、在献血者血液筛查中的应用、或在检测其他 RNA病毒中的应用。
[0049] 所述的一组检测HCV病毒RNA的核苷酸序列或一种HCV病毒RNA检测试剂盒在 HCV RNA发生降解的血清检测中的应用、在临床上检测HCV感染患者血清中的应用、在献血 者血液筛查中的应用、或在检测其他RNA病毒中的应用。
[0050] 所述的HCV RNA小片段检测试剂盒的应用。例如：
[0051] (l)HCV RNA小片段检测试剂盒在检测临床HCV感染者血清RNA水平中的应用，可 以为临床治疗和用药提供辅助诊断依据；
[0052] (2) HCV RNA小片段检测试剂盒在献血者的血液筛查中的应用，可以发现HCV阳性 的血液或处于HCV感染窗口期的献血者血液，保护输血的安全性；
[0053] (3) HCV RNA小片段检测试剂盒在检测HCV RNA发生降解的标本中的应用。本试剂 盒可以检测那些由于采集、运输、保存不当发生降解的RNA标本。用本试剂盒检测HCV RNA 降解前后标本，发现：在降解前，长片段和小片段扩增的Ct值相近，即检测RNA含量差距不 大；在降解后，长片段扩增的Ct差值比小片段扩增的Ct差值明显增大，即RNA含量用长片 段方法时检测效率下降，而用本发明中的小片段检测方法可以最大限度地还原降解标本的 原始模板量，进而提高检测效率。
[0054] (4)所述的病毒RNA检测的小片段引物设计方法在其他病毒RNA检测中的应用。 本发明得到了一整套新的RNA引物设计原则，考虑到了二级结构和片段长短的因素，较大 程度地克服了由于RNA降解所导致的检测效率降低，可以推广到其他病毒RNA检测中。
[0055] 本发明试剂盒的简要检测程序为：
[0056] (1)提取 HCV RNA ;
[0057] (2)配制RT-PCR主反应混合液；
[0058] (3)分别加入forward引物与reverse引物；
[0059] (4)加入Taqman探针作为实时荧光PCR的监测工具；
[0060] (5)设定程序并扩增；
[0061] (6)得到结果和结果分析。
[0062] 本发明的优点：本发明提供了一种病毒RNA小片段的引物设计方法以及HCV RNA 小片段检测试剂盒，①可以最大限度地还原病毒RNA降解标本的原始病毒载量，提高检出 率，防止血液筛查的漏检；②可以不用严格要求标本的采集、运输、保存条件；③可以推广 到其他病毒的引物设计中，使病毒RNA降解不再较大影响检测结果；④灵敏度高、使用方 便、操作简单、特异性强。
[0063] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行说明，以使公众更好地理解本发明内 容及应用，并不以任何方式造成对本发明的限定。凡依照本发明公开内容所做的任何等同 替换，均属于本发明保护范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0064] 图1 :用本发明的小片段方法来设计HCV RNA引物，在HCV RNA5'-UTR二级"茎环" 结构上，设计了1?1(1'6￥6^61)、？(；1；'〇^31(1)引物和一个探针？化1'(^6) ;为验证本方法，另设 计了 R2、R3、R4(reverse2、3、4)引物作对比。
[0065] 图2 :HCV RNA降解前后，不同长度目的片段检测HCV RNA病毒含量的Ct差值。
[0066] 图3 :本发明的小片段试剂盒与科华、罗氏试剂盒在RNA降解前后的临床标本中的 检测性能比较。
【具体实施方式】
[0067] 以下为实施例中涉及的主要材料和试剂：
[0068] 病毒裂解液，国药集团，中国
[0069] RNase inhibitor，Promega，美国
[0070] 去蛋白液，国药集团，中国
[0071] 漂洗液，国药集团，中国
[0072] RNA吸附柱，天根生化，中国
[0073] OneStep RT-PCR Buffer，Qiagen，德国
[0074] dNTP mix，Qiagen，德国
[0075] Primer forward, invirogen,美国
[0076] Primer reverse, invirogen,美国
[0077] Probe，invirogen，美国
[0078] RNase free water，康为世纪，中国
[0079] OneStep RT-PCR Enzyme Mix，科华生物，中国
[0080] Template RNA，从血清标本中提取的HCV RNA
[0081] 引物、探针和阳性对照均委托英潍捷基上海（贸易）有限公司合成，探针标记：5' 荧光基团是FAM标记，3 '淬灭基团是MGB标记。
[0082] 实施例1 :检测HCV RNA小片段的试剂盒
[0083] 一 ·试剂盒组成
[0084] l.HCV RNA 提取试剂：
[0085] 1)病毒裂解液：含异硫氰酸胍的溶液；
[0086] 2) RNase inhibitor :含有 RNase 抑制剂的溶液；
[0087] 3)去蛋白液：含有异丙醇的溶液；
[0088] 4)漂洗液：含有75%的乙醇的溶液（无水乙醇用纯水1:3稀释）；
[0089] 5)洗脱液：RNase free water ;
[0090] 6) RNA吸附柱（硅基质膜）。
[0091] 2. OneSt印RT-PCR荧光检测试剂：
[0092] 1)PCR 反应液（PCR buffer) :Qiagen，德国；
[0093] 2) dNTP 混合液（dNTP mix) :Qiagen，德国；
[0094] 3)引物 A(primer forward) :5, -GCTGCACGGTCTACGAGAC-3，，自主设计；（SEQ ID No. 1)使用浓度ΙΟμΜ ;
[0095] 4)引物 B (primer reverse) :5，-GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3，，自主设计；（SEQ ID No. 2)使用浓度ΙΟμΜ ;
[0096] 5)荧光探针（probe) :5' -CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3'，自主设计；（SEQ ID No. 3)使用浓度10 μ Μ ;探针标记：5'荧光基团是FAM标记，3'淬灭基团是MGB标记；
[0097] 酶混合物（Enzyme Mix):含有Taq酶和逆转录酶，来源为QIAGEN：))': 〇neStep RT-PCR Kit ；
[0098] 3.对照品
[0099] 1)阴性对照：HCV阴性的健康人血清；
[0100] 2)强阳性对照：含有3X 107的HCV5' -UTR的非传染性体外转录RNA ; (SEQ ID No. 4)
[0101] 3)弱阳性对照：含有3X103的HCV5' -UTR的非传染性体外转录RNA，（SEQ ID No. 4) 〇
[0102] 二.人血清HCV RNA检测条件及方法：
[0103] 1.HCVRNA 的提取
[0104] 1)将血清与裂解液等体积混匀；
[0105] 2)加入 RNase inhibitor,混勻后 70°C加热 10min ;
[0106] 3)再加入等体积无水乙醇，震荡混匀；
[0107] 4)将3)中的混合液全部转入RNA吸附柱，离心弃液；
[0108] 5)吸附柱中加入去蛋白液，离心弃液；
[0109] 6)吸附柱中加入漂洗液，离心弃液；
[0110] 7)加入RNase free water,静置lmin，离心，收集液为模板RNA。
[0111] 2. One St印 RT-PCR 扩增体系
[0112] 表 1
[0113]
【权利要求】
1. 一种病毒RNA检测引物的设计方法，其特征在于由以下原则组成： (1) 选择病毒基因组RNA最保守区域，通常为5' -UTR区进行引物设计； (2) 将该病毒各型别在5' -UTR区的共同序列作为引物设计的选择区域，并将共同序 列在二级结构中定位； (3) 共同序列中位于5' -UTR二级结构的"茎"上的区域作为引物设计的首选区，尽量 避开"环"结构； (4) 正反引物设计应尽量靠近5' - UTR的3'端； (5) 将最靠近5' -UTR的3'端，位于"茎"上的18-21nt的序列选为forward引物互 补区； (6) 将第二靠近5' - UTR的3'端，位于"茎"上的18-21nt的序列选为probe探针的 互补区； ⑵将第三靠近5' - UTR的3'端，位于"茎"上的18-21nt的序列选为reverse引物； (8) forward引物、probe探针、reverse引物之间不要有重合区域； (9) 扩增的目的片段跨越的"环"越少越好，即目的片段越小越好。
2. 根据权利要求1所述的一种病毒RNA检测引物的设计方法，其特征在于：所述（1)的 5' -UTR的二级结构为各RNA病毒专属的、国际公认的二级结构。
3. 根据权利要求1所述的一种病毒RNA检测引物的设计方法，其特征在于：所述⑵共 同序列是该病毒各亚型的RNA序列通过clustalX多重序列比对程序比对所得的共同序列。
4. 一组检测HCV病毒RNA的核苷酸序列，其特征在于：包括引物序列、探针序列和阳性 序列，其中引物序列为序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，探针序列为 序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，阳性序列为序列表SEQ ID No. 4所示的核苷酸序 列。
5. -种HCV病毒RNA检测试剂盒，其特征在于由以下检测试剂组成： (1) HCV RNA提取试剂： 1) 裂解液：含异硫氰酸胍的溶液； 2. RNase inhibitor :含有RNase抑制剂的溶液； 3) 去蛋白液：含有异丙醇的溶液； 4) 漂洗液：含有75%的乙醇的溶液； 5) 洗脱液：RNase free water ; 6. RNA吸附柱； (2) 0neSt印RT-PCR荧光检测试剂： 1. PCR 反应液（PCR buffer); 2. dNTP 混合液（dNTP mix); 3) 引物 A(primer forward) :5, -GCTGCACGGTCTACGAGAC-3，（SEQ ID No. 1); 4) 引物 B(primer reverse) :5, -GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3'（SEQ ID No.2); 5) 荧光探针（probe):5'-CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3'（SEQIDNo·3)，探针标记 ：5' 荧光基团是FAM标记，3'淬灭基团是MGB标记； 6) 酶混合物（Enzyme Mix):含有Taq酶和逆转录酶； (3) 对照品 1) 阴性对照：HCV阴性的健康人血清； 2) 强阳性对照：含有3X 107的HCV5' -UTR的非传染性体外转录RNA(SEQ ID No. 4); 3) 弱阳性对照：含有3X 103的HCV5' -UTR的非传染性体外转录RNA(SEQ ID No. 4)。
6. 根据权利要求5所述的一种HCV病毒RNA检测试剂盒，其特征在于：所述（2)中引物 A为5' -GCTGCACGGTCTACGAGAC-3'，是根据本发明的引物设计原则选出的最靠近5' - UTR 的3'端区域的互补序列。
7. 根据权利要求5所述的一种HCV病毒RNA检测试剂盒，其特征在于：所述（2)中引 物B为5 ' -GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3 '，是根据本发明的引物设计原则选出的第三靠近 5' -UTR的3'端的序列。
8. 根据权利要求5所述的一种HCV病毒RNA检测试剂盒，其特征在于：所述（2)中荧 光探针（probe) :5' -CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3'，是根据本发明的引物设计原则选出的 第二靠近5' -UTR的3'端区域的互补序列。
9. 权利要求1至4中任何一项所述的一种病毒RNA检测引物的设计方法在HCV RNA发 生降解的血清检测中的应用、在临床上检测HCV感染患者血清中的应用、在献血者血液筛 查中的应用、或在检测其他RNA病毒中的应用。
10. 权利要求4至8中任何一项所述的一组检测HCV病毒RNA的核苷酸序列或一种HCV 病毒RNA检测试剂盒在HCV RNA发生降解的血清检测中的应用、在临床上检测HCV感染患 者血清中的应用、在献血者血液筛查中的应用、或在检测其他RNA病毒中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104120194SQ201410390106
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】李金明, 陈利达, 李文丽 申请人:卫生部北京医院