人体原始干细胞自体同源培养基及其应用的制作方法

专利名称：人体原始干细胞自体同源培养基及其应用的制作方法
技术领域：
一般而言，在细胞疗法允许使用的情况下，本发明与人体自体同源原始干细胞的获取和操作有关。特别地，本发明不仅提到了这些细胞的自体同源培养基，也提到了该培养基在上述细胞和含上述细胞合成物的培养与繁殖中的用途。
背景技术：
在大多数破坏性或丧失功能的疾病治疗中，如神经退化病(帕金森症和阿尔茨海默氏病)、糖尿病、肌肉疾病、心脏病和肝衰竭等，允许更换或修复受损细胞或组织的治疗策略发展是生物医学研究的最大挑战之一。
细胞疗法是最有前景的治疗策略之一，它基于以下众所周知的事实可获取没多少差别的细胞，它们能够自我分裂生成功能迥异的细胞；而且，有时候它们甚至能自我复制。这些细胞包括干细胞和原始细胞(前驱细胞)，应该被共称为原始干细胞，可在胚胎甚至是成年人组织中找到。因此，细胞疗法就是将足量的原始干细胞移植或植入到病人身体，以修复或恢复受损器官的功能。
细胞疗法的推荐方法之一是基于原始干细胞的使用，这些细胞可来源于成年人、动物(异基因细胞)、捐赠者(外源细胞)或合适的病人(自体同源细胞)。自体同源原始干细胞的使用可避免其它细胞疗法的某些不利情况，如缺乏捐赠者、需要进行免疫抑制处理以避免病人的排斥反应、以及与使用胚胎细胞相关的伦理局限。
尽管如此，细胞疗法成为事实、发展每个病例中合适细胞及如何识别的更好知识、和发展原始干细胞的正确操作程序以利于临床使用仍是必要的。
对于心脏病(缺血性心脏病，心功能不全等)的治疗，自体同源细胞心肌成型术是细胞疗法的具体范例。最新的常规说明可见于Curr.Control.TrialsCardiovasc Med.2001；2208-210(D.A.Taylor)。用于细胞心肌成型术的原始干细胞的隔离、培养、繁殖和使用程序与成分可见于US5130141，WO/0107568，WO/0194555，WO79854301，US2001/0038837和US5543318。

发明内容
一般而言，本发明面临提供适用于细胞疗法的自体同源人体原始干细胞的困难。特别是对于原始干细胞在临床使用的正确操作，包括细胞的获得、培养、净化和繁殖，面临制订有效程序的困难。
本发明提出的解决方案基于发明者使用自体同源培养基过程中观察到的事实。该培养基由人体自体同源血清、营养物和抗凝血剂组成，可在体外培养。人体原始干细胞的净化与繁殖可用于加工药物合成物，通过细胞疗法治疗各种病症。
本发明通过以下方面阐释获取自体同源培养基，该培养基由营养物、人体自体同源血清、肝磷脂和精蛋白组成；该培养基用于体外培养；人体自体同源肌肉原始干细胞的净化与繁殖非常有用，可用于制作合适的药物合成物，通过自体同源细胞心肌成型术治疗缺血性心肌病和先天性心肌病。
一方面，本发明与人体自体同源原始干细胞培养基有关，该培养基由人体自体同源血清、营养物、抗凝血剂和具有反转阻凝作用的试剂组成。
另一方面，本发明与上述的人体自体同源原始干细胞培养基的制备方法有关。在特殊的工具中，利用血浆除去法分离出人体自体同源血清，用于该培养基的制备。
另一方面，本发明与上述培养基的使用有关，使用范围包括人体自体同源原始干细胞的体外培养、纯化和繁殖。
另一方面，本发明与人体自体同源原始干细胞合成物的获取方法有关。该方法包括上述人体自体同源原始干细胞在上述培养基中的培育，以及所获的人体自体同源原始干细胞的纯化。
另一方面，本发明与人体自体同源肌肉原始干细胞合成物的获取方法有关，该合成物对细胞疗法中干细胞的使用很有用处。该获取方法包括上述人体自体同源原始干细胞在上述培养基中的培育，以及所获的人体自体同源原始干细胞的纯化。
另一方面，本发明与富集在人体自体同源肌肉原始干细胞中的合成物有关。
另一方面，本发明与一种药用合成物有关。该合成物由人体自体同源肌肉原始干细胞，以及一种或多种从药物的观点看来可接受的赋形剂组成。
另一方面，本发明与被称为自体同源细胞心肌成型术的治疗方法有关。该治疗方法通过植入由人体自体同源肌肉原始干细胞、心脏组织再生器和在自体同源培养基中进行体外繁殖组成的药用合成物，生成、再生和修复受损的心肌组织。


图1是表征左心室功能评价的直条图，该评价通过分析左室射血分数得出。左室射血分数是在外科手术前(基础值)、细胞移植后40天访视(40天)和细胞移植后3个月访视(3个月)时，通过二维超声波心动图和边界自动探测(ABD)计算得出。
图2显示灌注评价结果，该结果是在外科手术前(基础值)和细胞移植后3个月(FU3个月)时，利用13N-铵进行PET成像和利用PET 18F-FDG测定葡萄糖的代谢得出。图2A对应于5号病人心脏的影像，它表征接受细胞移植的典型病例。图2B对应于9号病人心脏的影像，该病人未接受细胞移植(骨骼生肌细胞培养受到了污染)。箭头表示外科手术前后梗塞组织的情况。
具体实施例方式
1.自体同源培养基首先，本发明与人体自体同源原始干细胞的一种自体同源培养基有关，以下称为“本发明的自体同源培养基”，它由以下成分组成1)占0.1～90％重量的人体自体同源血清；
2)含量为0.1％～10,000UI/ml的肝磷脂；3)含量为0.1％～10,000UI/ml的精蛋白；和4)含基本营养物(含有或不含谷酰胺)的培养基，它应有足够的数量，可占重量的100％。
本发明的自体同源培养基完全由人体自体同源血清加工而成，该血清来自于即将进行人体自体同源原始干细胞移植的病人。若有要求，人体自体同源血清可进行常规处理以降低补体的活性，如热处理。
人体自体同源血清可通过常规处理从即将进行人体自体同源原始干细胞移植的病人身上取得，例如来源于病人的血样，或最好用血浆除去法从上述病人身上取出。在本发明的特殊工具中，血浆除去法通过使用肝磷脂作为抗凝血剂和使用精蛋白硫酸盐起反向阻凝作用来完成。众所周知，血浆除去法通常使用ACD(酸-柠檬酸盐-葡萄糖抗凝血剂溶液)进行。例如，在1升水中加入柠檬酸一水合物(8g)，柠檬酸盐(22g)和葡萄糖一水合物(24.5g)作为抗凝血剂，然后为了反转ACD的影响和用血浆除去法获得血清，有必要加入钙，钙会在以后干扰细胞的培养。血浆除去法处理允许获得非常高的血清供应，比从病人血样中获得血清的方法好。由于在此处的血浆除去法中病人没有血液损失，这对病人非常有利。此外，使用来自于血浆除去法含有肝磷脂和精蛋白的血清会使它在培养基中的使用没有细胞培养的后续麻烦。
本发明的自体同源培养基含有基本的营养物，并可选择是否含有谷氨酸。可得到含细胞培养基本营养物的商业基质。原则上本发明可使用任何能为细胞培养提供基本营养物的基质。特别地，HAM F12[GIBCO BRL]基质含有这些营养物。
特别地，本发明的自体同源培养基还另含有一种抗生素。实际上，本发明目前可使用任何抗生素。特别地，本发明的自体同源培养基含有青霉素、链霉素、庆大霉素和它们的混合物四者之一。同样地，如果愿意，本发明的自体同源培养基可含有抗真菌剂，例如两性霉素B，和/或生长因素，例如成纤维细胞生长因子如天然或重组体基本成纤维细胞生长因子(bFGF)。
特别地，本发明的自体同源培养基由以下成分组成
HAM F12基质，占重量的89％；10％来自于病人的自体同源血清；肝磷脂0.1～10,000UI/ml；精蛋白0.1～10,000UI/ml；和1％青霉素/链霉素和，可选0.25mg/ml两性霉素B和/或0.1～250pg/ml重组体基本成纤维细胞生长因子(bF00000GF)。
2.本发明的自体同源培养基制备方法另一方面，本发明与本发明提供的人体自体同源原始干细胞培养基的制备方法有关，它包括将此处的不同组分混合搅匀。
如前所述，在较有利的方式中，上述人体自体同源血清通过血浆除去法获得，使用肝磷脂作为抗凝血剂取得血浆，使用精蛋白起反转阻凝作用获得血清。通过这种方式获得的人体自体同源血清中含有肝磷脂和精蛋白。
3.使用本发明的自体同源培养基另一方面，本发明与本发明的自体同源培养基使用于人体自体同源原始干细胞体外培养、纯化和繁殖有关。
在培养基中使用人体自体同源血清繁殖人体自体同源原始干细胞有许多好处，例如，细胞繁殖可在世界上的任何地方进行，没有蛋白感染素疾病、病毒和动物寄生虫病污染的风险，而这些风险对于使用牛胎儿血清用于细胞生长的细胞培养传统技术是固有的。在人体细胞培养中使用人体自体同源血清取代牛血清有极大的益处，如(1)它避免了抗原-抗体反应；(2)它避免了异种蛋白引起的炎性反应；和(3)它避免了重复性的灌洗导致的细胞破坏，因为在引入人体之前，细胞需先在牛血浆中培养。实际上，目前的自体同源细胞心肌成型术的临床经验表明，用牛血浆培养的细胞治疗2周后，病人有恶性心室心律不齐现象，40％病例有并发症，需要可植入性去颤器。
4.人体自体同源原始干细胞合成物的制备方法另一方面，本发明与人体自体同源原始干细胞合成物的制备方法有关，它包括在本发明的自体同源培养基中孵育上述人体自体同源原始干细胞，并且纯化获得的人体自体同源原始干细胞。
实际上，任何人体自体同源原始干细胞都可以在本发明的自体同源培养基中培养和繁殖，在每个实例中，自动适应基质的状态培养具体的细胞类型。尽管如此，特别的认识详述于下一节，那些人体自体同源原始干细胞是人体自体同源肌肉原始干细胞。
人体自体同源原始干细胞可通过活组织检查的方式从即将植入人体自体同源原始干细胞的合适的病人身上获得。
允许细胞生长和分裂的情况下，在本发明的自体同源培养基中孵育人体自体同源原始干细胞。
人体自体同源原始干细胞的纯化可通过常规方法达到。特别地，上述人体自体同源原始干细胞的纯化由免疫和纯化组成，它通过使用人体自体同源原始干细胞的特殊和选择性抗体进行，允许识别上述人体自体同源原始干细胞的体外抗原特征。方便的是，上述人体自体同源原始干细胞的特殊和选择性抗体通过磁性细胞分离器的方式联合形成磁性微球，以纯化和富集人体自体同源原始干细胞。
前述方法获得的人体自体同源原始干细胞可作为药物合成物的形式，用于基因治疗。
5.人体自体同源肌肉原始干细胞的获取方法如前所述，特别地和优先地，本发明的人体自体同源原始干细胞是指人体自体同源肌肉(生肌细胞)原始干细胞。
因此，另一方面，本发明与人体自体同源肌肉原始干细胞的获取方法有关，适宜于在细胞疗法中使用，该方法包括上述人体自体同源肌肉原始干细胞在前述培养基中孵育和纯化。
人体自体同源肌肉原始干细胞可通过活组织检查的方式，特别是骨骼肌肉活组织检查，从即将植入人体自体同源原始干细胞的合适的病人身上获得。
以前研究表明，在活组织检查区域进行活组织检查之前，将含有刺激人体自体同源肌肉原始干细胞增殖药剂的药物合成物引入病人体内，以便在最初培养时增加上述细胞的数量。特别地，在进行骨骼肌肉活组织检查之前，本预处理通过肌肉将含有上述刺激人体自体同源肌肉原始干细胞增殖药剂的药物合成物引入病人体内，通常时间为活组织检查前15分钟到2天，引入位置为将进行活组织检查的区域。特别地，上述药剂为局部止痛药，如利多卡因或丁哌卡因，可刺激成肌细胞增殖，这可在以后细胞培养的高效率反映出来。
通过骨骼肌肉活组织检查收集到肌肉组织样品，该样品经过常规处理消化肌纤维，这在下文会详细描述。产生的细胞悬浮液在本发明的自体同源培养基中培养。一般而言，通过肌肉活组织检查萃取的样品含有不同组织，如脂肪细胞、成纤维细胞、mesenquimal原本、造血干细胞、肌纤维、维管组织(内皮，平滑肌)、和显然地，成肌细胞和卫星细胞。典型地，从活组织检查萃取的骨骼肌肉样品中被定义为CD56+/CD45-的人体自体同源肌肉原始干细胞含量低于10％。同样地，还含有小百分比的很难鉴定的干细胞(卫星细胞)，它们可自我复制并向肌肉细胞分化。这些肌肉细胞的抗原表达为CD56，可能是肌肉原始细胞。目前已知道，该细胞分化程序包括以下步骤卫星细胞转化成成肌细胞，然后长成不成熟肌细胞，再长成成熟肌细胞，最终长成肌纤维。肌肉原始细胞可能是成肌细胞和肌细胞(成熟和不成熟)，这可通过抗原CD56的存在、肌间线蛋白的胞质内表达和抗原CD45的缺失(就是说，它们表现出显型CD56+/肌间线蛋白+/CD45-)确认。在细胞培养过程中，卫星细胞和成肌细胞不断增殖，最终变成肌细胞。因此，经过孵育和细胞繁殖，培养基中累积了成肌细胞和肌细胞(成熟和不成熟)，它们用于药物合成物的加工，以便将人体自体同源肌肉原始干细胞注射到病人体内。一旦被注射，它们就会在合适的病人体内结束分化过程，长成肌肉纤维或肌纤维，显现其功能。
人体自体同源肌肉原始干细胞在本发明的自体同源培养基中的孵育在允许细胞繁殖(生长和分化)的条件下进行。
人体自体同源肌肉原始干细胞的纯化可用常规方法进行。特别地，上述人体自体同源肌肉原始干细胞的纯化包括其特定和选择性抗体的使用，该抗体可识别上述人体自体同源肌肉原始干细胞的细胞外抗原特征，例如，人体抗体抗CD56(CD56是一种骨骼肌肉的细胞外抗原特征)在没有造血细胞的特定抗原CD45时出现(这就是说，选择了显示显型CD56+/CD45-的细胞)。
上述抗体通过磁性细胞隔离器的方式联合形成磁性微滴，纯化和富集人体自体同源肌肉原始干细胞。特别地，在进行人体自体同源肌肉原始干细胞的识别和隔离之前，细胞培养先进行平皿接种以去除不良的成纤维细胞。在这种情况下，人体自体同源肌肉原始干细胞的纯化由以下步骤组成细胞培养先进行平皿接种以去除全部或部分不良的成纤维细胞，然后，使用人体抗体抗CD56选择性地联合形成磁性微滴，识别和隔离人体自体同源肌肉原始干细胞，选择出显示显型CD56+/CD45-的细胞。
按照前述方法获得含有人体自体同源肌肉原始干细胞的合成物构成了本发明的另一方面。
作为选择，本发明提供了获取人体自体同源肌肉原始干细胞的程序，即从骨骼肌肉活组织检查开始制备药物合成物，它包括1)对即将植入人体自体同源肌肉原始干细胞的病人施行活组织检查，提取含有人体自体同源肌肉原始干细胞的骨骼肌肉组织片段；2)在允许繁殖的条件下，上述来自骨骼肌肉的人体自体同源肌肉原始干细胞在本发明的自体同源培养基中培养；3)上述培养的人体自体同源肌肉原始干细胞纯化；和4)收集上述纯化的人体自体同源肌肉原始干细胞；和可选地，5)冷冻上述纯化的人体自体同源肌肉原始干细胞，直到开始制备该药物合成物。
如前所述，在实施活组织检查前2天到15分钟时间内，在将要进行活组织检查的区域，对病人局部注射利多卡因或丁哌卡因，刺激人体自体同源肌肉原始干细胞的增殖，以便在培养的初始阶段增加该细胞的数量。
在允许繁殖的条件下，来自于骨骼肌肉的人体自体同源肌肉原始干细胞在本发明的自体同源培养基中培养。它包括一系列的常规预处理，例如灌洗-去除脂肪组织，肌肉剥落，酶分解，过滤，和通过如沉淀的方法收集细胞。一般而言，肌纤维经过酶消化会生成含大量细胞碎屑的细胞悬浮物。经过培养阶段，细胞和纤维碎片被去除，该悬浮物富集在肌肉原始干细胞中。
纯化培养的人体自体同源肌肉原始干细胞的目的，是为了获得在不含成纤维细胞的人体自体同源肌肉原始干细胞中富集的合成物。为达到该目的，细胞培养可进行第一阶段的平皿预处理，它可使成纤维细胞比成肌细胞或卫星细胞更快沉淀。然后通过任何常规方法，对上述人体自体同源肌肉原始干细胞进行后续的识别和分离处理，例如，通过使用该细胞特殊和选择性抗体，可识别上述显示CD56+/CD45-表型的人体自体同源肌肉原始干细胞，通过特定可识别人体自体同源肌肉原始干细胞的抗体，选择性地联合形成磁性微滴。
另一方面，本发明与一种药物合成物有关，该药物含有人体自体同源肌肉原始干细胞，和至少一种从药物观点看来可接受的赋形剂。特别地，该药物适宜于从肠胃外引入病人体内。从原理上看，任何从药物观点看来可接受和能够传送人体自体同源肌肉原始干细胞的赋形剂均可用于本发明。特别地，该药物合成物包括白蛋白，它可用作赋形剂使人体自体同源肌肉原始干细胞重新悬浮。
使用于现有发明的术语“药物合成物”是指为用于细胞植入治疗而制备的人体自体同源肌肉原始干细胞合成物。它包括至少2,000万细胞，细胞密度至少为5,000万细胞/毫升，和至少40％自体同源原始干细胞CD56+/CD45-，本发明的自体同源培养基，和至少一种从药物观点看来可接受的赋形剂。特别地，该药物合成物由以下成分组成2,000万到2亿细胞，细胞密度为5,000万～7,000万细胞/毫升，至少70％自体同源原始干细胞CD56+/CD45-，本发明的自体同源培养基，和数量占总重量0.1％到20％的人体白蛋白。
根据前述方法获得的人体自体同源肌肉原始干细胞以及含有它们的药物合成物，可用于制备下列药物合成物用于修复和/或重组心肌组织，和/或用于后天性局部缺血心机能不全的治疗，和/或用于治疗扩张性心肌病和/或用于治疗非缺血性心肌病。
6.治疗程序另一方面，本发明与自体同源细胞心肌成型术的治疗程序有关，它通过植入含有人体自体同源肌肉原始干细胞的药物合成物，生成、再生和修复受损的心肌组织，因为该合成物有再生心脏组织、在自体同源培养基中保持体外繁殖的能力；上述程序包括收集来自于即将进行植入手术病人的含有人体自体同源肌肉原始干细胞的材料样品，通过本发明提供的自体同源培养基培养进行细胞繁殖，和将自体同源原始干细胞植入该病人身体。
具体而言，本发明提供了自体同源细胞心肌成型术程序，它通过植入含有人体自体同源肌肉原始干细胞、心脏组织再生器和在自体同源培养基上保持体外繁殖的药物合成物，生成、再生和修复受损的心肌组织；上述程序包括以下步骤1)对取自病人的骨骼肌肉进行活组织检查，最好是通过肌肉注射局部麻醉剂进行预处理，如利多卡因或丁哌卡因；2)从病人体自体同源血清开始制备人体自体同源原始干细培养基；3)从1)中活组织检查和2)中培养基开始，制备富集了人体自体同源肌肉原始干细胞的合成物；4)从3)中合成物开始，制备药物合成物；和5)在心肌损坏位置植入含自体同源原始干细胞的药物合成物。
人体自体同源肌肉原始干细胞包括成肌细胞和肌细胞(成熟和不成熟)，当植入心脏肌肉时，有再生心脏组织的能力。
与在本现有说明中使用的一样，术语“心肌损坏”指局部缺血性和先天性心肌病。特别地，根据本现有发明，自体同源细胞心肌成型术程序应用于没有进行外科手术或经皮肤的血管再生可能性的由心肌梗塞引起的局部缺血性心肌病病人，以及交替性心血管再生病人。自体同源细胞心肌成型术的目的是限制梗塞的扩大，心脏组织重塑和心肌再生。缺血性心肌病的定义包括右或左心室梗塞，后一种情况伴有可能的二尖瓣局部缺血性回流。另一方面，根据本现有发明，自体同源细胞心肌成型术程序应用于先天的扩张性心肌病病人。
细胞心肌成型术的优点有纤维化的减少，损害伤疤区的缩小和心室壁弹性与性能的改进(对于恢复心脏舒张性能很重要)。
特别地，在心肌损坏病例中，通过直接注射植入4)中含自体同源原始干细胞的药物合成物。如同本现有发明使用的一样，术语“通过直接注射植入”指将本发明的药用合成物通过心外膜或血管引入患有局部缺血性或先天性心肌病的病人体内。特别地，按以下百分率分布将本发明的药用合成物通过心外膜或血管引入患有局部缺血性或先天性心肌病的病人体内约70％在损坏的周围区域，和约30％在伤疤中部。心外膜引入可通过常规的外科手术暴露或胸腔镜检查完成。在外科手术接近法(典型的或小型的胸腔镜检查/胸骨切开术)中，损坏区域暴露良好，可允许在损坏区和主要在周围区域实施治疗合成物的注射。含有本发明提供的人体自体同源肌肉原始干细胞的药物合成物注射也可在损坏周围区域进行。按照本现有发明建议的植入物分布，通过残余物冲洗法，植入细胞主要存活在周围区域和现有的并行心肌再生血管，在某种程度上避免了在高度纤维化的局部缺血伤疤处植入后观察到的高细胞死亡率。
另一方面，经由皮肤静脉通过全身性或冠状动脉内引入，在心肌损坏处植入4)中含有自体同源原始干细胞的药物合成物。
另一方面，按照现有发明，自体同源细胞心肌成型术程序应用于患有先天扩张性心肌病病人时，要在两个心室心肌的冠状动脉中成倍数的植入本发明提供的药物合成物。
如今，我们可为它们在心脏外科手术的使用提供新的计算机化的外科手术系统。机器人辅助操作的冠状脑桥或借助于胸部入口的旁路越来越多，因为它可使病人降低感染风险并快速安全的恢复，同时还有极佳的美容效果。特别地，针通过视频控制的机械手插入心肌，注射器位于胸外部，通过小直径的扩张器管道与针相连。这种接近方法对心功能不全病人的好处是自体同源细胞心肌成型术的治疗程序可安全地进行，不需要心脏操作，避免血动力学改变和心室纤维颤动导致的风险。
细胞心肌成型术的有益影响可能会受到注射细胞死亡率的限制。为解决这个问题，本发明建议定期通过经皮肤注射或外科手术植入本现有发明的自体同源原始干细胞。该方法可能会达到心肌成型术的目标，逐渐减少梗塞区域或病理性心肌。为了该目标，本发明包括在每个个人的细胞培养程序中，从隔离和冷冻细胞开始，为每一个病人定制自体同源原始干细胞库。从储存的自体同源原始干细胞开始，新的细胞培养可直接进行繁殖，用于制备新的合成物，避免新的活组织检查或组织消除。
以下例子用于本发明的举例说明和解释此处的非限定性目的。
例1本例子说明了用于自体同源细胞心肌成型术程序的人体自体同源肌肉原始干细胞的获取和操作。该细胞的使用目的是在活着的组织学结构里，恢复损坏的功能紊乱的心肌组织，以便心脏能产生收缩压和舒张压。
1.1骨骼肌肉活组织检查在进行外科手术活组织检查的前一天，将2％浓度的利多卡因溶液通过肌肉注射到病人体内，注射位置在大腿肌肉前外侧和周围。在大腿肌肉前外侧切开一个5cm的切口进行活组织检查，在无菌的条件下，插入2到3cm3的骨骼肌肉片段(15g)。用剪刀分解取出的肌肉组织后，马上插入准备好的培养基或磷酸盐缓冲液(PBS)中，并保存在4℃。为保证细胞的存活，应尽可能快的开始细胞隔离、纯化和培养程序。在低温下，样品存放在合适的容器中运送到细胞生物实验室。
1.2制备自体同源培养基来自于血样在输血服务处，从病人身上抽取静脉血液。用静脉穿刺方法充满50只10毫升试管，用于血清收集。在细胞和纤维蛋白沉淀后，在处于层流条件的小室中，每只试管中的血清被萃取出来，收集到空的血袋中。采取的血清样品用于血液学和微生物试验(细菌和病毒)。装有血清的带子在-80℃冷冻，等候血液学和微生物试验的结果。
制备培养基之前，血清补充物在56℃加热钝化1小时，然后过滤。部分血清与培养基结合，保存在4℃，然后加热到37℃并过滤，最后加入到有细胞培养基的瓶中。最终的培养基中含有10％的病人自体同源血清，89％ofHAM-F12(GIBCO-BRL，目录编号21765)基质，1％青霉素/链霉素，肝磷脂(2UI/ml收集的血清)，精蛋白(磷酸盐形式)，(3UI/ml收集的血清)，可选择是否含有两性霉素B(0.25mg/ml)和/或0.1到250pg/ml的重组体bFGF。
剩余的人体血清冷冻在-40℃，等待制备新的培养基。在每次培养基制备时，补充液都要在56℃钝化1小时后过滤。
来自于血浆除去法开始血浆除去法程序后，病人马上引入50UI/kg剂量的非馏分肝素钠。血浆除去法过程按照使用设备的预期例行程序执行。在血浆除去法过程中，用含有肝磷脂的0.9％氯化钠生理盐水作抗凝血剂取代标准的抗凝血剂。血浆用5％白蛋白代替。一旦取得制备自体同源培养基需要体积的血浆，该程序将结束。收集的血浆中肝磷脂的数量根据病人血浆体积计算，每1UI肝磷脂加入1.5UI精蛋白。如此继续直到产生血浆凝结物。萃取的血清分布在冷冻的小等分试样中。如同从血样中收集的血清，该情况下的血清样品在使用前进行血液学和微生物分析。
1.3卫星细胞的隔离和体外繁殖所有操作均在无菌条件下和使用层流室的情况下进行。移植的骨骼肌肉片段在PBS溶液中冲洗。脂肪组织用剪刀清除，肌肉仔细弄碎。肌肉片段重新用PBS溶液冲洗，直到上清液部分看起来干净，在100克时用离心机离心分离5分钟。该组织通过2步连续酶处理离解首先，细胞在胶原酶IA(1.5ml/mg/g组织)中连续孵育1小时。每10分钟对试管进行机械搅拌促进离解。换句话说，试管放在37℃、有往复/轨道搅拌的孵育器(ROSI)中。其次，用0.25胰岛素1X EDTA(2ml)孵育20分钟。冲洗细胞(300克时10分钟)后马上停止酶反应，加入1ml合适的以前取得的病人血清。用40μm网格(网格为着色尼龙)过滤。对留在网格上的碎片重新进行消化程序。最后通过沉淀(300克时20分钟)收集过滤细胞，丢弃上清液。
细胞重新悬浮在新鲜的配好的培养基10％病人自体同源血清，89％HAM-F12(GIBCO-BRL，目录编号21765)基质，1％青霉素/链霉素，可选择是否含有两性霉素B(0.25mg/ml)，它含有肝磷脂(2UI/ml收集的血清)，精蛋白(磷酸盐形式)，(3UI/ml收集的血清)，接种到瓶子中用于细胞培养。然后，在37℃，瓶子在潮湿空气和5％H2O中孵育3星期。瓶子放在没有水平梯度的孵育器中，以避免不正常的细胞增殖，孵育2到3天后，在基质中更新去除血细胞和死细胞。当生长到半融合(50％融合)时，采取培养步骤(分数1∶5)避免在高浓度下出现肌原性分化。在50％融合时，应采取多个步骤阻止多核肌管分化成单核细胞。
在培养的每个步骤，细胞通过胰蛋白酶化作用收集(在孵育器中，1～5分钟期间，每个瓶中加入2ml2.5胰岛素/EDTA)。通过显微镜观察浮着的细胞可验证细胞的完全分离。然后加入配好的培养基停止反应，最后得到的细胞悬浮液分布到另外5个瓶中。在细胞培养过程的每个步骤中，对细菌(好氧和厌氧细菌试验)，病毒核真菌进行控制。
1.4去除成纤维细胞成纤维细胞常常污染培养基，为去除它们，需要获得适当的成肌细胞进行繁殖。在第一遍培育实施过程中，与胰岛素中和后，培养的细胞放在孵育器中30分钟。这段时间足够成纤维细胞沉淀，而大多数成肌细胞(较小)仍留在悬浮液中。收集细胞上清液并转移到新的培养瓶。成肌细胞纯度通过带抗体人抗CD56和细胞内肌间线蛋白染色的流式细胞计测定。含成肌细胞纯度低于50％的样品应进行细胞富集程序。为了这个目的，在第二阶段，在收获细胞后和接种前，用老鼠抗体人抗CD56对已联合的磁性微滴着色。用磁性细胞分离器进行正向选择，可获得在成肌细胞、原始肌肉细胞中高度富集的细胞群落，它表明90％以上细胞中有CD56和肌间线蛋白。
通常地，为获得需要的细胞数量，应进行多次培育。总的而言，在3个星期的末期，可获得2亿多细胞。该数量可在多链培养系统中培育逐步上升。
1.5定制库细胞的隔离在细胞培养过程中，每个病人的可冷冻细胞能够隔离。从这些储存的细胞开始，可进行新的细胞培养繁殖，以周期性重复进行心肌内注射(避免重复进行新的活组织检查)。第二遍培育时，高度富集CD56阳性细胞的样品用5％DMSO冷冻保存，经过冷冻程序最终储存在液氮中。细胞浓度应为2,500～5,000万细胞/毫升。如果有必要，细胞解冻、进行体外繁殖并在成肌细胞基质中培养以备后用(经皮肤植入)。
1.6注射介质细胞植入的日子，收获细胞并在注射介质(0.5％人体白蛋白和配好的培养基)中清洗，在植入前保存在冰中。通过流式细胞计，评价成肌细胞的最终纯净比例。使用Malassez血细胞计数器(用台盼蓝着色)测定细胞浓度和生存能力。同样地，在植入之前，评价细胞培养的无菌性(Gram测试)。
1.7细胞培养程序细胞植入可通过心外膜或心血管引入实施。心外膜引入可通过常规的外科手术暴露或胸腔镜检查实行。在外科手术接近法(典型的或小型的胸腔镜检查/胸骨切开术)中，损坏区域暴露良好，可允许在梗塞区和主要在周围区域完成10次细胞悬浮液注射。为了这个目的，使用23～26Gx4cm弯针。建议的细胞密度约为5,000～7,000万细胞/毫升。注射缓慢进行约15分钟。每次注射后，针孔应该用打印压力堵住(1～2分钟)，避免细胞悬浮液的回流。
成肌细胞植入方案-植入至少2,000万细胞，最好约2亿细胞。
-细胞密度5,000～7,000万细胞/毫升。
-培养时间约21天。
-成肌细胞浓度超过70％-2-8℃平均细胞寿命96小时。
例2
本实例是实施的I/II阶段临床试验，目的是评价含有本发明的人体自体同源肌肉原始干细胞的合成物对患有心肌梗塞病人进行心肌内移植的适宜性和安全性。
材料和方法2.1病人选择本试验对总数为12个病人施行，他们至少在包括进本协议4星期前患过心肌梗塞，他们预计要实行冠状动脉旁路手术。选择病人时，已考虑了年龄(包括30～80岁年龄范围)，心脏功能(左室射血分数超过25％)和没有恶性心律不齐或肌肉营养不良历史，在肝肾功能障碍、HIV、肝炎、怀孕测试中均没有显示阳性结果。
2.2肌肉活组织检查、培养和人体自体同源肌肉原始干细胞特征用作治疗合成物的人体自体同源肌肉原始干细胞制备按例1中描述的实施。
在无菌条件下，用利多卡因氢氯化物进行预处理后，从大腿前外侧肌肉收集肌肉活组织检查样品。在整个程序中，使用了本发明的人体自体同源培养基，它含有79％HAM F12(GIBCO-BRL)基质。如同上例中1.2段说明的一样，病人体自体同源血清通过血浆除去法获得，在前一天施行以取得肌肉活组织检查样品(每个病人取800～2,135ml，平均1,735ml)。
为隔离卫星细胞，用胰岛素e/EDTA(0.5mg/ml和0.53mm EDTA，GIBCO-BRL)孵育进行酶消化，接着用胶原酶(0.5mg/ml GIBCO-BRL)进行酶消化。如上例中说明的一样，实施细胞繁殖和成纤维细胞去除程序。收获的成肌细胞纯度用流式细胞计测量，并用特别的单克隆人体N-CAM(CD56)、CD45和肌间线蛋白抗体着色。
从每个病人取得的平均生肌细胞是221×106(总是在105～390×106范围内)，生肌细胞CD56+/CD45-的平均纯度是65.6±6.4％。
2.3细胞移植在外科程序之前，用电子发射断层扫描(PET)、超声心动图和心电图(Holter心电图24小时)测定每个病人心肌的功能和生存能力。实施肌肉活组织检查后，使用冠状动脉旁路进行身体外循环3到4星期。病人平均接受2次移植(1～4)。
一旦缝合所有移植，重建自发的心脏搏动，细胞植入通过心外膜引入实施，在梗塞区域和周围区域至少重复注射10次。按超声波心动描记术观点，这些区域确认为属于运动功能减退，不能运动或运动障碍。注射使用了眼套管23G(Maersk医药有限公司。Redditch，B98 9NL GB)。在外科程序之前，用超声心动图确认要接受细胞植入的区域，目的是在以后对细胞移植进行监督时评价上述区域的收缩性。
外科程序之后，病人接受连续的遥感技术监测。每6个小时取一次血样，评价心脏坏死酶的存在情况。为防止发炎，手术后使用了甲基强的松龙(500mg)。为防止心脏无节律，据报道用经口乙胺碘呋酮进行了3个月的处理。为了对实施的心肌成型术程序的进行响应监测，用PET(移植后3个月)和超声心动图(移植后40天和3个月)进行跟踪监测。同样地，通过Holter心电图(移植后40天和3个月)监测存在的心律失常情况。
根据法律要求，本协议和所有实施的程序已先前获得临床试验的地方伦理委员会的批准。
超声波心动描记术研究。整体和局部心肌收缩性通过二维超声波心动描记术(用超声系统Sonos 5500，Phillips)测定。局部左心室壁的运动分析按照美国超声波心动描记术协会标准委员会规定的程序施行(Schiller NB等人著，JAM Soc超声波心动描记术.1989；2358-367)左心室被分成16节段，每一节段室壁的运动都进行评价，即1＝正常，2＝运动功能减退，3＝运动不能，4＝运动障碍。局部运动指数(节段性室壁运动指数，WMSI)由评价节段数目分开的每一节段指数叠加和决定。WMSI指数由细胞植入处理过的节段和其它没有处理的节段决定。左室射血分数(LVEF)从心脏内边界的自动探测系统获得(自动边界探测ABD)(Perez JE等人著，J.Am.Coll.Cardiol.1992；19336-344)。每一节段的局部收缩性也通过彩色室壁运动分析技术和组织多普勒进行了评价。评价通过双盲试验进行(没有预先通知的2个独立观察者)。试验中心脏左室的最后舒张体积的重现性为2.8±6.4(CV 5.5％)，左室射血分数(LVEF)的重现性为0.3±4.6(CV 6.6％)。
电子发射断层扫描成像(PET)。在外科手术处理前和细胞移植3个月之后，用PET评价心肌血液流动和葡萄糖的新陈代谢。
灌注和新陈代谢试验在PET断层X光摄影装置(ECAT EXACT HR+，Siemens/CTI，诺克斯维尔，美国)中实施，它可获得62幅轴断面视图，其平面间的空间分辨率为4.5mm。为研究葡萄糖的新陈代谢，生产了示踪剂(18F-FDG)和为了灌注的研究(13N-铵)，在放射性药物试验中心的回旋加速器中进行(旋风18/9，离子柱应用，比利时)。
每个病人的影像原始记录从使用锗-68光源将心脏定位在可视范围，进行2分钟传送试验开始，接着是实行5分钟光子衰减校正结果。紧接着，13N-铵通过静脉注射，以10ml/min的恒定流速进行灌注(9.25MBq/Kg，最大740MBq)。动态影像的获得从注射时刻开始。在20分钟内用可变的持续时间方案拍摄了动态序列的连续影像12x10s，4x10s，4x30s，3x300s。PET数据获得根据参考书目中说明的草案施行(Muzik O等人著，J.Nucl.Med.1993；34336-344)。一旦影像需收集用于灌注评价，推迟50分钟允许13N-铵放射性的自然衰减(裂变的半衰期是9.9分钟)。随后，影像获取从葡萄糖的新陈代谢试验开始，按照正常血糖高胰岛素血症压片钳技术方法施行(Knuuti MJ等人著，J.Nucl.Med.1992；331255-1262)。葡萄糖水平稳定在含量范围为85～95mg/dl 4.6MBq/Kg，最大370MBq之后，用静脉弹丸将18F-FDG注射到体内。获得的18F-FDG系列影像从注射时开始，遵照上述Knuuti等人著的草案说明将持续60分钟(8x15s，2x30s，2x120s，1x180s，4x300s，3x600s)。
结束获得影像后，片段传送完成，进行衰减校正前，新陈代谢试验的影像使用OSEM(有序子集最大期望)方法重组，用了2次迭代和8个子集。所有试验(灌注和新陈代谢)均应用了6mm FWHM(半高宽)高斯滤波器(高斯平滑滤波器)。为了通常分析，轴断面影像根据左心室短轴、垂直长轴和水平长轴重新取向。
最后，在短轴上使用了左心室中部区域6个邻近部分用作定性分析。根据3室模型计算心肌血流绝对速度(Muzik O等人著，J.Nucl.Med.1993；3483-91)和通过Patlak图形分析(Patlak CS等人著，J.Cereb.Blood Flow Metab.，1985；5584-590)估计葡萄糖的利用速率(心肌葡萄糖利用速rMGU)。
结果2.4细胞移植和手术后变化试验中病人的人口统计学、临床和功能特征汇集于下表1和2。
表1 病人特征

缩写词性别。M男；F女NYHA分类“纽约心脏协会”分类FU外科手术和细胞移植3个月后实施的跟踪评价旁路定位。LAD动脉下面左前方；RC右冠状动脉；OM钝形动脉边界；Dg冠状动脉对角线。
在操作冠状动脉旁路过程中，一旦完成了移植，恢复了自发的心脏搏动，梗塞区域可目测，注射3～5ml含有生肌细胞浓度为20×106细胞/毫升的溶液。注射区域用随后的超声波心动描记术识别。进行移植之前，收集好用于上述移植的细胞后，立即实施微生物培养以防污染。由于这个原因，9号病人没有进行移植，因为他的细胞在进行革兰氏染色时显阳性。尽管如此，该病人仍进行了后续的协议试验。
表2 病人特征

缩写词LVEF左室射血分数。
FU外科手术和细胞移植3个月后实施的跟踪评价。
2D二维；ABD心脏内边界自动探测。
病人移植手术后的变化并不表示为并发症。由于在先前的临床试验中，移植骨骼肌肉细胞时已观察到心脏心律不齐，对移植手术后的病人留院监测(连续的遥感技术)，并进行了术后40天和3个月监测(Holter心电图，24小时)。在任何情况下，均观察到了心律不齐大大增加。而且，移植手术后未成熟心室的搏动次数有所减少。但是，6号病人在外科手术40天后出现了断断续续的心室亢进症。在施行外科手术程序过程中，该病人进行了动脉瘤切除术。如何解释这个现象呢？
移植手术后，心脏和肝中酶的血清分析没有表现出重大变化，而且逐渐恢复到其正常比率。在间接测量炎症时，同时测定了蛋白质c。在移植手术后和跟踪监测过程中，没有发现重大变化。
所有病人均已出院，仍然活着。
2.5左心室功能通过二维超声波心动描记术测量，左室射血分数已从外科手术前的35.5±2.3％(平均值±标准平均偏差)增加到移植后3个月的53.5±4.98％(p＜0.05)。用心内膜边界监测(ABD)的自动超声波心动描记术测定的心脏整体收缩性，从39.8±3.26％增加到了56.3±3.1％(p＜0.05)(图1)。
同时，局部收缩性也有改善。运动不能/运动功能衰减/运动障碍的平均数从7(5～10，手术前)降低到3(0～5，移植后3个月)。
局部基础WMSI运动指数从平均1.72±0.14减少到移植3个月后的1.25±0.07(p＜0,05)(表3)。为区分来自于生肌细胞移植和血管再生导致的心脏功能潜在受益，比较了接受细胞移植的节段和未接受细胞移植的节段WMSI指数的改善情况。与基础指数(外科手术前)相比，WMSI在手术后3个月急剧减少，接受细胞移植的节段有较大的减少(表3)。
WMSI的减少与NYHA分类的改善有关联。NYHA分类从2.2±0.2的基础值改善到3个月后的1.5±0.26(p＜0.01)。
表3 局部功能(用节段性室壁运动指数(WMSI)测量)

2.6心肌灌注和可行性研究对7个病人外科手术前(前1～5天)和移植3个月后进行测试，研究灌注(PET-铵)和新陈代谢(FDG-葡萄糖)。对每一区域指定定量的数值比率，评估示踪物的滞留量。在外科手术前所有心肌的平均葡萄糖滞留量为0.158±0.026μmol.g-1.min-1，但术后3个月为0.270±0.008μmol.g-1.min-1(p＜0.05)。通过梗塞区域(心肌梗塞引起的坏死组织)的差动分析，证实了铵和葡萄糖滞留量的显著增加，它表明了在梗塞区域心肌可行性的改善(表4)。也可参见图2。
表4 电子发射断层扫描影像(PET)。通过13N-铵滞留量(ml.g-1.min-1)评估血流和通过18F-FDG(μmol.g-1.min-1)评估葡萄糖的新陈代谢

讨论本研究的主要结论有1.对于有心肌梗塞病史和动过冠状动脉旁路手术的病人，向心肌直接植入自体同源骨骼肌肉细胞是可行而且安全的。2.虽然不能清楚区分旁路手术的衍生影响和细胞移植的衍生影响，功能性和可行性研究表明自体同源生肌细胞的移植有助于改善左心室的收缩性，也有助于组织的修复。3.骨骼成肌细胞能够移植，但最少需要到外科手术后3个月。
尽管为证实骨骼成肌细胞是否能充分地移植，可能有必要直接研究心肌，但通过PET可清楚地显示在梗塞区域葡萄糖滞留量增加，该处以前未探测到有活力的组织，一旦实施移植后，该处就可以探测到有活力的组织。另一方面，虽然本研究没有包括对照病人，但由于细胞培养的卫生物污染，9号病人仅做了冠状动脉旁路手术，在3个月的跟踪监测中没有显示葡萄糖利用有重大改变(图2B)，虽然这些没有最后定性，他的18F-FDG-PET结果是令人鼓舞的。
这些结果表明移植了自体同源骨骼肌肉细胞的冠状动脉旁路显著改善了心脏收缩性，射血分数有明显的增加，特别是WMSI指数有明显降低。从以上结果不能得出心脏功能的改善仅由于旁路。接受了细胞移植的心肌片段显示较高改善，同一片段上葡萄糖的滞留量增加，这一事实表明心脏功能的改善不能完全归功于旁路。为获得自体同源细胞移植是造成心脏功能改善原因的明显证据，有必要进行移植避免其它治疗的共同作用。除非细胞通过经皮注射植入，现今它已不是伦理问题。
其它临床试验的近期研究表明，自体同源骨骼成肌细胞的植入与心脏心律不齐有关(Menasche P等人著，柳叶刀(Lancet)2001；357279-280。Menasche P等人著，J.Am.Coll.Cardiol.2003；411078-1083。Hagege AA等人著，柳叶刀(Lancet)2003；361491-492。Pagani FD等人著，J.Am.Coll.Cardiol.2003；41879-888)。事实上，一些病人要求植入心脏内去颤器。到目前为止，仍不确切知道这些心律不齐的原因，但它们可能与电再入回路的形成(可能由于植入的骨骼成肌细胞连接点处没有间隙)、植入细胞的数量和体积、或自体同源生肌细胞的使用有关。有必要指出，这些草案中使用了牛胎儿血清用作自体同源生肌细胞的培养和体外繁殖，这构成了异基因蛋白源。在3星期的固定时间里，人体细胞与牛血清在上述动物蛋白的细胞表面接触。这些细胞的移植会在纤维化后引起炎症反应。实施的临床病理学试验表明，按照本方法移植的细胞植入了没有进行血管再生的纤维化模式内。该组织结构代表了再入回路的风险，它可诱导严重的心室心律不齐异变。与这些研究不一样的是，在目前的临床试验中，使用了在完全的自体同源培养基上繁殖的自体同源骨骼肌肉细胞，避免了免疫反应。这可解释为什么本临床试验没有观察到这些心律不齐现象。
权利要求
1.人体自体同源原始干细胞的自体同源培养基，包含1)占0.1～90％重量的人体自体同源血清；2)含量为0.1％～10,000UI/ml的肝磷脂；3)含量为0.1％～10,000UI/ml的精蛋白；和4)含基本营养物(含有或不含谷酰胺)的培养基，它应有足够的数量，可占重量的100％。
2.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，上述人体自体同源血清经过了处理，其目的是钝化该补充物。
3.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，上述人体自体同源血清从病人的血样获得。
4.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，上述人体自体同源血清通过对病人供给的血清使用血浆除去法获得。
5.根据权利要求4所述培养基，其特征在于，上述血浆除去法使用肝磷脂作为抗凝血剂、精蛋白硫酸盐作为反抗凝血剂进行。
6.根据上述权利要求任一培养基，其特征在于，另外含有抗生素。
7.根据权利要求6所述培养基，其特征在于，其中使用的抗生素从青霉素、链霉素、庆大霉素和它们的混合物中选出。
8.根据上述权利要求任一培养基，其特征在于，另外含有两性霉素B，和/或成纤维细胞生长因子(FGF)。
9.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，由以下成分组成HAMF12基质占重量的89％；10％来自于病人体自体同源血清；肝磷脂0.1％即100UI/ml；精蛋白0.1％即100UI/ml；和1％青霉素/链霉素和，可选0.25mg/ml两性霉素B和/或0.1～250pg/ml重组体基本成纤维细胞生长因子(bFGF)。
10.权利要求1～9中任一人体自体同源原始干细胞的自体同源培养基的制备方法，它含有人体自体同源血清、肝磷脂、精蛋白、含有或不含有谷氨酰胺的基本营养物的混合物，另外可选是否含有抗生素，和/或两性霉素B，和/或成纤维细胞生长因子。
11.根据权利要求1所述方法，其特征在于，其中所述人体自体同源血清通过血浆除去法获得。
12.权利要求1～9中任一人体自体同源原始干细胞的自体同源培养基的使用，用于自体同源原始干细胞的体外培养、纯化和繁殖。
13.用权利要求1～9中任一人体自体同源原始干细胞的自体同源培养基，制备人体自体同源原始干细胞合成物的方法，包括在人体自体同源原始干细胞的自体同源培养基中孵育所述自体同源原始干细胞，和纯化获得的人体自体同源原始干细胞。
14.根据权利要求13所述方法，其特征在于，使用允许识别上述人体自体同源原始干细胞的细胞外抗原特征的特殊抗体，纯化获得的人体自体同源原始干细胞。
15.根据权利要求14所述方法，其特征在于，其中用于上述人体自体同源原始干细胞的上述特殊和选择性抗体联合生成磁性微滴。
16.获取人体自体同源肌肉原始干细胞的方法，对它们用于细胞治疗很有用，它包括在权利要求1～9中任一人体自体同源原始干细胞的自体同源培养基中孵育上述自体同源原始干细胞，和纯化获得的人体自体同源原始干细胞。
17.根据权利要求16所述方法，其特征在于，其中人体自体同源肌肉原始干细胞的纯化包括使用人抗CD56抗体，可选是否联合形成磁性微滴，和选择显示表型为CD56+/CD45-的细胞。
18.根据权利要求16所述方法，其特征在于，其中人体自体同源肌肉原始干细胞的纯化包括进行细胞培养，然后用平皿预接种，目的是使上述细胞培养中存在的成纤维细胞沉淀；接着，使用人抗CD56抗体，识别和隔离人体自体同源肌肉原始干细胞，可选是否联合形成磁性微滴，和选择显示表型为CD56+/CD45-的细胞。
19.从肌肉组织活组织检查获取人体自体同源肌肉原始干细胞的程序，用于制备药物合成物，它包括1)对即将植入人体自体同源肌肉原始干细胞的病人施行活组织检查，提取含有人体自体同源肌肉原始干细胞的骨骼肌肉组织片段；2)在允许繁殖的条件下，上述来自骨骼肌肉的人体自体同源肌肉原始干细胞在权利要求1～9中任一所述制备的自体同源培养基中培养；3)纯化上述培养的人体自体同源肌肉原始干细胞；和4)收集上述纯化的人体自体同源肌肉原始干细胞；和可选地，5)冷冻上述纯化的人体自体同源肌肉原始干细胞，直到开始制备该药物合成物。
20.根据权利要求19所述程序，其特征在于，在活组织检查区域，在进行活组织检查之前，将含有刺激人体自体同源肌肉原始干细胞增殖药剂的药物合成物局部引入病人体内。
21.根据权利要求19所述程序，其特征在于，其中药剂含有局部麻醉剂，该麻醉剂为利多卡因和丁哌卡因两者之一。
22.根据权利要求19所述程序，其特征在于，其中人体自体同源肌肉原始干细胞的纯化由以下步骤组成细胞培养，进行平皿预接种以去除全部或部分不良的成纤维细胞，然后，使用人抗CD56抗体识别和隔离人体自体同源肌肉原始干细胞，可选择是否联合形成磁性微滴，最后选择出显示显型CD56+/CD45-的细胞。
23.合成物在人体自体同源肌肉原始干细胞中富集，其中含有至少70％在权利要求1～8中任一所述人体自体同源肌肉原始干细胞的自体同源培养基中培养的人体自体同源肌肉原始干细胞。
24.一种药物合成物，包括以下成分至少2,000万细胞，细胞密度至少为5,000万细胞/毫升，和至少40％自体同源原始干细胞CD56+/CD45-，权利要求1～9中任一所述自体同源原始干细胞的自体同源培养基，和至少一种从药物观点看来可接受的赋形剂。
25.根据权利要求24所述药物合成物，其特征在于，包括2,000万到2亿细胞，细胞密度为5,000万～7,000万细胞/毫升，至少70％自体同源原始干细胞CD56+/CD45-，权利要求1～9中任一所述自体同源原始干细胞的自体同源培养基，和数量占总重量0.1％到20％的人体白蛋白。
26.一种自体同源细胞心肌成型术的治疗程序，其特征在于，通过植入含有人体自体同源肌肉原始干细胞的药物合成物，生成、再生和修复受损的心肌组织，因为该合成物有再生心脏组织、在自体同源培养基中保持体外繁殖的能力；上述程序包括收集来自于即将进行植入手术病人的含有人体自体同源肌肉原始干细胞的材料样品，在权利要求1～9中任一所述自体同源原始干细胞的自体同源培养基中培养进行细胞繁殖，和将自体同源原始干细胞植入该病人身体。
27.一种自体同源细胞心肌成型术程序，其特征在于，通过植入含有人体自体同源肌肉原始干细胞、心脏组织再生器和在自体同源培养基上体外繁殖的药物合成物，生成、再生和修复受损的心肌组织；上述程序包括以下步骤1)对取自病人的骨骼肌肉进行活组织检查，最好是通过肌肉注射局部麻醉剂进行预处理；2)从病人自体同源血清开始制备权利要求1～9中任一所述人体自体同源原始干细培养基；3)从1)中活组织检查和2)中培养基开始，制备富集于人体自体同源肌肉原始干细胞的合成物；4)从3)中合成物开始，制备药物合成物； 和5)在心肌损坏位置植入含由4)中人体自体同源原始干细胞的药物合成物。
28.根据权利要求27所述程序，其特征在于，通过在梗塞伤疤周围区域直接注射、或在两个心室的冠脉内注射，植入上述含有人体自体同源原始干细胞的药物合成物。
29.根据权利要求27所述程序，其特征在于，其中上述含有人体自体同源原始干细胞的药物合成物的植入经由皮肤静脉通过全身性或冠脉内引入。
30.根据权利要求27所述程序，其特征在于，其中上述含有人体自体同源原始干细胞的药物合成物的植入通过自动化和计算机化的系统实施。
全文摘要
本发明涉及一种人体自体同源原始干细胞的自体同源培养基，包含占0.1～90％重量的人体自体同源血清；含量为0.1％～10,000UI/ml的肝磷脂；含量为0.1％～10,000UI/ml的精蛋白；和含基本营养物(含有或不含谷酰胺)的培养基，它应有足够的数量，可占重量的100％，本发明培养基可用于自体同源原始干细胞的体外培养和繁殖。包含所述干细胞的合成物能植入病人体内，用自体同源细胞心肌成型术，生成、再生和修复受损的心肌组织。
文档编号A61K35/34GK1665922SQ03815599
公开日2005年9月7日 申请日期2003年6月11日 优先权日2002年7月2日
发明者费利佩·普罗斯珀-卡多索, 吉泽斯·赫雷罗斯-冈萨雷斯, 胡安·卡洛斯·查科斯 申请人:纳瓦拉省科技研究所, 胡安·卡洛斯·查科斯