生产具有预定的翻译后修饰的蛋白质的方法和手段的制作方法

专利名称：生产具有预定的翻译后修饰的蛋白质的方法和手段的制作方法
本申请是申请日为2002年10月29日、申请号02821690.3、发明名称为“生产具有预定的翻译后修饰的蛋白质的方法和手段”的专利申请的分案申请。
发明领域 本发明涉及重组DNA技术领域。本发明还涉及蛋白质的生产。本发明更特别涉及重组蛋白质的生产，所述蛋白质用作药物制剂的治疗活性组分。本发明还涉及哺乳动物细胞系，所述细胞系经鉴别、选择和/或创建以重组生产蛋白质。本发明还涉及如此生产的蛋白质的应用。

背景技术：
用于生产蛋白质的重组细胞表达系统是已知的。这些系统的范围包括从细菌，酵母和真菌至植物细胞，及从昆虫细胞至哺乳动物细胞。生产宿主和表达系统的选择一般依赖于这样的因素，如应用方便，培养成本，生长特性，生产水平及在无血清培养基上的生长能力。已知上述细胞表达系统在发挥翻译同时和翻译后修饰的能力方面也不同，所述修饰如折叠，磷酸化，γ-羧基化，γ-羟基化。尽管意识到重组表达系统的选择对表达的蛋白质的最后结构具有戏剧性的因果关系，但翻译后修饰一般在选择一给定蛋白质的合适表达系统时不起决定性作用。
近年来的研究更多地揭示了人体蛋白质的不同翻译后修饰的复杂性及其对在人体内的功能的潜在内涵。例如，最近的发现提示在血液中发生的人蛋白质的差异糖基化模式(所谓的“血清型”修饰)与在脑脊液中发生的修饰(“脑型”修饰)不同。这种不同也许是设计有效的治疗剂的极为重要的关键问题。
通常地，人神经糖蛋白的特征在于其糖基化，在文献中将其称为脑型糖基化(Margolis and Margolis 1989；Hoffmann et al.1994)。与血清型糖基化蛋白(即在血液中循环的糖蛋白)相反，脑型糖基化蛋白特征性地具有复合型N联糖，其用附着于乳糖胺型触角(antenna)的N-乙酰葡糖胺的α-1，3-连接的岩藻糖修饰，从而形成Lewis x或唾液酸-Lewis x结构(图5)。有两种类型的Lewis x结构一种具有末端半乳糖残基，一种具有末端N-乙酰半乳糖胺(GalNac)残基。如果这些末端基团与唾液酸连接，则所述Lewis x结构称为唾液酸Lewis x结构。血清型和脑型寡糖之间的另一种不同是后者通常含有末端N-乙酰葡糖胺和/或末端半乳糖，而且可以包括一个末端N-乙酰半乳糖胺修饰，而血清型寡糖通常只含有很低量的这种结构。
一般在血清中循环的蛋白质上发现的寡糖通常含有大量半乳糖化结构。这意味着半乳糖与周围N-乙酰葡糖胺连接，从而形成乳糖胺结构。该糖蛋白以此方式被保护免于肝网状内皮细胞和巨噬细胞中存在的N-乙酰葡糖胺受体(即识别末端N-乙酰葡糖胺的受体)胞吞(Anchord et al.1978；Stahl et al.1978)。血清型寡糖通常还含有末端唾液酸(也通常称为神经氨酸)，其保护糖蛋白免于通过脱唾液酸糖蛋白受体而清除。这些清除机制特异性应用于血中循环的糖蛋白并可能在人中枢神经系统(CNS)中缺乏(Hoffmann et al.1994)。
本领域可获得生产包含“血清型”修饰的蛋白质的重组表达系统，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和幼仓鼠肾(BHK)细胞。然而，为生产具有其它修饰如“脑型”修饰的蛋白质，还没有描述这类方便的系统。因此，需要考虑到治疗蛋白质上不同的翻译后修饰的表达系统。特别地，需要包含“脑型”翻译后修饰的蛋白质的有效表达系统。
具有这些特异性需要的蛋白质可以有益于治疗所有种类的疾病，包括与CNS，周围神经系统和心脏组织相关的疾病。影响CNS的疾病包括不同种类的疾病如急性脑损伤，神经变性疾病及其它功能失调如癫痫，精神分裂症和情绪失调。可影响神经细胞和组织的其它病理疾病是由于损伤所致，所述损伤可以是缺氧，癫痫发作，神经毒素中毒，多发性硬化，低血压，心脏骤停，辐射或低血糖所致。神经损伤也可以在手术程序如动脉瘤修复或肿瘤切除期间发生。
具有至少与翻译后修饰中的差异部分相关的不同作用的蛋白质例如是一种已知为促红细胞生成素(EPO)的激素。EPO是一种由于其在将造血干细胞分化为红细胞中的作用而闻名的蛋白质，其还具有一些其它功能，包括在神经组织中的功能。对EPO在CNS的发育中的作用已经有推测(Dame et al.2001)。EPO蛋白还已经在人婴儿和成年人的脑脊液(CSF)中检测到(Juul et al.1997；Buemi et al.2000)。存在于CSF中的EPO表现为在脑中局部产生，因为其不能穿过血脑屏障(Marti et al.1997；Buemi et al. 2000)。EPO表达的调节是组织特异性的，这进一步加强了这样的假想，即EPO具有组织特异性功能，其在脑和骨髓中功能不同(Masuda et al. 1999；Chikumaet al.2000；Sasaki et al.2001)。因此已推测EPO除了其造血功能之外，还可具有神经营养作用。神经营养因子是指体液分子，其作用于神经元影响其发育，分化，维持和再生(Konishi et al.1993)。一些研究结果目前已经表明EPO可作为神经营养因子(例如Sadamoto et al.1998；Brines etal.2000)。除了EPO对红细胞生成和神经保护的所述作用之外，对EPO的其它作用已经有描述，例如在内皮细胞和肌细胞中的作用。本领域已经根据该蛋白质上存在的寡糖的糖基化模式而充分确定了(重组)EPO的作用。人EPO的N联寡糖由于其熟知的生物学活性而非常重要其刺激红细胞生成(Takeuchi and Kobata 1991；Wasley et al.1991；Tsuda et al.1990；Morimoto et al.1996；Takeuchi et al.1989；Misaizu et al.1995)。
在EPO的情况中，与在其它组织如脑中产生的EPO(脑型)相比，还可以将在肾中产生及在血液中循环的这种蛋白质称为血清型EPO(或“肾型”或“尿型”EPO)。本领域已经充分确定了血清型EPO的生产和纯化系统，重组生产的血清型EPO常规地并成功地用于例如患有低红细胞水平的患者中。本领域熟知这种重组EPO必须满足一种稳定的蛋白质的所有要求，可以在血流中循环足够的时间量以能诱导红细胞生成。通常地，基于CHO或BHK的细胞系统用于生产具有这些特性的EPO。然而，得自这种生产和纯化系统的血清型EPO在治疗与中枢或周围神经系统相关的疾病以及在治疗与缺血/再注入引起的疾病相关的疾病中相对无效。这是因为其糖基化模式不适于治疗这些疾病，还因为其强红细胞生成活性所致的红细胞数目增加(红细胞增多症)，在这些非造血病变中认为这种红细胞生成是非希望的副作用(Wiessner et al，2001)。因此，需要一种新的蛋白质如EPO的生产系统，其具有EPO分子的特征性特点，在脑或参与基于选择蛋白的转运或定向的组织中具有活性。另外，需要具有与血清型糖基化不同的翻译后修饰，优选具有脑型糖基化的蛋白质如EPO的药物可接受制剂，及需要提供这些制剂的有效生产和纯化系统。
在不同组织中具有不同糖基化模式从而提示不同糖基化模式的不同作用的蛋白质的另外一个例子是运铁蛋白，其在CSF中以脱唾液酸运铁蛋白形式大量产生，但在血清中不以这种方式出现(Van Eijket al.1983；Hoffmann et al.1995)。
糖蛋白的一个称为选择蛋白的家族在缺血/再灌注损伤中的白细胞粘附于内皮的初始步骤中起重要作用。选择蛋白家族中有三个成员P-选择蛋白，E-选择蛋白和L-选择蛋白。选择蛋白具有一个凝集素结构域，其识别与之结合的糖蛋白配体的糖结构。寡糖中唾液酸Lewis x修饰在与选择蛋白的结合中可能有作用(Foxall et al.1992)。一些研究已经表明选择蛋白和唾液酸Lewis x结构对缺血/再注入模型中白细胞粘附的重要性。例如唾液酸Lewis x寡糖Slex-OS在猫缺血/再注入模型中示出有心脏保护作用，使心脏坏死减少83％(Buerke etal.1994)。另外，专利申请WO02/38168描述了包含唾液酸Lewis x结构的选择蛋白结合蛋白在治疗各种疾病中用作抗炎剂的应用。然而，还没有关于制备包含(唾液酸)Lewis x聚糖的蛋白质的合适表达系统的描述。因此，需要一种蛋白质的重组表达系统，所述蛋白质具有预定的糖基化结构如(唾液酸)Lewis x结构。更一般地，需要重组生产蛋白质的表达系统，所述蛋白质具有预定的翻译后修饰。
表及附图简述 表I可用于鉴定细胞的标记蛋白总览。
表II可用于表1所示一些标记蛋白的阳性对照组织。
表III用于鉴定PER.C6TM细胞系的标记蛋白的抗体的详细信息(供应商和目录号)。
表IVPER.C6TM上标记蛋白的存在记录。
表VPER.C6TM-EPO和Eprex的N联糖的单糖组合物。
表VI观测到的由N-聚糖酶F从在DMEM中由生产EPO的ER.C6TM克隆P7生产的EPO中释放的脱唾液酸N-聚糖的分子离子的MS峰排布。同样质量(m/z)值在Eprex中也发现的峰以下划线示出并以黑体表示。
表VII观测到的由N-聚糖酶F从在DMEM中由生产EPO的PER.C6TM克隆P8生产的EPO中释放的脱唾液酸N-聚糖的分子离子的MS峰排布。同样质量(m/z)值在Eprex中也发现的峰以下划线示出并以黑体表示。
表VIIICHO和PER.C6TM细胞中FUT活性。
表IX观测到的由N-聚糖酶F从在AAL柱上分级分离以选择高和低岩藻糖含量的EPO中释放的脱唾液酸N-聚糖的分子离子的MS峰排布。
表X生产EPO的E1A.EPO和E1A.E1B.EPO HT1080克隆的相对E1A表达和形态学情况。E1A的表达数量通过Western印迹分析确定。选择用*标记的克隆进行EPO生产分析。
表XI从HT1080/Epo克隆033，HT1080/E1A-EPO克隆008及HT1080/E1A.E1B-EPO克隆072中获得的EPO的N联糖的质量分布图的相对存在情况.使用ExPAsy′s计算机程序预测糖组分。表中示出了聚糖的触角(antennae)中存在的氨基己糖，己糖和脱氧己糖数。


图1Eprex，P7-EPO(集合A，B和C)，P8-EPO(集合A，B和C)的N联糖的质谱图。(A)Eprex；(B)P7，集合A；(C)P7，集合B；(D)P7，集合C；(E)P8，集合A；(F)P8，集合B及(G)P8，集合C。
图2PER.C6TM-EPO和CHO-EPO的唾液酸含量。
图3PE-R.C6TM-EPO上存在的Lewis x聚糖结构。
图4在PER.C6TM细胞表面的Lewis x结构表达。
图5Lewis x和唾液酸Lewis x结构的示意图。
图6PER.C6TM-EPO和Eprex在体内对红细胞生成的作用。
图7在未治疗的大鼠(对照)和治疗的大鼠中，基于在再注入开始之后24小时使用MRI产生的ADC图(图7A)和T2图(图7B)的梗塞体积。
图8在三个动物中经单次静脉内注射150eU的Eprex之后，在指定的时间点Eprex的浓度。
图9在用于选择高和低岩藻糖含量的AAL柱上分级分离的PER.C6TM EPO的层析图。
图10A来自AAL柱的级分1-4的N联糖的质谱。B在一个独立的实验中来自AAL柱的级分4的N联糖的质谱。
图11HT1080/EPO克隆033(A)和HT1080/E1A.E1B.EPO克隆058(B)及026(C)的图示。E1A的表达由Western印迹分析示出(D)。E1A表达克隆具有扁平的形态。
图12从HT1080/EPO克隆033和HT1080/E1A.E1B克隆072生产的EPO中释放的N联聚糖的HPAEC-PAD图。底部的线表示无电荷的(0)，单电荷的，双电荷的，三电荷的及四电荷聚糖的洗脱(分别为1-4)。注意到克隆072朝向较少载荷的N联聚糖移动。
图13由三个不同克隆生产的EPO的Maldi-MS分析(A)。所述克隆是HT1080/EPO克隆033，HT1080/E1A-EPO克隆008和HT1080/E1A.E1B-EPO克隆072。后两个克隆示出更复杂的图式。
图14对HT1080/EPO克隆033，HT1080/E1A-EPO克隆008和HT1080/E1A.E1B-EPO克隆072的N联聚糖进行的单糖分析中获得的图示。所示单糖(Fuc＝岩藻糖，GalN＝N-乙酰半乳糖胺，GlcNac＝N-乙酰葡糖胺，Gal＝半乳糖，Man＝甘露糖)的比率参照甘露糖进行标准化。
图15.对用(B，D)或不用(A，C)岩藻糖苷酶处理的HT1080/EPO克隆033(A，B)和HT1080/E1A.E1B-EPO克隆072(C，D)产生的EPO进行Maldi-MS分析。只在衍生自克隆072的EPO聚糖图式中观测到不同。发现m/z值为-2039，-2185和-1892的峰明显改变(C和D)，其极有可能表示含有触角脱氧己糖的推测结构减少。
图16通过IEF分离的不同EPO制剂的各种同种型。EPO-同种型每分子含有0-14个唾液酸。应用以下样品(2000eU/条带)Eprex(A)；神经氨酸酶处理的Eprex(B)；CHO-EPO，总产量(C)；PER.C6TM-EPO，克隆022(D)；frCHO-EPO(E)。
图17用5000eU/kg Eprex，frCHO-EPO，PER.C6TM-EPO或者稀释剂缓冲液(对照)注射的大鼠的血细胞比容(HCR，体积百分比)。与对照组，frCHO-EPO和PER.C6TM-EPO相比，EPO治疗的大鼠显示显著较高的HCR(p＜0.001)。
图18用5000eU/kg Eprex，frCHO-EPO，PER.C6TM-EPO或者稀释剂缓冲液(对照)注射的大鼠血液中网织红细胞的百分比。与对照组相比，经EPO治疗的大鼠显示显著较高的网织红细胞百分比(p＜0.001)。经Eprex和frCHO-EPO治疗的大鼠的网织红细胞百分比均显著高于PER.C6TM-EPO治疗组(p＜0.001)。
图19在用5000eU/kg Eprex，frCHO-EPO，PER.C6TM-EPO或者稀释剂缓冲液(对照)注射后4天，总网织红细胞群的幼网织红细胞(IFR)百分比。与对照组，frCHO-EPO或PERC6-EPO相比，Eprex治疗的大鼠显示显著较高的幼网织红细胞百分比(p＜0.001)。
图20PNGase F(标记为F)和内切糖苷酶F2(标记为F2)的切割位点。
图21用PNGase F(A)和内切糖苷酶F2(B)释放的PER.C6TM-EPO-聚糖的MALDI谱。下部谱图的横坐标以两个谱中相应峰直接彼此在对方之上的这种方式排列(349 Da差异，见正文)。
图22N末端聚糖的一些单糖键。
图23该图的上部示出从PER.C6TM-EPO中释放的脱唾液酸化的聚糖，下部数值是在半乳糖苷酶处理后的谱图中检测的。在括号之间是给定结构中反映的谱的总百分比。所述谱图示于图26。
图24该图的上部示出从与半乳糖苷酶温育的PER.C6TM-EPO中释放的脱唾液酸化的聚糖；中部数值是在用牛肾岩藻糖苷酶处理后的谱中检测的，下部数值是在用GlcNAcase温育后获得的。括号之间的是在给定结构中反映的谱的总百分比。所述谱图示于图26。
图25该图上部示出从与半乳糖苷酶温育的PER.C6TM-EPO中释放的脱唾液酸化的聚糖；中部数值是在用杏仁粉岩藻糖苷酶处理后的谱中检测的，下部数值是在经GlcNAcase温育后获得的。括号之间的是在给定结构中反映的谱的总百分比。所述谱图示于图27。
图26对PER.C6TM-EPO的N联聚糖进行外切糖苷酶处理的MALDI谱。
A.)与PNGase F和神经氨酸酶温育的PER.C6TM-EPO。
B.)与PNGase F，神经氨酸酶和半乳糖苷酶温育的PER.C6TM-EPO。
C.)与PNGase F和神经氨酸酶温育，随后用半乳糖苷酶和牛肾岩藻糖苷酶处理的PER.C6TM-EPO。
D.)与PNGase F和神经氨酸酶温育，随后用半乳糖苷酶、牛肾岩藻糖苷酶和GlcNAc-ase处理的PER.C6TM-EPO。
E.)与PNGase F和神经氨酸酶温育，随后用半乳糖苷酶和杏仁粉岩藻糖苷酶处理的PER.C6TM-EPO。
F.)与PNGase F和神经氨酸酶温育，随后用半乳糖苷酶、杏仁粉岩藻糖苷酶和GlcNAc-ase处理的PER.C6TM-EPO。
发明概述 本发明提供了鉴别、选择和获得哺乳动物细胞的方法，所述哺乳动物细胞能产生蛋白质分子如包含翻译后修饰的肽和蛋白质，其中所述翻译后修饰是预定的而且由表达所述蛋白质分子的哺乳动物细胞带来。本发明还提供了使用本发明方法获得的哺乳动物细胞及在基于其生产蛋白质和/或指示所希望的预定翻译后修饰的翻译后修饰的能力而获得的哺乳动物细胞上获得及生产蛋白质分子如促红细胞生成素(EPO)的方法。
本发明还提供了一种生产包含预定的翻译后修饰的蛋白质分子的方法，包括以下步骤将编码所述蛋白质分子的核酸提供给通过本发明方法获得的一种哺乳动物细胞，由此所述哺乳动物细胞以可表达形式携带所述核酸；在有益于所述蛋白质分子生产的条件下培养所述哺乳动物细胞。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种生产包含预定的翻译后修饰的蛋白质分子的方法，所述方法包括以下步骤鉴别一种具有将预定的翻译后修饰提供给蛋白质分子的能力的哺乳动物细胞；将编码所述蛋白质分子的核酸提供给所述哺乳动物细胞，由此所述哺乳动物细胞以可表达形式携带所述核酸；在有益于所述蛋白质分子生产的条件下培养所述哺乳动物细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产包含预定的翻译后修饰的蛋白质分子的方法，所述方法包括以下步骤鉴别一种具有将预定的翻译后修饰提供给蛋白质分子的能力的哺乳动物细胞；将编码所述蛋白质分子的核酸提供给所述哺乳动物细胞，由此所述哺乳动物细胞以可表达形式携带所述核酸；将所述哺乳动物细胞在有益于所述蛋白质分子生产的条件下培养；分析如此产生的所述蛋白质分子上的所述翻译后修饰；确定所述蛋白质分子上存在的所述翻译后修饰是否包含所述预定的翻译后修饰。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了哺乳动物细胞，其具有神经特征和性质，由此可以生产大量具有“神经或脑型”性质的重组蛋白质。通过使用本发明的方法和手段可以生产携带特异性预定翻译后修饰的重组蛋白如脑型EPO。
本发明另外提供了生产包含预定翻译后修饰的蛋白质分子的方法，所述方法包括以下步骤将编码所述蛋白质分子的核酸提供给通过本发明方法获得的一种哺乳动物细胞，由此所述哺乳动物细胞以可表达形式携带所述核酸；在有益于生产所述蛋白质分子的条件下培养所述哺乳动物细胞，及从哺乳动物细胞培养物中纯化所述蛋白质分子。
在另一个实施方案中，本发明提供了生产包含预定翻译后修饰的蛋白质分子的方法，所述方法包括以下步骤将编码所述蛋白质分子的核酸提供给通过本发明方法获得的哺乳动物细胞，由此所述哺乳动物细胞以可表达形式携带所述核酸；在有益于生产所述蛋白质分子的条件下培养所述哺乳动物细胞；分析如此生产的所述蛋白质分子上所述翻译后修饰；确定所述蛋白质分子上存在的所述翻译后修饰是否包含所述预定的翻译后修饰。
优选地，所述生产蛋白质分子的方法包括从哺乳动物细胞培养物中纯化所述蛋白质分子的额外步骤。更优选的是在本发明的哺乳动物细胞中生产蛋白质分子的方法，其中所述哺乳动物细胞是无限增殖化的和/或表达E1A腺病毒序列。无限增殖化或导入E1A腺病毒序列可在鉴别所获得的哺乳动物细胞之前进行，但也可以在鉴别、选择和/或获得所述细胞之后进行。
本发明还提供了纯化蛋白质分子的方法，其中所述蛋白质分子基于所述分子上存在的预定翻译后修饰而从细胞培养物中纯化，所述预定的翻译后修饰是由生产所述分子的哺乳动物细胞带来的。
本发明还提供了促红细胞生成素样分子的组合物在制备治疗如下疾病的药物中的应用，所述促红细胞生成素样分子选自促红细胞生成素，促红细胞生成素的一或多个突变蛋白，促红细胞生成素的一或多个衍生物，或者各种程度唾液酸化的促红细胞生成素分子的一或多个部分(fraction)的组合，所述疾病选自缺血，再灌注损伤，缺氧引起的疾病，炎症疾病，神经变性疾病，及中枢或周围神经系统急性损害，其中所述促红细胞生成素样分子的组合物与目前用于治疗贫血的促红细胞生成素样分子如epoetin alfa和epoetin beta相比基于蛋白质含量具有较低的体内促红细胞生成活性。本发明还提供了治疗或预防所述疾病的方法，包括施用所述组合物。
在其它方面中，本发明提供了一种在哺乳动物细胞中生产需要糖基化结构的蛋白质分子的方法，所述糖基化结构选自含有(唾液酸)Lewis X和/或LacdiNac的N联聚糖结构，其特征在于所述细胞表达编码腺病毒E1A的核酸，附带条件是当所述蛋白质分子是促红细胞生成素时，所述哺乳动物细胞不是PER.C6TM细胞，当所述蛋白质分子是glycodelin或者C蛋白或者组织因子途径抑制剂时，所述哺乳动物细胞不是HEK293细胞，当所述蛋白质分子是基质金属蛋白酶1时，所述哺乳动物细胞不是HT1080细胞。
本发明的另一方面提供了一种生产富含具有包含(唾液酸)LewisX和/或LacdiNac结构的N联聚糖的蛋白质分子的一种部分的方法，包括以下步骤a)在表达编码腺病毒E1A的核酸的细胞中重组表达所述蛋白质分子；b)分级分离如此产生的蛋白质，从而获得富含具有所述包含(唾液酸)Lewis X和/或LacdiNac结构的N联聚糖的分子的一种部分。
本发明的另一方面提供了一种分级分离一种包含蛋白质分子的混合物的方法，所述蛋白质分子包含Lewis X结构，所述方法利用所述分子与AAL凝集素的结合。在其它实施方案中，提供了如此获得的部分。
本发明另一方面提供了包含促红细胞生成素样分子的组合物，所述促红细胞生成素样分子选自促红细胞生成素，促红细胞生成素的一或多个突变蛋白，及促红细胞生成素的一或多个衍生物，其特征在于每个促红细胞生成素样分子N联聚糖上lewis-X结构的平均数为至少约2.2。在其它实施方案中，所述平均数为至少大约2.6，2.7，3.6，4.1或5.7。另一方面，本发明的组合物或部分用于制备一种药物。
本发明另一方面提供了可在表达编码腺病毒E1A的核酸的哺乳动物细胞中重组产生的促红细胞生成素在制备治疗如下疾病的药物中的应用，所述疾病选自缺血，再灌注损伤，缺氧引起的疾病，炎症疾病，神经变性疾病，及中枢或周围神经系统急性损害。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，所述疾病选自缺血，再灌注损伤，缺氧引起的疾病，炎症疾病，神经变性疾病，及中枢或周围神经系统急性损害，所述方法包括为人或动物治疗对象施用促红细胞生成素样分子的一种组合物，所述促红细胞生成素样分子选自促红细胞生成素，促红细胞生成素的一或多个突变蛋白及促红细胞生成素的一或多个衍生物，其中所述促红细胞生成素样分子的组合物特征在于其可在包含编码腺病毒E1A的核酸的哺乳动物细胞中重组产生。在一些优选的实施方案中，所述细胞是PER.C6TM细胞。详细描述 本发明的实质是提供了适于生产需要预定翻译后修饰的蛋白质的重组生产系统。在第一个方面中，这种重组系统可以根据本发明的方法提供，以鉴别能施加目的蛋白质所需的或者目的蛋白质的指定用途所需的翻译后修饰的表达系统。在第二个方面中，本发明提供了一种生产表达系统的方法，所述表达系统具有将所希望的翻译后修饰施加给需要其的蛋白质的能力。本发明的其它方面包括具有如此产生的预定翻译后修饰的分离的蛋白质，应用方法，及包含这种蛋白质的药物组合物。
本发明因此提供了一种鉴别能生产包含预定翻译后修饰的蛋白质分子的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤a)分析所述哺乳动物细胞产生的蛋白质上的翻译后修饰；b)确定所述蛋白质是否包含所述预定的翻译后修饰。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种选择哺乳动物细胞的方法，所述哺乳动物细胞能生产包含预定翻译后修饰的蛋白质分子，所述方法包括以下步骤a)分析所述哺乳动物细胞中或者所述哺乳动物细胞的细胞表面上一组织特异性标记或组织特异性标记组合的存在与否，当使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术及其它细胞培养方法在所述细胞中生产时，所述标记或所述标记的组合是所述细胞在蛋白质分子上施加预定的翻译后修饰的能力的指示，b)基于所述组织特异性标记的存在与否选择所述哺乳动物细胞。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种从异质细胞群中获得能生产包含预定翻译后修饰的蛋白质分子的哺乳动物细胞的方法，述方法包括以下步骤a)在所述异质细胞群中基于所述细胞生产的蛋白质上的翻译后修饰淘选细胞，b)选择能生产包含所述预定翻译后修饰的蛋白质的细胞。这种淘选可以使用本领域已知方法实现，包括但非限于使用识别预定的翻译后修饰的荧光标记的抗体淘选细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴别能生产包含预定翻译后修饰的蛋白质分子的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤将编码需要并能接受翻译后修饰的蛋白质的核酸提供给所述哺乳动物细胞，由此所述哺乳动物细胞以可表达形式携带所述核酸；在有益于所述蛋白质生产的条件下培养所述哺乳动物细胞；分析所述哺乳动物细胞生产的所述蛋白质上的翻译后修饰；证实所述蛋白质上所述翻译后修饰的存在。根据另一个实施方案，本发明提供了一种鉴别能生产包含预定翻译后修饰的蛋白质分子的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤将编码所述能包含翻译后修饰的蛋白质分子的核酸提供给所述哺乳动物细胞，由此所述哺乳动物细胞以可表达形式携带所述核酸；在有益于所述蛋白质分子产生的条件下培养所述哺乳动物细胞；分析所述哺乳动物细胞产生的所述蛋白质分子上的翻译后修饰；确定所述蛋白质分子上存在的所述翻译后修饰是否包含所述预定的翻译后修饰。
在此所述蛋白质分子是指但非限于这样的分子，如肽，多肽和蛋白质，以及肽、多肽和蛋白质的突变体(包含缺失，点突变，交换和/或化学诱导的改变的分子)，只要其能接受预定的翻译后修饰，即具有顺应修饰的所需氨基酸残基(例如在需要加入N联聚糖结构的情况中，其应包含一个Asn-X-Ser/Thr序列，由此所述结构可施加于Asn残基)。所述蛋白质分子还指携带标签和/或其它蛋白质及非蛋白质标记(例如放射性化合物)的肽，多肽和蛋白质。这种蛋白质的一个实例是人EPO，其除了肾型或血清型形式之外，还具有其它表型如脑型形式。具有某些特性即在某些组织中在蛋白质的功能性中可能起重要作用及应该(当重组表达时)携带预定翻译后修饰以行使适当功能的蛋白质的其它非限制性实例包括单克隆抗体，神经营养蛋白，细胞因子，胰岛素样生长因子，TGF-β样生长因子，成纤维细胞生长因子，表皮生长因子，肝素结合生长因子，酪氨酸激酶受体配体及其它营养因子。大多数这些因子与疾病综合征相关，因此大多数蛋白质可以重组形式用于治疗病人，条件是所述蛋白质具有在体内发挥活性所必需的翻译后修饰。因此这些蛋白质应在能提供所希望的翻译后修饰的表达系统上生产。这种蛋白质例如但非限于是运铁蛋白，glycodelin，神经生长因子(NGF)，脑衍生神经营养因子，神经营养蛋白-3，神经营养蛋白-4/5和神经营养蛋白-6，睫状神经营养因子，白血病抑制因子，Cardiotrophin-1，制癌蛋白-M，一些白细胞介素，GM-CSF，G-CSF，IGF-1和IGF-2，TGF-β，胶质细胞衍生的神经营养因子，Neurturin，Persephin，Myostatin，成纤维细胞生长因子-1，成纤维细胞生长因子-2和成纤维细胞生长因子-5，双调蛋白，乙酰胆碱受体诱导活性，Netrin-1和Netrin-2，神经调节蛋白-2和神经调节蛋白-3，Pleiotrophin，Midkine，干细胞因子(SCF)，集聚蛋白，CSF-1，PDGF和Saposin C。在此所用的单克隆抗体是指人和人源化的抗体，其一部分及等价物如单链Fv(scFv)片段，Fab片段，CDR区域，可变区，轻链和重链，或者适用作特异性配体的任何其它形式。
根据一个特异的实施方案提供了生产系统，其能在能接受N联聚糖结构的蛋白质上施加lewis X结构和/或LacdiNAc。根据本发明，这类表达系统可以被鉴别、选择或特异性设计。这种目的性设计例如是将包含腺病毒E1A序列的核酸导入哺乳动物细胞中，由此所述E1A序列在所述哺乳动物细胞中表达。已经存在的这类细胞例如是HEK293，PER.C6TM，911。尽管已知这些细胞系并已经用于蛋白质生产(Van den Nieuwenhof et al，2000；WO00/63403；Grinnell et al，1994)，但是迄今还不清楚E1A对将lewis X和/或LacdiNAc结构施加于所产生的蛋白质中的能力所起的决定性作用。
在此所用术语“翻译后修饰”是指所述蛋白质分子上或其中存在的任何修饰。其是指在所述分子在体内或体外从RNA中翻译期间或之后导入的修饰。这种修饰包括但非限于糖基化，折叠，磷酸化，γ-羧基化，γ-羟基化，多聚化，硫键及例如加工事件如剪除或加入一或多个氨基酸。在此所用术语预定的翻译后修饰是指针对选定的治疗有用的任何翻译后修饰。根据优选的实施方案，预定的翻译后修饰是指一种修饰形式，其使被修饰的蛋白质特别适用于治疗人或动物的特异组织，器官，区室和/或细胞的病变。携带这种预定的翻译后修饰的蛋白质分子除了对欲治疗的组织，器官，区室和/或细胞之外无明显作用(如有害的或其它非希望的副作用)。根据一个实施方案，预定的翻译后修饰导致包含预定翻译后修饰的蛋白质更快速地从血液中清除，例如以降低副作用。预定的翻译后修饰可以预先详细地充分了解，但也可以一般性指一种希望的状态，即是包含这种预定翻译后修饰的蛋白质分子的正确和希望活性所需的，意味着相应的蛋白质分子上存在的修饰无需充分理解和/或阐明，只要具有希望的活性即可。根据希望的用途，O-和/或N-聚糖中希望的糖基化修饰例如是这样的结构，如Lewis x，唾液酸Lewis x，GalNac，GlcNac，LacdiNAc，附着于N-乙酰葡糖胺的α1，3连接的岩藻糖，末端N-乙酰葡糖胺，末端半乳糖，等分(bisecting)N-乙酰葡糖胺，硫酸基团和唾液酸。
用于生产人蛋白质的本发明的哺乳动物细胞优选是人细胞或来源于人，以生产极有可能携带哺乳动物优选人特性的蛋白质。为生产具有神经(neural)翻译后修饰的蛋白质分子，优选使用具有神经特征的细胞，如作为神经细胞指征的蛋白质标记。这并不排除非神经细胞在生产包含神经型翻译后修饰的蛋白质中也可以是非常有用的。依赖于所需的蛋白质活性选择、鉴别或获得能产生这种翻译后修饰的细胞。
因为当应用于治疗时需要生产大量的蛋白质，因此优选本发明的哺乳动物细胞是无限增殖化的。无限增殖化可以根据许多方式实现。获得无限增殖化细胞的方法例如通过加入编码转化和/或无限增殖化蛋白的核酸将静止的细胞激活转化为分裂的细胞，或者通过化学处理使内源蛋白质变成转化性的，或者从肿瘤材料中获取细胞。无限增殖化非肿瘤细胞的一个优选方法是加入腺病毒的E1区域，如针对细胞系如911和PER.C6TM所示出。无限增殖化细胞的其它方法已知如使用某些人乳头瘤病毒(HPV)蛋白质编码序列转化(例如HeLa细胞)。加入某些病毒蛋白如腺病毒E1可有益于重组蛋白的生产，因为许多这种蛋白质具有转录激活特点，以及抗细胞程序死亡作用。目前令人惊奇地发现腺病毒的E1A在用作本发明表达系统的宿主细胞中的表达，改变了该表达系统的特征，由此获得施加包含lewis X和/或LacdiNAc的N联糖基化结构的能力。
生产需要含有lewis X和/或LacdiNAc的N联聚糖的蛋白质分子的方法所用的一种合适的细胞系是PER.C6TM，其保藏在欧洲动物细胞保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures at the Centerfor Applied Microbiology and Research)，保藏号No.96022940。根据这个方面的其它合适的细胞系包括HEK293,911及其它哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞可通过将含有可表达形式的腺病毒E1A序列的核酸导入一或多个所述细胞或其祖细胞中而修饰。任选地，包括可表达形式的E1B序列，其可以是有益的，因为E1B可发挥抗编程性细胞死亡作用从而抵消E1A表达所致的潜在编程性细胞死亡作用。
生产本发明蛋白质分子的方法进一步可包括从哺乳动物细胞培养物中纯化所述蛋白质分子的额外步骤。在此所用纯化可以通过本领域已经加以描述的常规方法进行，然而优选使用包括一个步骤的纯化方法，所述步骤中使用所述蛋白质分子中和/或其上存在的翻译后修饰。更优选的是包含这样一个步骤的纯化方法，即其中使用所述蛋白质分子中和/或其上存在的预定的翻译后修饰。当应用亲和纯化方法时，优选使用抗体或其它结合剂，如特异于特定碳水化合物组分及针对某些类型的翻译后修饰的凝集素。这种抗体例子是抗(唾液酸)Lewis x结构，lacdiNac结构或GalNac Lewis x结构的抗体。可用于本发明此方面的凝集素的非限制性实例是AAL和选择蛋白，如E-选择蛋白，P-选择蛋白，L-选择蛋白。使用这种结合剂使得可以纯化(重组)蛋白质，由此大多数纯化的蛋白质携带希望的预定翻译后修饰。更优选的方法是其中蛋白质分子纯化为均质。本发明提供了从哺乳动物细胞培养物中纯化蛋白质的方法实例，并涵盖了例如亲和层析方法以通过使用识别重组产生的产物的N聚糖中存在的Lewis x结构的抗体或凝集素纯化脑型糖基化EPO。
本发明提供了一种药物可接受的组合物，其包含根据本发明方法可获得的具有预定翻译后修饰的一种蛋白质分子，及一种药物可接受的载体。药物可接受的载体是本领域技术人员已知的那些载体。在一个优选的实施方案中，所述药物可接受的组合物中所述蛋白质分子是促红细胞生成素。根据本发明，在具有神经蛋白标记的细胞中生产的促红细胞生成素获得了一种翻译后修饰，其在神经组织中或在神经细胞上是活性的。然而，该翻译后修饰与在血液中循环的EPO上见到的翻译后修饰不可相比。在具有神经蛋白标记的细胞中产生的EPO的促红细胞生成作用明显较低。本发明强有力地提示这是由于缺乏高百分比的唾液酸和/或由于存在脑型特点如Lewis x结构和末端半乳糖苷所致。这是有利的，因为与目前可利用的EPO制剂相比，这种脑型EPO可以相对较高的剂量用于治疗与神经组织相关的病变，或者用于治疗由缺血(如心肌缺血)所致组织损害，同时有具有明显降低的促红细胞生成作用。本发明提供了包含至少一个翻译后修饰的重组促红细胞生成素，所述翻译后修饰选自唾液酸Lewis x结构，Lewisx结构，a1，附着于N-乙酰葡糖胺的α1，3-连接的岩藻糖，LacdiNAc结构，末端N-乙酰葡糖胺基团及末端半乳糖基团。所述重组促红细胞生成素可在根据本发明可获得的哺乳动物细胞上生产，以及可在预先已知但预先未意识到适于该目的的哺乳动物细胞上生产。一个实例是PER.C6TM细胞。根据本发明的一个实施方案进一步提供了PER.C6TM细胞在生产包含预定翻译后修饰的蛋白质分子中的应用，其中优选所述蛋白质分子快速从血液中清除和/或以高剂量应用。在可在PER.C6TM上生产的EPO的情况中，可以高剂量使用以治疗或预防与缺氧相关的急性损伤，同时限制红细胞生成的不利副作用。
在本发明的一个实施方案中，本发明的蛋白质分子适于对人或人体进行手术，治疗或诊断处理。优选地，本发明的EPO样分子用于生产一种药物，以治疗缺氧所致病变，神经变性疾病或者急性中枢或周围神经系统损害。在另一个优选的实施方案中，所述蛋白质分子如EPO用于生产一种药物，以治疗缺血和/或再灌注损伤。在再一个优选的实施方案中，所述蛋白质分子如EPO用于生产一种药物，以治疗免疫失调和/或炎症疾病。
在此揭示了产生和生产重组蛋白质的方法和组合物。本发明特别用于生产这样的蛋白质，即其需要翻译同时和/或翻译后修饰如糖基化和正确折叠，本发明进一步涉及能在蛋白质分子上产生脑型翻译同时和/或翻译后修饰的人体细胞的应用。这些细胞可例如用于生产具有神经特征的人糖蛋白，这些人糖蛋白由于其神经特征而可以具有治疗益处。
本发明还提供了具有神经特征的人细胞系的应用，其修饰具有神经性质的重组表达的蛋白质，如脑型或神经型翻译后修饰如糖基化，磷酸化或折叠。这种细胞系例如是PER.C6TM(U.S.Pat.No.6,033，908)，其通过使用具有腺病毒E1基因的构建体无限增殖化人胚肾细胞而产生。以前已经证实PER.C6TM细胞特别适于生产重组人蛋白，因为可以获得高产量的蛋白质如人EPO和完全的人单克隆抗体(见WO00/63403所述)。本发明揭示了PER.C6TM细胞生产的重组蛋白质可获得某些组织特异性特征如神经特征(例如，翻译后修饰如糖基化)。这通过具有所谓脑型寡糖的蛋白质的产生而举例示出。已经示出PER.C6TM细胞产生的人EPO是用N联糖修饰的，所述N联糖与在人尿EPO或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者幼仓鼠肾(BHK)细胞产生的重组人EPO中发现的N联糖明显不同。人尿EPO及在CHO和BHK细胞中产生的重组人EPO含有可以被称为肾型或血清型寡糖的糖基化结构。典型地，这些CHO-EPO和BHK-EPO制剂的N联糖是高度分支的，高度糖基化的及高度唾液酸化的，然而它们没有外周(peripheral)α1，3-连接的岩藻糖(Tsuda et al.1988；Takeuchi et al.1988；Nimtz et al.1993；Watson et al.1994；Rahbek-Nielsen et al.1997)。
在此已经阐明与在PER.C6TM上产生的人EPO连接的寡糖的性质，并示出明显不同于人尿EPO及在CHO和BHK细胞中产生的重组人EPO中存在的寡糖。首先，PER.C6TM产生的人EPO的寡糖的平均唾液酸含量明显低于人尿EPO或重组人EPO(来自CHO和BHK)的平均唾液酸含量。在PER.C6TM产生的人EPO中非常低的唾液酸含量是存在含有末端半乳糖和/或N-乙酰半乳糖胺和/或N-乙酰葡糖胺的N联寡糖的标示。其次，N-乙酰半乳糖胺在PER.C6TM产生的人EPO的N联糖中大量发现，而N-乙酰半乳糖胺在人尿EPO和CHO细胞产生的重组人EPO的N联糖中未发现。已经有报道在BHK细胞产生的少数几批重组人EPO中N联糖中仅有微量的N-乙酰半乳糖胺(Nimtz et al.1993)。第三，在PER.C6TM细胞中产生的人EPO的N联糖发现含有非常大量的岩藻糖。该岩藻糖的一部分是α1，3-连接于周围N-乙酰葡糖胺，从而形成所谓Lewis x结构(图5)。Lewis x结构从未报道在人尿EPO或者在CHO和BHK细胞中产生的重组人EPO中出现。根据本发明在EPO上存在的(唾液酸)Lewis x结构使这个EPO适于与选择蛋白结合及设想可进一步应用于心脏防护中。
因为蛋白质连接的寡糖对多肽的物理化学性质如三级构象，溶解性，粘度及电荷具有重要影响，因此PER.C6TM产生的人EPO具有与人尿EPO及CHO和BHK细胞产生的重组人EPO明显不同的物理化学性质(Toyoda et al.2000)。明显地，PER.C6TM产生的人EPO的电荷由于其唾液酸含量较低而少于人尿EPO及CHO和BHK细胞产生的重组人EPO的电荷，而且由于非常高的岩藻糖含量而疏水性可能更强。结果，PER.C6TM产生的人EPO的平均pI明显高于人尿EPO及CHO和BHK细胞产生的重组人EPO的pI。因为EPO的聚糖尤其唾液酸对与与EPO受体的结合也有影响，因此预期与人尿EPO及CHO和BHK细胞产生的重组人EPO的相比，PER.C6TM-产生的人EPO对EPO受体具有不同的亲和性。尽管先前已经揭示了在PER.C6TM细胞上生产EPO(WO00/63403)，但没有对产生的EPO的结构进行详细揭示。因此在此获得的见识现在证明如下的结论是正确的，即在PER.C6TM上生产的EPO使其完全适于新应用，尤其在红细胞生成被视为(非希望的)副作用的场合。当然，其它蛋白质可从在此提供的见识中获益。根据本发明的一个其它方面，提供了使用PER.C6TM或任何表达E1A的哺乳动物细胞生产需要含有lewis X和/或LacdiNAc的N聚糖的蛋白质的一种方法。可从这种结构中获益并因此可在所述细胞上适当生产的蛋白质例如是促红细胞生成素，运铁蛋白，glycodelin如glycodelinA(PP14)，神经生长因子(NGF)，脑衍生神经营养因子，神经营养蛋白-3，神经营养蛋白-4/5和神经营养蛋白-6，睫状神经营养因子，白血病抑制因子，Cardiotrophin-1，制癌蛋白-M，白细胞介素，GM-CSF，G-CSF，IGF-1和IGF-2，TGF-β，胶质细胞衍生的神经营养因子，Neurturin，Persephin，Myostatin，成纤维细胞生长因子-1，成纤维细胞生长因子-2和成纤维细胞生长因子-5，双调蛋白，乙酰胆碱受体诱导活性，Netrin-1和Netrin-2，神经调节蛋白-2和神经调节蛋白-3，Pleiotrophin，Midkine，干细胞因子(SCF)，集聚蛋白，CSF-1，PDGF，Saposin C，可溶的补体受体-1，α-1酸性糖蛋白，急性期蛋白，E-选择蛋白配体-1，LAM-1，癌胚抗原样CD66抗原，周围淋巴结地址素，CD75，CD76，CD45RO，CD21，P-选择蛋白糖蛋白配体-1，GlyCAM-1，粘液素型糖蛋白，CD34，podocalyxin，α1-抗胰凝乳蛋白酶，α1-蛋白酶抑制剂，α淀粉酶，富集唾液脯氨酸的糖蛋白，SERP-1，干扰素-β，β-痕量蛋白，C蛋白，尿激酶，血吸虫糖蛋白，Glycodelin A，组织因子途径抑制剂，α-胎蛋白，人妊娠蛋白如促性腺激素如卵泡刺激素(FSH)，黄体生成素(LH)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，或者能接受所述糖基化结构的任何这些物质的片段或变体。在此所用术语“片段”是蛋白质的一部分，可以是几个氨基酸长至几乎完整蛋白质的肽。变体可以是突变蛋白，融合蛋白，与其它非蛋白质组分偶联的蛋白质或肽等。根据本发明这种片段或变体应能接受翻译后修饰。
在本发明的其它方面中，提供了生产富含具有包含(唾液酸)Lewis X和/或LacdiNac结构的N联聚糖的蛋白质分子的一部分(fraction)的方法，包括以下步骤a)在表达编码腺病毒E1A的核酸的细胞中重组表达所述蛋白质分子；b)分级分离如此产生的蛋白质分子，从而获得一种部分，其富含具有包含(唾液酸)Lewis X和/或LacdiNac结构的所述N联聚糖的分子。上述蛋白质分子可从本发明此方面中获益。已经描述了在HEK293细胞上产生及随后纯化的C蛋白具有包含GalNAc-Lewis x结构的一种特殊糖基化结构(Grinnellet al，1994)，但是没有有目的地富集含有这种类型的糖的纯化的蛋白质，而且未有意地选择表达E1A的生产细胞。本发明的实质是教导了表达腺病毒E1A的哺乳动物细胞可用于有目的地生产具有包含(唾液酸)Lewis X和/或LacdiNAc结构的N联聚糖的蛋白质，而且富集这些特殊部分。优选地，所述部分通过一种方法富集，所述方法包括使用希望的聚糖结构的亲和纯化步骤，如使用与所述包含(唾液酸)Lewis X和/或LacdiNAc结构的N联聚糖结合的一种凝集素或单克隆抗体进行的结合。在此已经示出使用这些EPO生产方法能获得具有特殊糖基化形式的EPO部分。本发明的一方面提供了包含促红细胞生成素样分子的组合物，所述促红细胞生成素样分子选自促红细胞生成素、促红细胞生成素的一或多个突变蛋白、及促红细胞生成素的一或多个衍生物，其特征在于每个促红细胞生成素样分子N联聚糖上lewis-X结构的平均数为至少大约2.2。在其它的实施方案中，所述每个促红细胞生成素样分子N联聚糖上lewis-X结构的平均数为至少大约2.6、2.7、3.6、4.1或5.7。这种组合物对在此所述的医学目的有价值。
本发明进一步揭示了在人神经细胞中生产的脑型蛋白质在治疗哺乳动物尤其人中缺血/再灌注损伤中的应用。在此所述缺血/再灌注损伤是指在先前存活的缺血组织在再灌注后发生的细胞损害。缺血/再灌注损伤与例如但非限于溶栓治疗，冠脉血管成形术，主动脉阻断，心肺分流术，器官或组织移植，外伤和休克。
本发明提供了在哺乳动物细胞中生产的具有脑型寡糖的治疗蛋白质的应用。这些脑型寡糖特别包含Lewisx结构，唾液酸Lewis x结构，或其含(唾液酸)Lewis x结构的衍生物，用以治疗哺乳动物治疗对象如人中缺血/再灌注损伤。重组蛋白上存在(唾液酸)Lewis x结构能将这些蛋白质定向于缺血/再注入的损伤部位，从而发挥其比不含(唾液酸)Lewis x结构的蛋白质更有效的缺血/再灌注保护性作用。重组表达的蛋白质上脑型寡糖的存在在本发明中通过促红细胞生成素(EPO)举例示出，所述EPO在PER.C6TM细胞上产生。这种特殊类型的EPO含有Lewis x以及唾液酸Lewis x结构。在本发明中描述了一些实验，所述实验示出在心脏缺血/再灌注损伤的体内模型中心脏保护功能和中风方面，与血清型(或肾型)EPO相比PER.C6TM脑型(或神经型)EPO的优越性。
本发明表现的另一优势是PER.C6TM生产的人EPO具有神经营养活性。PER.C6TM-产生的EPO提供了EPO蛋白质作为神经营养和/或神经保护剂的物理化学和/或药物代谢动力学和/或药物动力学优势。与在CHO和BHK细胞中产生的高度唾液酸化的血清型糖基化人重组EPO相比，PER.C6TM生产的EPO具有较高的神经细胞亲和性和对于神经细胞上的EPO-R的亲和性。在非神经细胞上产生的重组人EPO(Goto et al.1988)对在神经细胞上的EPO-R的亲和性比对在红细胞祖细胞上的EPO-R的亲和性低(Musada et al.1993 and 1994)。
EPO的神经保护作用明显展示了重组人EPO在应答由炎症或缺氧和/或缺血诱导的毒性化合物或在神经变性疾病中作为神经保护性治疗的用途的新可能性。然而，一个主要缺点是当用作神经保护剂时，血液循环中存在的重组EPO也增加红细胞量或血细胞比容。这反过来导致较高的血粘度，这可能在脑缺血中具有不利作用(Wiessner et al.2001)。
本发明提供了一种方法，以解决重组人EPO在用作神经保护剂所具有的非希望的趋血副作用的问题(Wiessner et al.2001)。因此，已经示出PER.C6TM产生的脑型糖基化重组人EPO具有作为神经形成和/或神经保护剂的高度潜力，而其刺激红细胞生成潜力较低。
根据本发明，在表达E1A的哺乳动物细胞上生产的EPO，如PER.C6TM产生的EPO，可以系统施用(静脉内，腹膜内，皮内施用)以抑制，预防和/或修复由例如急性头部和脑部损伤或者神经变性疾病引起的神经损伤。本发明还提供了可用于调节由于缺氧所致严重损伤的组织功能的产物，所述组织如哺乳动物中的中枢和周围神经系统，肾组织和心肌组织。这些组织可以是患病的但也可以是正常和健康的。可用本发明提供的产物治疗的疾病可以是急性头部，脑部和/或心脏损伤，神经变性疾病，发作性疾病，神经毒素中毒，低血压，心脏骤停，辐射，多发性硬化和/或缺氧所致损伤的结果。缺氧可以是出生前或出生后缺氧，窒息，肺气肿，脓毒性休克，心脏骤停，气阻(choking)，新近溺水，镰形细胞危象，成人呼吸窘迫综合征，节律障碍，氮气麻醉，手术后认知功能紊乱，一氧化碳中毒，烟雾吸入，慢性阻塞性肺部疾病，过敏性休克或胰岛素性休克。发作性损伤包括但非限于癫痫，慢性发作性疾病或惊厥。在病理学为神经变性疾病的情况中，所述疾病可以是由以下致AIDS痴呆，Alzheimer′s病，Parkinson′s病，Creutzfeldt-Jakob病，中风，大脑性瘫痪，脊髓外伤，脑外伤，年龄相关的认知功能丧失，肌萎缩性脊髓侧索硬化，酒精中毒，视网膜缺血，青光眼，普通神经丧失，记忆力丧失或年老。可用本发明提供的产物治疗的其它疾病例如包括孤独症，抑郁症，焦虑症，忧郁症，注意力缺乏、活动过度障碍(ADHD)及认知功能障碍。
PER.C6TM-EPO在血脑屏障机能障碍的情况中可以被动穿过血脑屏障。在血脑屏障是完整的情况中，认为PER.C6TM-EPO通过EPO-R主动转运通过血脑屏障。一些研究提示当施用高剂量的重组EPO时，EPO自身能穿过血脑屏障(WO00/61164)。重组PER.C6TM-EPO穿过血脑屏障的另一条预测途径是通过PER.C6TM产生的EPO上存在的(唾液酸)Lewis x聚糖结构与人脑微血管内皮细胞上存在的E-选择蛋白之间的相互作用而进行(Lou et al.1996)。E-选择蛋白与EPO之间的相互作用可促进EPO转运通过脑内皮屏障，因为E-选择蛋白也参与T淋巴细胞迁移入CNS中(Wong et al.1999)。如果需要最佳的神经保护作用，PER.C6TM产生的EPO与血清型EPO相比可以明显较高剂量施用，因为PER.C6TM-EPO诱导红细胞生成的效率低得多，由此血细胞比容提高引起的不利副作用被降低或者甚至不存在。
在本发明的另一个方面中，在表达E1A的哺乳动物细胞上生产的EPO如PER.C6TM-EPO，可以通过灌注、或者通过留置心室内导管、或者通过腰部注射而鞘内施用以抑制或预防神经损伤。同样，施用脑型EPO比血清型EPO的优越之处在于在血脑屏障功能障碍(例如中风所致)而渗入血液循环的状态下，没有与红细胞生成相关的非所希望的副作用发生。
本发明确定在无血清的条件下生长为极高密度并具有神经特征的无限生长的转化细胞，如PER.C6，在生产功能性依赖于这些特征的因子中非常有用。这自然还提供了生产这样的因子的可能性，所述因子不具有神经特征或者神经相关功能，但是仍得益于由这种细胞带来的翻译后修饰。技术人员可预想一些因子在非神经组织中也起作用，但仍需要糖基化结构，所述糖基化结构包括例如本发明中针对EPO所述的Lewis x结构或岩藻糖残基，并且可以通过本发明的方式和方法提供。可以由PER.C6TM产生并利用PER.C6TM细胞的神经特征的因子例如包括但非限于脑型促红细胞生成素，运铁蛋白及上述不同的因子。本发明示出其它重组神经营养性糖蛋白的生产将获益于在这种细胞中发生的脑型修饰是非常有可能的。
本发明令人惊奇地发现每个蛋白质主链的唾液酸残基数平均较低的促红细胞生成素样分子，在治疗和/或预防各种病变中仍有效。这完全开启了迄今认为很少或无法使用的EPO和EPO样分子的新的使用方式，所述EPO或EPO样分子包括但非限于在重组哺乳动物细胞系统上产生的EPO批次中由于其平均低唾液酸化程度低和/或相关的红细胞生成活性低而在分级分离中放弃的低唾液酸EPO部分。因此，本发明证实在大鼠实验性诱导的中风中，具有低唾液酸含量的EPO在降低梗死大小方面与具有较高唾液酸含量的EPO大致一样强。本领域已经充分确定EPO的高唾液酸含量与较长的循环半寿期及在体内红细胞生成潜力增强相关(Tsuda et al.1990；Morimoto et al.1996)。
因此，概括而言，本发明提供了促红细胞生成素样分子的组合物在制备药物中的应用，所述促红细胞生成素样分子选自促红细胞生成素，促红细胞生成素的一或多个突变蛋白，促红细胞生成素的一或多个衍生物，及各种程度唾液酸化的促红细胞生成素分子的一或多个部分的组合物，所述药物治疗选自以下的疾病缺血，再灌注损伤，缺氧引起的疾病，炎症疾病，神经变性疾病，及中枢或周围神经系统急性损害，其中所述促红细胞生成素样分子的组合物基于蛋白质含量，其体内促红细胞生成活性比epoetin alfa和epoetin beta低。本发明的实施方案包括组合物及其应用，其中所述体内红细胞生成活性比epoetin alfa(Eprex)或epoetin beta低至少10，20，30，40，50，60，70，80或90％。促红细胞生成素样分子包括具有与目前已知的EPO形式相同或相似的蛋白质主链的分子，例如EPO突变蛋白，EPO衍生物，或者在定性和/或定量方面与蛋白质主链的糖基化不同的EPO分子。在此所述突变蛋白是指由促红细胞生成素样分子组成，所述分子在蛋白质主链中由于氨基酸缺失，添加，取代和/或易位而与epoetin alfa的蛋白质主链相比具有一或多个突变，而且应包括天然发生的等位基因变体以及遗传和/或化学和/或酶促获得的变体。这种分子仍能授予EPO的功能活性。它们可使用本领域技术人员熟知的分子生物学标准技术获得。在此所述衍生物是一种促红细胞生成素样分子，其可得自促红细胞生成素或epoetin alfa或者通过化学或酶促修饰的epoetinalfa的任何其它功能性突变蛋白。在此所述红细胞生成活性是指EPO对人或动物治疗对象中红细胞生成的刺激作用，这可以通过在为人或动物对象使用促红细胞生成素样分子后在某一时间点的血细胞比容值增加而测定(例如见实施例9)，或者测定血红蛋白浓度。这些方法是本领域技术人员熟知的。epoetin alfa是重组人EPO形式，目前以EprexTM在市场上销售，其与分离自贫血患者尿中的人促红细胞生成素相似或相同(在氨基酸和碳水化合物组成方面)。针对红细胞生成目的的治疗方案已经充分确定。一般而言，在针对EPO的红细胞生成活性方面，EPO剂量以IU(国际单位)给予。这种IU与EPO的蛋白质含量相关，但是操作性地加以限定，因此这种关联在不同批次之间可以不同。单凭经验的方法，1IU相当于8-10 ng epoetin alfa。为对本发明加以描述，促红细胞生成素样分子的红细胞生成活性是以基于蛋白质含量表示从而除去由指定IU而引入的变量。本领域技术人员清楚尽管IU通常针对商业EPO制剂给予，但这种制剂中EPO分子的浓度可易于根据标准方法确定。这样使得可以确定相对比活性，例如IU/g(见例如EP0428267)。用于这些目的的一些体内和体外分析也由Storring等(1992)加以描述。目前市场上其它形式的EPO例如是Procrit或Epogen(均为epoetin alfa)及Aranesp(darbepoetinα，具有额外N-糖基化位点以提高循环半寿期和促红细胞生成活性的EPO)。尽管红细胞生成活性在市场上的各种商业epoetin alfa和epoetin beta制剂之间可有一些变化，但它们一般均经最佳化以达到高红细胞生成活性。本发明揭示了具有低造血或红细胞生成活性的EPO样分子或者EPO形式的应用，从而降低或避免了非所希望的红细胞生成提高所致副作用。
根据本发明的另一个实施方案，一种促红细胞生成素样分子的组合物的特征在于每个促红细胞生成素样分子的唾液酸残基的平均数与epoetin alfa中每个促红细胞生成素分子的唾液酸残基的平均数相比低至少10％。根据其它实施方案，可以选择与epoetin alfa中每个EPO蛋白质主链的唾液酸残基的平均数相比，所述唾液酸残基的平均数至少低20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％。所述促红细胞生成素样分子中唾液酸残基的平均数优选为epoetin alfa中每个EPO分子的唾液酸残基平均数的0-90％之间，但精确的百分比可取决于疾病，有时取决于患者，因为一些患者-疾病组合与其它相比对高血细胞比容值的易感性较低。或者，唾液酸残基数可以针对每个EPO样分子加以描述，例如每个EPO样分子15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1或0个唾液酸残基。由于该数值是针对由各种唾液酸化程度的EPO样分子组成的组合物进行计算的，因此在所述数值之间的非整数值也可用以描述本发明分子。最佳范围可以经验性确定而不用给本领域技术人员增加不必要的负担。每个分子的平均唾液酸残基数或者EPO的唾液酸含量可以根据公布的本领域技术人员熟知的方法确定。一种可能的方法见EP0428267所述。简而言之，将唾液酸残基通过用0.35M硫酸在80℃水解30分钟而从EPO样分子中裂解，将该溶液用氢氧化钠中和之后进行分析。或者，唾液酸可以根据标准方法通过酶解而除去。EPO的量使用熟知方法评估，例如通过使用可商购蛋白质分析试剂盒(例如Bradford assay，Biorad)及使用重组人EPO作标准的标准曲线，在280nm的吸光度，ELISA，RIA等方法估定。唾液酸含量可以通过Jourdian等(1971)所述方法分析。或者，唾液酸可以使用高效阴离子交换层析使用本领域技术人员熟知的方法分析(例如使用高效阴离子交换层析分析唾液酸，Application note number TN41，Dionex)。唾液酸含量可以表示为摩尔唾液酸/摩尔EPO，或者唾液酸残基平均数/EPO样分子。唾液酸残基平均数/EPO样分子也可以通过测定pI的等电聚焦给出(见实施例4)。
可以设想一些方式以获得每个促红细胞生成素样分子唾液酸残基平均数较低的促红细胞生成素样分子。这些包括但非限于使用特定的殊裂解唾液酸的酶如神经氨酸酶，或者裂解糖基化结构的更多取代基(包括唾液酸)的酶如N-聚糖酶F(除去整个N-聚糖)，内切糖苷酶F2(除去双触角结构)，内切糖苷酶F3(除去双和三触角结构)等处理例如在任何合适的宿主细胞系中重组产生的EPO样分子，或者用化学物质处理EPO样分子，所述化学物质包括但非限于导致每个促红细胞生成素样分子的唾液酸残基平均数降低的酸。特别地，高度唾液酸化的EPO部分可因此脱唾液酸化并用于本发明中。在另一个实施方案中具有平均数较低的唾液酸分子的EPO样分子通过从含有较高和较低唾液酸化的这两种EPO的混合物中纯化或分离这种形式而获得。目前使用的生产系统一般产生这种混合物，而且用于红细胞生成目的的EPO通过纯化具有高平均数唾液酸残基的形式而制备。本发明揭示了这个过程的其它部分即具有较低唾液酸残基平均数的EPO的应用。纯化或分离这种部分可以使用本领域技术人员熟知的方法进行，如离子交换，亲和纯化等。本发明的促红细胞生成素样分子优选重组产生。这可以在任何合适的表达系统中进行，包括但非限于中国仓鼠卵巢细胞，幼仓鼠肾细胞，人细胞如HeLa，HEK293或PER.C6TM。在低等真核细胞如昆虫细胞或酵母中表达也是可能的。具有较低唾液酸含量的EPO样分子的生产可以在天然缺乏唾液酸化酶的唾液酸化缺陷细胞系统中进行，如在某些原核宿主中进行，或者通过诱变或遗传修饰本来能产生唾液酸化的蛋白质的宿主。生产重组蛋白质的方式和方法有详细论述且为本领域技术人员已知，而且技术人员清楚在不偏离本发明范围内可以使用不同来源的EPO样蛋白。在本发明的一方面中，EPO样分子是通过本发明方法产生的，从而生产具有预定翻译后修饰的分子。在本发明的另一方面中，包含促红细胞生成素样分子的组合物特征在于促红细胞生成素样分子一旦经肠道外施用于人体或动物，从血流中的清除速度比epoetin alfa和epoetinbeta快。从血流中的清除可以通过本领域熟知的方法测定，例如通过测定蛋白质在血液中的半寿期，如实施例18所述。在健康志愿者中，在重复静脉内注射之后epoetin alfa的循环半寿期为大约4小时。已经有报道在慢性肾功能不全的患者中其半寿期为大约5小时，在儿童为大约6小时。使用实施例8的方法，我们测定了epoetin alfa(Eprex)的半寿期为180分钟。本领域技术人员清楚可以使用该方法测定本发明组合物的半寿期，并将该半寿期以小时或以与标准EPO(Eprex)的半寿期的百分比表示。在人体中进行相似实验以确定在人体内的半寿期。具有较低四触角结构/双触角结构比率的促红细胞生成素样分子在血浆中半寿期也较短(Misaizu et al，1995；Takeuchi et al，1989)。在给出这种较低比率的细胞系中生产EPO是切实可行的，或者从含有更多的四触角结构的形式中纯化这些形式。包含相对较多双触角结构的这种组合物根据本发明也是有用的。还应清楚本发明的一个优势是与目前使用的EPO形式如Eprex，Procrit，NESP相比，在循环中可以达到较高的促红细胞生成素样分子最大浓度。如果高浓度的EPO样分子是所述治疗所希望的，则可以通过施用高剂量的本发明组合物达到此目的，例如以含有这种高剂量的药物制剂形式施用。基于目前使用的EPO样分子的蛋白质含量使用相似剂量，导致较高的红细胞生成，这是所述治疗非所希望的副作用。
本发明还提供了包含所述促红细胞生成素样分子的药物组合物，及治疗或预防选自所述一组的疾病的方法，以及预防和/或治疗人或动物体的促红细胞生成素样分子组合物。
实施例 实施例1在PER.C6TM细胞中标记蛋白质的表达的研究 用人腺病毒5型的E1区域转化并导致产生PER.C6TM细胞系(保藏在ECACC，保藏号No.96022940)的细胞衍生自人胚胎视网膜。视网膜一般包含许多不同类型的细胞(至少55种不同的神经亚型)，包括神经细胞和成纤维细胞样细胞(Masland 2001)。为追溯PER.C6TM的细胞起源，进行研究以测试标记蛋白在该细胞中或该细胞上的表达。本领域已知这些标记是某些细胞类型和/或组织特异性的。所述标记蛋白示于表I。
使用标记蛋白的抗体测试标记蛋白表达。在每个实验中，取阴性对照(不与抗体温育的PER.C6TM细胞)和阳性对照。这些阳性对照是已知表达标记蛋白的人体组织切片(表II)。
将PER.C6TM细胞在培养玻片上培养(Life Technologies，NuncLab-Tek，Chamber Slide，radiation sterilized，2 medium chambers，cat.no.154464A)。将PER.C6TM细胞以65-70％铺满率种植(2孔/培养室)并在37℃培养24小时(10％CO2，95％空气)。吸取培养基并将具有细胞的玻片用无菌PBS洗涤，从培养室中取出并在空气中干燥。将细胞通过在丙酮中温育2分钟而固定在玻片上。经空气干燥后，将玻片包装在铝箔中并在低于-18℃的温度下冷冻直至使用。
阳性对照组织得自Academic Hospital Erasmus大学(Rotterdam，The Netherlands)病理学系为常规使用而制备的组织玻片库。根据常规方法制备冷冻的切片(5μm)并于丙酮中固定。
初级抗体，其各自的标记蛋白，供应商和抗体目录号示于表III。在表III中也详细描述的稀释液在磷酸盐缓冲盐水(PBS)，1％牛血清白蛋白中制备。在室温将所述玻片与初级抗体温育30分钟，用PBS漂洗并与二级抗体温育。根据使用的初级抗体的性质，这些二级抗体是山羊抗兔抗体(DAKO E0432；1∶50稀释)或者山羊抗小鼠抗体(DAKO E0433；1∶50稀释)。将所述二级抗体与生物素缀合。在用PBS漂洗后，将玻片与碱性磷酸酶缀合的链亲和素-亲和素/生物素复合物温育(DAKO，K0376)。在温育30分钟后，将样品用Tris/HCl pH8.0漂洗，在暗室中30分钟显色品红底物(DAKO K0624)。随后，将玻片用自来水漂洗2分钟，根据本领域技术人员熟知的常规方法用苏木精复染。然后，将玻片经显微镜检并记录标记蛋白表达情况(阴性或阳性)。结果示于表IV。针对神经丝染色(阳性)，由于细胞群的不同的细胞周期或者成熟阶段，不是所有的PER.C6TM细胞均染色阳性。这对神经丝染色而言是正常的观测现象。
从获得的数据中推断PER.C6TM细胞是神经来源的，因为所述细胞针对波形蛋白，突触小泡蛋白，神经丝，GFAP和N-CAM染色阳性。
实施例2PER.C6TM-EPO衍生的N-聚糖与Eprex的单糖组成的对比 定性PER.C6TM产生的N-聚糖结构的第一个步骤是测定各种单糖的摩尔比。单糖分析使用具有脉冲电流检测仪的高效阴离子交换层析(HPAEC-PAD)进行。在这个分析中选择在DMEM和/或JRH培养基中由PER.C6TM衍生的克隆P7，P8和C25产生的EPO样品(P7和P8见WO00/63403所述，C25根据这些方法一般性产生，使用新霉素抗性基因作为选择标记[质粒pEP02001/Neo])。Eprex(Jansen Cilag)是可商购的重组CHO-衍生的促红细胞生成素，对其进行平行分析并因此用作参考。
PER.C6TM-EPO样品使用用C4琼脂糖珠填充的层析柱通过亲和层析纯化(床体积为4ml，Amersham Pharmacia Biotech)，所述珠偶联小鼠单克隆抗EPO(IgGI)抗体。将结合的EPO分子用0.1M甘氨酸-HCl，pH2.7洗脱，所得部分立即通过加入磷酸钠/钾缓冲液pH8.0而中和。随后，将含有EPO的部分集合并利用Hiprep 26/10脱盐柱(Amersham Pharmacia Biotech)将缓冲液更换为含有O.1％(v/v)Tween20的20mM Tris-HCl。
针对聚糖分析，将纯化的EPO样品用MilliQ级水透析过夜，并在Speedvac蒸发器中干燥。将干燥的EPO样品(39-105μg)溶解于温育缓冲液中(1∶1稀释的C3 profiling缓冲液，Glyko)。在加入十二烷基硫酸钠(SDS)和β-巯基乙醇至终浓度分别为0.1％(w/v)和0.3％(v/v)的基础上，将样品在100℃变性5分钟。随后加入Nonidet P-40(BDH)至终浓度为0.75％(v/v)，并使用N-聚糖酶F(mU，Glyko)将EPO在37℃去糖基化过夜。在去糖基化的基础上，根据Packer等(1998)所述方法，使用导电炭黑(Carbograph)SPE柱(Alltech)从蛋白质，盐和去污剂中分离出释放的N-聚糖。
将纯化的N-聚糖链在2M三氟乙酸(TFA)中在100℃水解4小时。在水解后，将单糖在Speedvac蒸发器中干燥，用水洗涤并再次在Speedvac蒸发器中干燥。将干燥的单糖溶解于26μl MilliQ级水中。在加入用作内标的6μl脱氧葡萄糖(100nmol/ml)之后，将样品(24.5μl)应用于具有2mm直径CarboPac PA1柱(Dionex)的HPAEC-PADBioLC系统中。将该柱在16mM NaOH(Baker)中以0.25ml/min流速等度走柱。通过与使用由岩藻糖，脱氧葡萄糖，半乳糖胺，葡糖胺，半乳糖和甘露糖组成的单糖标准混合物中获得的曲线相对比计算单糖组成。
单糖分析示出PER.C6TM-EPO的糖基化状况明显不同于Eprex(表V)。将指定的单糖比率标准化为3Man(Man＝甘露糖，Fuc＝岩藻糖，GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺，GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺，Gal＝半乳糖)。括号中示出duplo值。PER.C6TM-EPO样品含有显著量的GalNAc，而Eprex的N-联糖无此残基。这提示PER.C6TM-EPO含有所谓的LacdiNAc(例如GalNAcβ1-4GlcNAc)结构。PER.C6TM-EPO的另一个特点是岩藻糖残基相对丰富，如表V所示。这强烈表明PER.C6TM-EPO的N聚糖结构中存在Lewis结构。相反，已知Eprex无Lewis结构。因此，Eprex中发现的岩藻糖量可以仅归因于N聚糖核心岩藻糖基化。引人注目的是，来自单糖分析的数据还表明培养条件影响PER.C6TM中EPO的糖基化状况。不应断定培养条件仅与生产的蛋白质上存在的预定翻译后修饰相关。当然，细胞系通过存在某些特异性糖基化酶如转移酶应能修饰在这些细胞上生产的蛋白质的翻译后修饰。培养条件可仅发挥附加活性。例如，当在JRH Excell 525培养基中(悬浮)培养产生EPO的克隆时，发现与衍生自于DMEM中培养的(贴壁)细胞的EPO的N联聚糖相比，前者EPO的N联聚糖含有较高水平的GlcNAc，GalNAc，Gal和Fuc(表V)。这种作用在克隆P8的情况中特别明显。当细胞在JRH培养基中培养时，GlcNAc水平升高可提示N联糖的分支增加和/或N联糖含有更多的乳糖胺重复。N-乙酰基葡糖胺化和(N-乙酰)半乳糖基化增加引起岩藻糖受体位点数增加，从而提供了对Fuc含量增加的一种解释。
实施例3质谱分析揭示PER.C6TM-EPO和Eprex的N聚糖之间的结构差异 为获得PER.CG产生的N聚糖结构的详细信息，通过MALDI-MS分析PER.C6TM-EPO的完整糖链。针对该分析，利用亲和纯化的EPO样品，该样品由PER.C6TM衍生的克隆P7和P8在DMEM中产生，通过阴离子交换层析进一步分级分离(如以下所述)。如实施例2所述其缓冲液随后更换为PBS而亲和纯化的PER.C6TM-EPO样品，使用HiTrap sepharose Q HP柱(Amersham Pharmacia Biotech)进行阴离子交换层析。通过以下于20mM Tris-HCl/20μM CuSO4中梯度步骤获得三个EPO亚部分，所述梯度开始为45mM NaCl(部分1)，随后为75mM NaCl(部分2)，最后为135mM NaCl(部分3)。每个梯度步骤持续10分钟，流速为1ml/min。4轮的部分1集合为集合A，部分2集合为集合B，部分3集合为集合C。所得集合A，B和C随后利用HiPrep 26/10脱盐柱(Amersham Pharmacia Biotech)脱盐。通过N-聚糖酶F处理N联聚糖从EPO集合中释放，通过神经氨酸酶处理脱唾液酸化。平行分析Eprex以作为参考。各种EPO样品的代表性质谱示于图1A-GEprex及纯化的，分级分离的(来自阴离子交换层析柱的集合A，B和C)。衍生自于DMEM中培养的指定克隆的PER.C6TM-EPO样品用聚糖酶F和神经氨酸酶处理，随后通过MALDI-MS分析。符号(在Eprex的质谱中)含义为实心方块为GlcNAc，空心圆为Man，实心圆为Gal，空心三角为Fuc。Eprex的N联糖的质谱(图1A)相应于以前公布的数据并表明有或无乳糖胺重复的四触角糖在这种EPO制剂中占优势。尽管Eprex和PER.C6TM-EPO含有具有相似质量的糖结构(图1B-G)，但后者的糖结构质谱更复杂，提示这些糖展示很大程度的异质性。使用ExPAsy′s计算机程序基于观测的质量预测糖组成(表VI和表VII)。还示出了每个集合中不同寡糖的相对丰富程度。数据表明衍生自PER.C6TM-EPO的大多数N联寡糖含有多个岩藻糖残基(表VI和VII，见dHex残基的水平)。一些聚糖甚至是四岩藻糖基化(quadruple-fucosylated)的。因此，这些数据符合我们的单糖分析并强烈提示PER-C6TM-EPO是超岩藻糖基化的，并因此最可能用具有所谓Lewis结构的N聚糖广泛装饰。具有(唾液酸化)Lewis x表位的寡糖已知是选择蛋白的基本识别序列，在炎症和免疫应答中均介导细胞之间粘附(Varki et al.1999)，并在脑糖蛋白中特别发现(Margolis and Margolis 1989)。因此，携带这些Lewis x结构的众多糖蛋白通过呈现抗炎和免疫抑制活性已经示出具有治疗潜力。在此注意质量信号不能总是明白无误地定位某一糖结构例如残基GlcNAc和GalNAc具有相似质量。因为PER.C6TM-EPO的单糖分析表明在N联糖中出现GalNAc，因此预期一些峰表示具有所谓LacdiNAc(例如GalNAcβ1-4GlcNAc)结构的N聚糖。例如具有m/z值为～2038和～2185(表VI和VII)的峰更可能表示具有LacdiNAc基序的N-聚糖。否则，这些峰可表示四触角结构，其在GlcNAc中由于没有Gal或GalNAc而终止。尽管由于不完全糖基化而可以存在这种结构，但存在邻近的Fuc暗示所述糖含有Gal或GalNAc残基，其是形成由岩藻糖基转移酶(FUT)识别的基序所必需的，所述酶催化Lewis结构的形成。
不同糖的相对出现情况在衍生自两个独立PER.C6TM克隆的EPO制剂之间不同，这通过某些峰的相对高度有差异而判断。特别地，推定的具有LacdiNAc基序的双触角糖(图1；表VI和VII，m/z值为～2038和～2185)是衍生自P8的EPO样品中的主要糖，而在P7样品中这些结构较少。在P7克隆中，推定相应于完全半乳糖基化的四触角聚糖的m/z值为～2541的峰是最丰富的结构。这些数据与我们的单糖分析一致，单糖分析已经表明当在DMEM中生长时，P8产生的EPO携带的聚糖与衍生自P7-EPO的那些相比分支程度较低(表V)。
实施例4PER.C6TM-EPO和CHO-EPO的唾液酸含量对比 使用具有线性pH3-10梯度的IPG条带(Amersham PharmaciaBiotech)，通过等电聚焦(IEF)分析PER.C6TM-EPO的唾液酸含量并与衍生自中国仓鼠卵巢细胞促红细胞生成素(CHO-EPO)对比。在聚焦后，将EPO同种型被动印迹于硝基纤维素上，使用EPO-特异性抗体和ECL观测(图2)。通过等电聚焦分析四种不同PER.C6TM克隆(泳道C，D，E和F)和稳定表达EPO的三种不同CHO克隆(泳道G，H和I)产生的EPO，以确定唾液酸含量。将产生EPO的CHO和PER.C6TM细胞系根据WO00/63403所述方法一般产生，使用新霉素抗性基因作为选择标记。每个条带加样1000eU的PER.C6TM-EPO和500eU的CHO-EPO。使用500IU的Eprex(泳道A)和神经氨酸酶处理的(部分脱唾液酸化的)Eprex(泳道B)鉴别各种EPO同种型。在聚焦后，将EPO印迹于硝基纤维素滤膜上，使用EPO和ECL的单克隆抗体观测。代表一种可商购的EPO的Eprex样品是一种含有高度唾液酸化的同种型的配方并用作标记。
结果表明CHO细胞能产生含有多达至少12个唾液酸/分子的EPO同种型(泳道G-I)，证实了Morimoto等(1996)所述数据。相反，尽管PER.C6TM产生具有8-10个唾液酸的一些同种型，但这些表现不足，且只在延长曝光于胶片后才可检测(泳道C-F)。因此，可以推断PER.C6TM-EPO的唾液酸化程度比CHO-EPO低。
实施例5PER.C6TM细胞上α1，3-，α-1，6-及α1，2-岩藻糖基转移酶活性 细胞的糖基化潜力主要由参与N联糖和O联糖的逐步生物合成的全部糖基转移酶而决定。这些糖基转移酶的活性在细胞系之间不同，因此在不同细胞系中产生的糖蛋白获得不同的聚糖。参考在此所示数据，表明PER.C6TM-EPO聚糖是重度岩藻糖基化的，使用本领域技术人员已知的方法分析参与N联糖合成的众多岩藻糖基转移酶(FUTs)的活性(Van den Nieuwenhof et al.2000)。在这项研究中，我们研究了参与N聚糖的核心岩藻糖基化的α1，6-FUT的活性，介导末端半乳糖残基的帽化从而产生所谓的Lewis y表位的α1，2-FUT的活性，及产生Lewis x结构的α1，3-FUT活性。为进行对比，我们还分析了在CHO细胞中相应的FUT活性。
使用糖基转移酶活性分析测定细胞提取物中指定的各种FUT在PER.C6TM和CHO的活性。该分析测定糖基转移酶催化一种糖(在这种情况中为岩藻糖)与糖底物之间的反应。还测定了GalT活性作为内对照。数值表示两个实验的平均值。所有数值尤其PER.C6TM的那些数值在第二个实验中低2-3倍。特别地，所述活性以(存在于细胞提取物中)每mg蛋白质表示。因为PER.C6TM细胞明显大于CHO细胞，因此CHO和PER.C6TM细胞的FUT和GalT活性之间的差异可比它们所表现的大或小。糖基转移酶活性分析的结果示于表VIII，表明PER.C6TM以及CHO均具有明显的α1，6-FUT活性，提示这两种细胞系均能产生核心岩藻糖基化的聚糖链。然而，α1，3-FUT活性只在PER.C6TM细胞中明显，而在CHO细胞中难以检测。这两种细胞系无一呈现α1，2-FUT活性。总而言之，这些数据示出CHO和PER.C6α的糖基化潜力之间的差异，并解释了为什么PER.C6TM-EpO与CHO产生的EPO(Eprex)相比含有更多的岩藻糖。
实施例6存在于PER.C6TM-EpO上具有Lewis x表位的聚糖 由于PER.C6TM具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性，但无α1，2-岩藻糖基转移酶活性，因此非常有可能PER.C6TM产生含有Lewis x而不是Lewis y表位的N聚糖链。我们使用Western印迹，通过用特异性识别Lewis x结构的小鼠单克隆抗体(抗-Lewis x，人IgM；Calbiochem)标记PER.C6TM-EPO而加以核实。将未处理的(-)或用HCl处理的(+)等量PER.C6TM-EpO(衍生自克隆P7，在此标示为P7.100)和Eprex使用本领域技术人员已知的方法在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并印迹于硝基纤维素膜上。使用单克隆抗体(抗小鼠IgM，Calbiochem)和ECL(Amersham Pharmacia Biotech)检测Lewis x表位。如图3所示，只有PER.C6TM-EPO可用特异于Lewis x表位的抗体标记。标示了分子量标记的位置(52，35和29kDa)。因为α1，3-岩藻糖键是酸不稳定的，因此该信号在用HCl处理后失去。
实施例7在PER.C6TM细胞表面的Lewis x结构表达 为发现Lewis x结构是否一般出现于PER.C6TM细胞中，我们用Lewis x特异性抗体(Calbiochem)标记CHO和正常(即不产生EPO的)PER.C6TM细胞表面。将细胞与初级抗体(针对Lewis x使用0.16μg/mlmAb，针对唾液酸-Lewis x使用5μg/ml mAb)温育。使用FITC缀合的抗IgM作为二级抗体。通过FACS分析标记的细胞。虚线表示只与二级抗体温育的细胞的信号(阴性对照)。图4所示结果表明PER.C6TM细胞与不能产生这些结构的CHO细胞相反明显用所述抗体标记。我们特别重复观测到PER.C6TM细胞展示用Lewis x抗体染色的一种异质模式。用特异于唾液酸Lewis x结构的抗体(Calbiochem)标记只有在使用非常高浓度的抗体时才提供一个中等阳性信号。
实施例8PER.C6TM-EPO(脑型)在体外抑制在低氧条件下培养的NT2细胞和hNT细胞中的编程性细胞死亡 对比PER.C6TM-产生的(脑型)EPO和血清型EPO在体外保护大鼠，小鼠和人皮质神经细胞在低氧和葡萄糖剥夺条件下免于细胞死亡的活性。为此，如其他人所述从大鼠胚胎中制备神经细胞培养物(Koretz et al.1994；Nagayama et al.1999；White et al.1996)。为评价PER.C6TM产生的脑型EPO和血清型EPO的作用，将细胞在水夹套温育器的模块温育室中，在具有30mM葡萄糖的无血清的培养基中和增湿的95％空气/5％CO2(含氧量正常)中或者在无葡萄糖的无血清培养基和增湿的95％N2/5％CO2(缺氧及葡萄糖剥夺)中，在无或有30pM纯化的PER.C6TM产生的脑型EPO或30pM Eprex条件下，在37℃温育接近48小时。将细胞培养物暴露在缺氧和葡萄糖剥夺下少于24小时，随后恢复含氧量正常条件24小时。通过Alamar蓝的荧光性分析胞毒性，其报道的细胞存活力是代谢活性的函数。
在另一个方法中，将神经细胞培养物在含氧正常条件下，在无或有各种浓度纯化的PER.C6TM产生的EPO或Eprex条件下，暴露于1mM L-谷氨酰胺或α-氨基-3-羟基-5-甲基异唑-4-丙酸(AMPA)24小时。通过Alamar蓝的荧光性分析胞毒性，其报道的细胞存活力是代谢活性的函数。用PER.C6TM-EPO处理的细胞的存活力预期与用Eprex处理的细胞存活力相似。
实施例9与血清型EPO相比，PER.C6TM-EPO(脑型)在大鼠中刺激红细胞生成的活性 重组人EPO刺激红细胞生成的潜力可以在Barbone等(1994)所述啮齿动物模型中监测。根据这个模型，网织红细胞计数增加用作重组人EPO制剂的生物活性的测定标准。网织红细胞是红细胞的前体，其应答EPO的产生可用作EPO刺激红细胞生成的潜力的测定标准。红细胞生成增加导致血细胞比容较高。
在3只/组的6组Wag/Rij大鼠中对比PER.C6TM-EPO与Eprex的活性。将各种剂量的PER.C6TM-EPO(P7-EPO)，Eprex及作为阴性对照的稀释缓冲液在第0，1和2天经静脉内注射至阴茎静脉中。施用通过可商购的EPO特异性R & D Elisa试剂盒确定的5，25或125eU(Elisa单位)的PER.C6TM-EPO，而Eprex施用剂量为1或5eU。所有EPO制剂均在PBS/0.05％Tween 80中稀释为适当浓度，总体积为500μl。在第3天，通过刺破舌取250μl的EDTA血样。同一天测定总红细胞群中网织红细胞的百分比。
如图6所示(条形图表示总红细胞群中网织红细胞的百分比)，每天为大鼠施用1eU的Eprex共3天，在第4天与只接受稀释缓冲液的大鼠中网织红细胞计数相比网织红细胞计数明显增加。通过将Eprex剂量增加5倍该网织红细胞计数甚至更高。使用等量的PER.C6TM-EPO，网织红细胞计数明显增加较少。当使用1eU的Eprex和25eU的PER.C6TM-EPO时观测到网织红细胞计数相似增加，表明PER.C6TM-EPO在刺激红细胞生成中的活性比Eprex至少低25倍。Eprex与PER.C6TM-EPO在刺激红细胞生成的潜力之间的差异在较高剂量甚至更明显(即5eU Eprex和125eU PER.C6TM-EPO)。
实施例10PER.C6TM-EPO在实验性蛛网膜下腔出血之后对脑缺血的作用 为示出PER.C6TM-EPO在脑缺血期间的神经保护作用比血清型EPO更有效，我们对比了系统性施用PER.C6TM产生的脑型EPO与血清型EPO在兔蛛网膜下腔出血诱导的急性脑缺血模型中的作用。因此，将32只动物分为4组(8只/组)进行研究。
1组蛛网膜下腔出血； 2组蛛网膜下腔出血加上安慰剂； 3组蛛网膜下腔出血加上重组人血清型EPO； 4组蛛网膜下腔出血加上重组PER.C6TM-产生的EPO。
实验性蛛网膜下腔出血通过在将动物麻醉后将其自身血液经皮肤注射入脑大池而产生。在注射后，将兔腹部侧卧位15分钟以使腹部血块形成。在诱导蛛网膜下腔出血后5分钟为2，3和4组的动物分别注射稀释缓冲液，Eprex和纯化的PER.C6TM产生的脑型EPO，并在之后8，16和24小时继续注射。所有注射均经腹膜内施用。稀释缓冲液由血清白蛋白(2.5mg/ml)，氯化钠(5.84mg/ml)，无水柠檬酸(0.057mg/ml，H2O)组成。将动物在蛛网膜下腔出血后24小时行安乐死，取出其脑。之后将其脑在冷冻显微切片机中切成10-25μm的冠状切片，从前囟开始持续向后直至包括小脑(IrElAnd andMacLeod1993)。为观测及评估缺血诱导的神经元损伤数，将切片用苏木精和伊红染色。每个高倍显微镜视野下(100×)含有固缩核的嗜酸性神经元的数目在五个随机选择的在前囟后一些冠状水平获得的侧面皮质切片中确定。
PER.C6TM-EPO处理的动物与未处理或者用安慰剂处理的动物相比，预期损伤的神经元数较少。
实施例11在缺氧/再供氧之后促红细胞生成素受体在新生大鼠心肌细胞中的表达 如先前所述(Simpson and Savion 1982)，新生大鼠心肌细胞的原代培养物从1天龄的Sprague-Dawley大鼠的心室中制备。将心肌细胞在具有＜1％O2和5％CO2/95％N2的密闭的Plexiglas室中，在37℃使用Gas Pak Plus(BBL)温育2小时产生缺氧状态。通过更换用95％空气和5％CO2饱和的介质，将细胞暴露于含氧量正常的气氛中(再供氧)。
将心肌细胞用冰冷的PBS洗涤两次，使用Trizol(GIBCO)分离，通过氯仿提取及通过异丙醇沉淀总RNA。针对Northern分析，将15μg的总RNA在1.5％甲醛/MOPS-琼脂糖凝胶上分离，印迹于硝基纤维素上，与一个32P标记的EPO受体探针(+400bp cDNA片段)杂交。在65℃在磷酸盐缓冲液pH7.2中杂交过夜，随后在室温在2×SSC中洗涤2次，在65℃在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤两次及在室温在2×SSC中洗涤两次。杂交信号通过将此膜在X光胶片(Kodak)上曝光而观测。表达水平折算为GAPDH mRNA水平。
实施例12脑型PER.C6TM-EPO和血清型EPO(Eprex)对在缺氧条件下培养的新生大鼠心肌细胞的编程性细胞死亡的作用 如先前所述(Simpson and Savion1982)，新生大鼠心肌细胞的原代培养物从1天龄的Sprague-Dawley大鼠心室中制备。通过将心肌细胞在具有＜1％O2和5％CO2/95％N2的Plexiglas密闭室中，在37℃用Gas Pak Plus(BBL)温育2小时而产生缺氧状态。通过更换用95％空气和5％CO2饱和的介质，将细胞暴露于含氧量正常的气氛中(再供氧)。实验分成4组 A)心肌细胞在含氧量正常条件下培养(95％空气/5％CO2)； B)心肌细胞在缺氧/再供氧条件下在存在30pM纯化的PER.C6TM产生的EPO情况下培养； C)心肌细胞在缺氧/再供氧条件下在存在30pM纯化的Eprex的情况下培养； D)心肌细胞在缺氧/再供氧条件下在无EPO的情况下培养。
所有实验均一式三份进行。编程性细胞死亡通过形态学分析，DNA梯化及通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)而量化。针对形态学分析，将肌细胞单层用Hoechst33324固定并染色。编程性细胞死亡的形态学特点(细胞收缩，染色质浓缩，及片段化)通过荧光显微镜监测。计数了来自每个平皿12个随机选择的区域的至少400个细胞。
为确定DNA梯化(编程性细胞死亡的特征)，将心肌细胞在裂解缓冲液中裂解并在2％琼脂糖凝胶中电泳。将该凝胶用溴化乙锭染色，在紫外光下观测DNA片段。使用原位细胞死亡检测试剂盒(Boehringer Mannheim)通过TUNEL进行心肌细胞的编程性细胞死亡原位检测。
实施例13PER.C6TM-EPO和血清-EPO在大鼠心肌缺血/再灌注模型中对梗塞大小的作用 将成熟的雌性Sprague-Dawley大鼠(300-400g)用戊巴比妥钠(20mg/kg IP)和盐酸克他命(ketamine)(60mg/kg IP)麻醉。将导管插入颈静脉和气管，通过啮齿动物用通气机用100％氧气保持通气，维持呼出的CO2在3.5％-5％之间。行左胸廓切开术，从左冠状动脉起始3-4mm处缝合。在缺血前5分钟，随机给予动物各种浓度的PER.C6TM-EPO，血清型EPO或盐水(6只/组)。将冠状动脉周围的缝合处系紧开始缺血(30分钟)，随后再灌注4小时。除了缝合处不系紧之外，相同制备假手术大鼠(n＝6)。
在再灌注后，通过用紫罗兰色专利蓝(5％)和氯化三苯基四唑(TTC)差示染色确定梗塞大小。将冠状缝合带再系紧，经静脉内注射给予紫罗兰色专利蓝以染色心脏的正常灌注区。然后将心脏取出，在冰冷的盐水中水浴，之后切除心房，大血管和右心室。将左心室切成薄片，将未染色的危险区(AAR)从正常灌注的蓝色切片中分离，切成1-2mm3的切片，与TTC温育。使用解剖显微镜从TTC阳性区(砖红色染色)中分离坏死区(AN，灰白色)。然后将所有心肌区域单独称重并计算梗塞大小。
实施例14分离及分级分离含有高含量α1，3-连接的岩藻糖的PER.C6TM-EPO糖形式 使用岩藻糖特异性Aleuria aurantia凝集素(AAL)优先纯化具有高含量Lewis x和/或唾液酸-Lewis x的PER.C6TM-EPO糖形式(glycoforms)。通过使用特异于人EPO的单克隆抗体经亲和柱层析进行(见实施例2)，将由产生EPO的PER.C6TM细胞分泌入培养基中的EPO首先从细胞碎片及其它污染物中分离。之后，将大约270μg(或27,000eU)纯化的EPO进行第二次层析，其中EPO分子以0.1ml/分钟与含有固定AAL的柱结合(AAL Hitrap柱1ml，Bio Med Labs)。携带岩藻糖的EPO糖形式通过使用L-岩藻糖(Sigma)作为与AAL结合的竞争剂从该柱中洗脱。通过应用一个于PBS(Gibco，含有154mMNaCl，1.05mM KH2PO4及3.0mM Na2HPO4，pH＝7.4)中的梯度步骤获得四种EPO亚部分，从60μM岩藻糖开始(部分1)，随后为200μM岩藻糖(部分2)，随后为400μM岩藻糖(部分3)，最后为1000μM岩藻糖(部分4)。该梯度的第一个步骤持续10分钟，其它步骤持续5分钟，流速为0.5ml/分钟。层析图中214nm的UV信号示出在每种部分中从柱中洗脱的物质(见图9)。收集0.5m1部分并集合两或三个峰部分(见图9)。
将这些部分的缓冲液使用10kDa microcon(Millipore)更换为20mM磷酸盐，并将这些部分在相同microcon上浓缩为20-30μl。通过N-聚糖酶F处理N联聚糖从EPO集合中释放，通过神经氨酸酶处理脱唾液酸化。各种EPO样品的代表性MALDI-TOF MS谱示于图10A。还示出了每个集合中不同寡糖的相对丰度(见表IX)。数据表明从AAL柱中较晚洗脱的部分含有相对更多的岩藻糖残基。例如，较晚从柱中洗脱的部分含有丰富的聚糖，峰为2507.9和2978.1 Dalton，其含有3或4个岩藻糖残基，而质量为1891.7和2215.8只含有1个岩藻糖残基的聚糖在这些部分中相对未充分表现。因此，这些部分含有丰富的具有所谓Lewis x结构的N-聚糖。针对这个实验使用PNGase F释放及用MALDI-TOF MS检测的每个EPO分子N-联聚糖上的Lewis x结构的平均数是部分1为2.2，部分2为2.7，部分3为3.6，部分4为4.1。起始物质含有每个EPO分子2.6个Lewis x结构。在使用克隆C25的一个单独实验中，获得部分4(图10B中质谱)，其含有更多的Lewis x结构，每个EPO分子N联聚糖上有5.7个Lewis x结构。这个方法使得可以从培养基中纯化促红细胞生成素，这通过利用翻译后修饰的特异性特征如生产该蛋白质的细胞带来的Lewis x结构而进行。然而这非意味着其它方法不能用于正确纯化具有所述(预定)翻译后修饰的蛋白质。
在部分4中洗脱的物质代表EPO的一种新形式；其主要含有质量～2185kDa的N-联聚糖，其相应于在两个触角上均具有GalNAc-Lewis x结构的一个复杂双触角N-联糖。部分4含有大约8％的部分1-4中洗脱的总EPO。这表明主要具有双触角GalNAc-Lewisx结构的这一新形式EPO代表一种低丰度的EPO，其可以使用上述方法富集。
实施例15分离及分级分离具有高含量LacdiNAc的PER.C6TM-EPO糖形式 携带所谓lacdiNAc寡糖结构的PER.C6TM-EPO糖形式通过使用这些lacdiNAc结构的单克隆抗体而特异性分离。小鼠单克隆抗体如99-2A5-B，100-2H5-A，114-2H12-C，259-2A1和273-3F2(VanRemoortere et al.2000)特异性识别lacdiNAc结构，它们根据本领域技术人员已知的方法纯化及与CNBr-活化的琼脂糖4B珠连接。由人生产EPO的PER.C6TM细胞分泌入培养基中的PER.C6TM-EPO首先通过使用特异于人EPO的单克隆抗体经亲和柱层析从细胞碎片及其它污染物中粗分离。之后，将纯化的EPO进行第二次层析，其中携带lacdiNAc结构的EPO分子与含有固定的lacdiNAc-特异性单克隆抗体的柱结合。没有lacdiNAc结构的EPO糖形式不与该柱结合，在流经液中收集。携带lacdiNAc结构的EPO糖形式在低pH从柱中洗脱，或者使用GalNAc或合成的lacdiNAc寡糖作为与lacdiNAc特异性抗体结合的竞争剂而从柱中洗脱。携带相对高百分比lacdiNAc结构的EPO糖形式单独从柱中洗脱，这通过在洗脱期间逐步或逐渐提高GalNAc或lacdiNAc浓度而进行。具有相对高百分比lacdiNAc结构的EPO糖形式与具有相对低百分比lacdiNAc结构的EPO糖形式相比，在较高浓度的GalNAc或lacdiNAc下洗脱。根据上述方法，这个方法也使得可以通过应用翻译后修饰的特异性特征如生产该蛋白质的细胞带来的Lewis x和lacdiNac结构而从培养基中纯化促红细胞生成素。
实施例16分离及分级分离具有高含量GalNAc-Lewis x的PER.C6TM-EPO糖形式 携带所谓GalNAc-Lewis x寡糖结构的PER.C6TM-EPO糖形式通过使用这些GalNAc-Lewis x结构的单克隆抗体而特异性分离。小鼠单克隆抗体如114-5B1-A，176-3A7，290-2D9-A和290-4A8(VanRemoortere et al.2000)特异性识别GalNAc-Lewis x结构，它们根据本领域技术人员已知方法纯化并与CNBr-活化的Sepharose 4B珠连接。由人生产EPO的PER.C6TM细胞分泌入培养基中的PER.C6TM-EPO首先通过使用特异于人EPO的单克隆抗体经亲和柱层析而从细胞碎片及其它污染物中粗分离。之后，将纯化的EPO进行第二次层析，其中携带GalNAc-Lewis x结构的EPO分子与含有固定的GalNAc-Lewis x特异性单克隆抗体的柱结合。没有GalNAc-Lewis x结构的EPO糖形式不与附着于柱的抗体结合，在流经液中收集。携带GalNAc-Lewis x结构的结合的EPO在低pH从柱中洗脱，或者使用合成的GalNAc-Lewis x作为与GalNAc-Lewis x特异性抗体结合的竞争剂而洗脱。携带高含量GalNAc-Lewis x的EPO糖形式可以单独从柱中洗脱，这通过在洗脱期间逐步或逐渐提高GalNAc-Lewis x竞争剂的浓度而进行。具有高GalNAc-Lewis x含量的EPO糖形式与具有低含量GalNAc-Lewis x的EPO糖形式相比，在较高浓度GalNAc-Lewis x洗脱。同样，根据上述方法，这个方法也使得可以通过应用翻译后修饰的特异性特征如生产该蛋白质的细胞带来的Lewisx，lacdiNac或GalNac-Lewis x结构而从培养基中纯化EPO。然而这并非意味着具有(预定)翻译后修饰的其它修饰不能用于正确纯化蛋白质。
本领域技术人员能意识到，尽管已经例证了关于EPO的详细实施例，但本发明不限于生产和/或纯化具有脑型特征的EPO。通过本发明的方式和方法可以生产发现可用于治疗脑及中枢和周围神经系统的其它部位的病变和/或其它缺血/再灌注损伤的组织的各种其它(人)治疗和/或诊断肽和蛋白质，。
实施例17具有低含量唾液酸的EPO与具有高含量唾液酸的EPO相比，在大鼠大脑中动脉闭塞后降低梗塞大小中具有相似效力 使用与Siren等于2001公布的方法相似的方法，在重量为200-250g的F344/Ico雄性大鼠中研究PER.C6TM-EPO和Eprex对脑梗塞大小的作用，所述大鼠通过闭塞大脑中动脉(MCA)实验性诱导脑梗塞。将动物的右颈总动脉永久闭塞，而MCA使用金属夹可逆性闭塞60分钟。将纯化的具有唾液酸平均含量＜6个唾液酸/分子的PER.C6TM-EPO或者具有唾液酸平均含量大于9个唾液酸/分子的Eprex(Jansen-Cilag；可商购的EPO)，在进行MCA闭塞之前5分钟经静脉内应用，剂量为5000eU(ELISA单位)/kg体重。特别地，PER.C6TM-EPO制剂的唾液酸含量在0-9个唾液酸/分子范围，而Eprex含有＞8个唾液酸/分子。在60分钟后，去除围绕MCA的金属夹结束闭塞。在除去结束夹后通过显微镜观测再灌注情况。24小时后，使用MRI检测存活大鼠的脑部，以揭示表观扩散系数(ADC)和T2图。这些图用于量化梗塞值(图7A和7B)。
图7A和7B所示结果示出与未处理的大鼠相比，用PER.C6TM-EPO和Eprex制剂处理的大鼠表现相似的梗塞面积缩小。因为PER.C6TM-EPO制剂具有比Eprex制剂更低的唾液酸含量，因此这个结果表明高唾液酸含量不是EPO在体内的神经保护活性所必需的。
实施例18确定EPO在大鼠内的半寿期 为确定Eprex在体内的半寿期，将雄性Wag/Rij大鼠静脉内注射于PBS/0.05t Tween-80中稀释的150eU Eprex，终体积为500μl。就在施用底物之前，使用Lab.Animals 34，372所述方法取200μl的EDTA血样作为阴性对照。在注射后5，15，30，60，120，180，240，300，360，420，480和540分钟，使用同样方法取200μl的EDTA血样。在最后一次取样后，将动物处死。将样品在室温在760×g离心15分钟，在30分钟内收集。将血浆样品在EPO特异性Elisa(R &D)中测试以确定每个样品中EPO的浓度。
如图8所示，血浆中Eprex浓度降低显示一种双相曲线，代表分布相和清除相。基于这些结果可以估计Eprex在清除相期间半寿期为大约180分钟。使用同样方案测定PER.C6TM-EPO的半寿期。
实施例19在HT1080细胞中E1A表达对EPO糖基化的作用 将HT1080细胞用编码腺病毒5型E1A基因的表达载体(pIg.E1A.neo)或者编码腺病毒5型E1A+E1B基因的表达载体(pIg.E1A.E1B；这两个质粒均见于美国专利5,994,128所述)稳定转染，以确定腺病毒5型E1A和/或E1A+E1B基因的表达对糖基化的作用。为进行一种标记蛋白的糖基化，将细胞用编码EPO的表达载体(pEPO2001/neo)共转染。对照HT1080细胞仅用EPO表达载体转染。
当细胞达到70-90％铺满时，用脂转染胺试剂(Gibco)进行转染，每7.85cm2平皿使用1.0μg pE1A.neo或者pE1A.E1B及1.0μgpEPO2001.neo。将培养基在第2，3，7，10和13天用含有DMEM，1％NEAA(非必需氨基酸，Invitrogen)，250g/ml Geneticin(Gibco)和10％FBS的选择培养基置换。用E1A稳定转染的HT1080细胞进行的初步实验表明E1A表达导致细胞形态改变。与Frisch等(1991)所述观测结果相一致，我们观测到E1A基因的稳定表达诱导一种扁平形态学。根据这个认识，我们通过挑取扁平的克隆粗选择E1A表达克隆。在第14天挑取克隆并在37℃/10％CO2条件下在具有选择培养基的24孔平板中培养。
当细胞达到亚铺满状态时，基于培养基中EPO的存在选择生产EPO的细胞。使用EPO-特异性ELISA(QuantikineIVD人EPO-ELISA，R&D系统)测定EPO。按比例扩大生产EPO培养物并分析E1A表达情况。因此，将细胞在每10ml补加1片Complete Mini蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics)的裂解缓冲液(1％NP40，0.5％脱氧胆酸，0.5％SDS，150mM NaCl，20 mMTris-HCl，pH7.5)中裂解。将裂解物通过在14,000g离心10分钟而澄清。将等量的(基于蛋白质含量)澄清细胞裂解物在还原条件下通过10％BisTris凝胶(NuPAGE，Invitrogen)电泳。之后使用NuPAGE的Trans-Blot系统(Invitrogen)将蛋白质移至PDVF膜(P-Immobilon)上。将印迹在室温用于TBST中5％Protifar(Nutricia)封闭1小时或者过夜，随后与在5％Protifar/TBST中1∶400稀释的单克隆小鼠抗人E1A IgG2(克隆M73，Santa Cruz)在室温温育1小时或在4℃温育过夜。将印迹用TBST洗涤，与在5％Protifar/TBST中1∶1000稀释的过氧化酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Biorad)在室温温育45分钟。在用TBST洗涤后，将印迹用ECL plus系统染色。55％的EPO阳性E1A克隆和68％的EPO阳性E1A.E1B克隆显示E1A的清晰表达(表X)。高水平表达E1A的HT1080/E1A-EPO和HT1080/E1A.E1B-EPO克隆表现出一种扁平形态(如图11)。
将HT1080/EPO，HT1080/E1A-EPO和HT1080/E1A.E1B-EPO克隆产生的EPO进行聚糖分析。为此，将HT1080/E1A.EPO克隆008，HT1080/E1A.E1B.EPO克隆072和HT1080/EPO克隆033(表X)种植在175cm2培养瓶中，传代数(pn)为7。24小时后，当细胞达到60-80％铺满时，用生产培养基(DMEM，1％NEAA)代替选择培养基。3天后收获这个培养基并将细胞用裂解缓冲液裂解。根据实施例2所述从培养基中纯化EPO。
通过N-聚糖酶F处理释放各种EPO制剂的N-联聚糖，随后通过具有脉冲电流检测设备的高效阴离子交换层析(HPAEC-PAD；Dionex)进行分析。在这个特殊的层析系统中，EPO衍生的聚糖链在碱性条件下基于其电荷而分离。如图12所示，HT1080/E1A-EPO细胞产生的EPO的聚糖与对照HT1080/EPO细胞产生的EPO的聚糖相比电荷较少，这表明后者细胞产生的EPO与E1A表达细胞产生的EPO相比是更广泛唾液酸化的。关于N-聚糖结构的更详细信息通过对EPO制剂的糖链进行MALDI-MS分析而获得。N-链聚糖通过N-聚糖酶F处理从EPO制剂中释放，并通过神经氨酸酶处理而脱唾液酸化。各种代表性EPO制剂的质谱见于图13所示。使用GlycoMod软件(www.expasy.ch/tools/glycomod)基于观测到的质谱预测糖组成(表XI)。数据示出由对照HT1080/EPO细胞产生的EPO的聚糖质谱与HT1080/E1A-EPO和HT1080/E1A.E1B-EPO细胞产生的EPO的聚糖质谱不同。质谱表明由后两种细胞产生的EPO与对照细胞产生的EPO相比具有相对较少的己糖和相对较多的脱氧己糖。另外，质量相对较低的含有相对高量己糖胺和脱氧己糖胺的聚糖结构在HT1080/E1A-EPO和HT1080/E1A.E1B-EPO细胞产生的EPO中发现。其中有一些在对照细胞产生的EPO中不存在。由表达E1A和E1A+E1B的HT1080细胞产生的EPO的聚糖质谱与在PER.C6TM细胞中产生的EPO的聚糖质谱相似(见实施例3)，提示由前两种细胞产生的EPO的聚糖含有Lewis x和LacdiNAc结构，及含有缺乏末端半乳糖的结构。为证实由表达E1A和E1A+E1B的HT1080细胞产生的EPO与对照HT1080细胞产生的EPO相比含有更多的岩藻糖和GalNAc，进行单糖分析。为此，N-联聚糖通过N-聚糖酶F神经氨酸酶处理从EPO制剂中释放，随后水解并通过HPAEC-PAD分析。图14示出EPO聚糖的单糖谱，根据甘露糖的量标准化。数据示出由表达E1A和E1A+E1B的细胞产生的N-联聚糖确实具有相对较高量的岩藻糖和GalNAc。
质谱及单糖数据强烈提示由表达E1A和E1A+E1B的细胞产生的EPO含有多个岩藻糖残基。为支持这些数据，将EPO制剂用裂解末端α1-3和α1-4岩藻糖残基的α-岩藻糖苷酶(Almond meal)处理。之后，将样品通过Maldi-MS分析并将结果与得自未进行α-岩藻糖苷酶处理的EPO制剂的结果相对比。图15示出在经α-岩藻糖苷酶处理后，代表具有触角岩藻糖的N-聚糖的峰降低，而衍生自这些结构的峰增加。例如，具有m/z值为～2038和～2184的峰降低，而～1892峰增加。
总而言之，这些数据示出单独的腺病毒E1A或者与E1B一起的表达可改变细胞的糖基化状况。观测到的单独E1A的表达足以达到这种改变表明E1A与这种改变相关。糖基化中的变化典型包括Lewisx，LacdiNAc和GalNAc-Lewis x结构形成。对许多表达E1A和E1A+E1B的HT1080细胞已经加以定性，而且这些细胞的大多数产生具有这些特征性聚糖结构的聚糖。然而与HT1080亲代细胞产生的聚糖结构相比，这些结构的丰度发生变化(数据未示出)。聚糖结构的丰度很大程度上与E1A的表达相关。这表明糖基化受E1A的影响程度很大程度上依赖于E1A基因的表达水平。
实施例20对比高剂量的PER.C6TM-EPO和CHO-EPO的造血活性 在大鼠中测定PER.C6TM-EPO的造血活性并与衍生自中国仓鼠卵巢细胞的EPO(CHO-EPO)的活性相对比。选择两种CHO-EPO制剂(1)Eprex(Jansen Cilag)，其是一种可商购的具有高唾液酸含量的重组CHO-EPO，(2)frCHO-EPO，其是一种具有较低唾液酸含量(与PER.C6TM-EPO相似)的CHO-EPO制剂(见图16)，其通过CHO产生EPO并随后通过如实施例2，3和EP0428267所述的层析方法纯化这些低唾液酸化的同种型而获得。
用4组WAG/Rij大鼠(6只/组)进行研究。在阴茎静脉中静脉内注射单剂量的5000eU(ELISA单位，通过可商购的EPO特异性R&D Elisa试剂盒测定)/kg体重的Eprex，frCHO-EPO，PER.C6-EPO或稀释缓冲液(作为对照)。将所有EPO制剂在稀释缓冲液(PBS，0.03％Tween-80，0.5％甘氨酸)中稀释为合适浓度，总体积为500μl。4天后，通过刺破舌取250μl EDTA血样。同一天使用自动血细胞计数器分析血样的血细胞比容及总红细胞群中网织红细胞的百分比。
测定血细胞比容水平并表示为通过离心血液获得的压积红细胞的体积百分比(图17)。结果表明PER.C6TM-EPO和frCHO-EPO不诱导血细胞比容增加，而Eprex诱导血细胞比容增加。
如图18所示，与只接受稀释缓冲液的大鼠相比，EPO诱导网织红细胞计数明显增加。Eprex和frCHO-EPO表现相似的刺激，这种刺激显著高于(p＜0.001)PERC6-EPO处理的动物。
评估网织红细胞中RNA含量使得我们可以确定其成熟程度。幼网织红细胞部分(IRF)示于图19。Eprex处理的大鼠与对照大鼠相比显示明显较高的幼网织红细胞百分比。这表明由Eprex刺激的网织红细胞形成在注射4天后仍在进行。这种作用在frCHO-EPO和PER.C6TM-EPO-分别处理的大鼠中不明显或不存在(图19)。总而言之，数据示出所有三种EPO制剂均诱导网织红细胞形成，然而该作用的持续时间在Eprex最长，在PER.C6TM-EPO最短，而frCHO-EPO显示中等作用。这提示PER.C6TM-EPO的低造血作用不只是其低唾液酸含量所致，而且还与其它聚糖特点相关。
实施例21对PER.C6TM-EPO的N-聚糖结构的详细结构分析 由于可存在各种同分异构体，因此通过质谱获得的质量信号不能总是明确指定某一糖结构。为获得PER.C6TM-EPO的N-联聚糖结构的进一步信息，对PER.C6TM-EPO进行内切糖苷酶和外切糖苷酶处理。
首先，使用内切糖苷酶F2。这个酶在高甘露糖的三甘露糖基核心或双触角复合型N-联聚糖的GlcNAc残基之间进行裂解(图20)。与PNGase F相反，内切糖苷酶F2不裂解三或四触角聚糖并因此用于区别双触角与三/四触角聚糖结构。图21中示出用PNGase F或内切蛋白酶F2处理的PER.C6TM-EPO的MALDI谱。当对比这些图谱时，应记住由内切糖苷酶F2释放的聚糖比由PNGase F释放的聚糖小。这是GlcNAc和岩藻糖残基(349Da)之间的不同，由于酶的裂解位点不同所致(见图20)。
在m/z＞2185的PNGase F消化物所观测到的所有结构均是三或四触角结构，因为这些聚糖无一在内切糖苷酶F2消化物中观测到。较低质量的即m/z 1485，1648，1689，1835，1851，1997，2038和2185的大多数结构，在内切糖苷酶F2消化中具有相应的峰而且是双触角的。可能也存在一些三或四触角结构的同分异构体，但不是特别多，因为图21中两个质谱中峰比在很大程度上类似。内切糖苷酶F2消化谱没有相应于PNGase F谱中m/z 1892和2054的峰。这证实这些峰代表非双触角的聚糖，而是分别无或有一个半乳糖残基的四触角聚糖。这些数据证实PER.C6TM-EPO含有具有末端GlcNAc的聚糖。
接下来使用外切糖苷酶进一步研究N-聚糖结构。聚糖通过PNGase F处理从PER.C6TM-EPO中释放并使用神经氨酸酶脱唾液酸化。随后，将样品用以下不同的外切糖苷酶组合处理 1)β-半乳糖苷酶，其裂解非还原的末端Galβ1-4GlcNAc(和Galβ1-4GalNAc及在较高酶比率裂解Galβ1-3键)。
2)牛肾α-岩藻糖苷酶，其从N-和O-聚糖中裂解α-2，3，4和6连接的岩藻糖。与裂解其它α-岩藻糖键相比，其更有效裂解N-联聚糖的三甘露糖基核心上的α-6连接的岩藻糖。
3)杏仁粉α-岩藻糖苷酶，其裂解非还原的末端α1-3或α1-4岩藻糖苷酶残基。
4)β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(GlcNAc-ase)，其从复杂的碳水化合物中裂解非还原的末端β1-2，3，4，6连接的N-乙酰葡糖胺。其不裂解N-乙酰半乳糖胺残基。
图22示出PER.C6TM-EPO聚糖上预期的键类型。同时进行半乳糖苷酶和岩藻糖苷酶温育，即在岩藻糖苷酶温育期间还存在活性半乳糖苷酶。当半乳糖苷酶和岩藻糖苷酶丧失其活性时，进行进一步GlcNAc-ase处理。
在图23中，示出的结果是针对半乳糖苷酶处理的。在这个图中给出了质谱中所有峰的m/z值和相对强度，其具有5％或更高的相对强度(即峰高度除以所有峰的总高度)。另外表明了推测的聚糖结构。指定为半乳糖基化结构的峰在经半乳糖苷酶处理后改变，虽然不总是完全改变。当岩藻糖存在于邻近GlcNAc残基上时，发现半乳糖苷酶不释放半乳糖。在经半乳糖苷酶处理后似乎出现一些三触角聚糖(m/z1689)。这是由于污染GlcNAc-ase所致，通过使用标准聚糖表明所述酶存在于半乳糖苷酶制剂中(数据未示出)。
然后将半乳糖苷酶处理的聚糖进行岩藻糖苷酶处理(图24和26)。在牛肾岩藻糖苷酶情况中，在质谱的所有峰中均产生一个146Da移位。这是岩藻糖残基的质量。由于这个岩藻糖苷酶优选裂解α-6连接的岩藻糖残基，而且因为所有峰均只丧失一个146Da单位，因此这表明所有聚糖均含有一个核心岩藻糖。
半乳糖苷酶处理的聚糖集合随后与杏仁粉岩藻糖苷酶温育，给出一个相对简单的谱(图25和26)。所有岩藻糖残基均从触角中除去，仅剩下单独的(核心)岩藻糖基化的聚糖。剩余的末端半乳糖残基也被除去，因为半乳糖苷酶在岩藻糖苷酶温育期间仍是活性的。在经GlcNAc-ase处理脱岩藻糖基化的聚糖后，只剩下4个峰。主峰在m/z1079观测到，代表岩藻糖基化的三甘露糖基核心。在m/z 1485和m/z1891的峰证实在触角中存在GalNAc残基，因为这个残基未被GlcNAc-ase除去。在m/z 1444的峰证实存在乳糖胺重复在半乳糖苷酶处理期间半乳糖肯定已经由GlcNAc屏蔽。
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权利要求
1.一种选择能生产包含预定翻译后修饰的蛋白质分子的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤
a)分析所述哺乳动物细胞中或所述哺乳动物细胞表面上组织特异性标记或者组织特异性标记组合的存在与否，所述标记或标记组合是所述蛋白质分子上存在所述预定翻译后修饰的指征；
b)基于所述组织特异性标记的存在与否选择所述哺乳动物细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述预定翻译后修饰包括糖基化。
3.权利要求2的方法，其中所述糖基化包括至少一个修饰，所述修饰选自Lewis x、唾液酸Lewis x、GalNac结构、GlcNac结构、LacdiNAc结构、附着于N-乙酰葡糖胺上的α1，3-连接的岩藻糖、末端N-乙酰葡糖胺、末端半乳糖、等分N-乙酰葡糖胺、硫酸基团和唾液酸。
4.权利要求3的方法，其中所述糖基化包括Lewis x和/或唾液酸Lewis x结构。
5.一种从异质细胞群中获得哺乳动物细胞的方法，所述哺乳动物细胞能生产包含Lewis x和/或唾液酸Lewis x结构的蛋白质分子，所述方法包括以下步骤
a)在所述异质细胞群中基于所述细胞生产的蛋白质上的Lewis x和/或唾液酸Lewis x结构淘选细胞；
b)选择能生产包含所述Lewis x和/或唾液酸Lewis x结构的蛋白质的细胞。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是神经来源的。
7.权利要求1-5任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
8.权利要求1-5任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞具有编码人腺病毒E1区域或其一部分的核酸，从而所述哺乳动物细胞携带可表达形式的所述核酸。
9.一种在哺乳动物细胞中生产包含预定翻译后修饰的蛋白质分子的方法，所述方法包含通过权利要求1-8任一项的方法鉴别和/或选择和/或获得所述哺乳动物细胞，并在所述哺乳动物细胞中表达所述蛋白质分子的步骤。
10.权利要求9的方法，其中所述哺乳动物细胞保藏在欧洲动物细胞保藏中心的应用微生物学和研究中心(the Center for AppliedMicrobiology and Research)，保藏号96022940。
11.权利要求10的方法，其包括从所述哺乳动物细胞培养物中纯化所述蛋白质分子的额外步骤。
12.权利要求11的方法，其中所述纯化包括利用所述预定翻译后修饰的步骤。
13.权利要求12的方法，其中所述纯化包括一个步骤，其中利用特异于所述预定翻译后修饰中存在的表位的一种抗体。
14.权利要求13的方法，其中所述纯化包括凝集素结合步骤。
15.权利要求12-14任一项的方法，其中所述蛋白质分子是促红细胞生成素。
全文摘要
本发明提供了鉴别、选择及获得能生产包含预定翻译后修饰的蛋白质分子的哺乳动物细胞的方法，其中所述翻译后修饰是表达所述蛋白质分子的哺乳动物细胞完成的。优选地，所述预定翻译后修饰包含糖基化。本发明还提供了施用通过本发明方法可获得的哺乳动物细胞获得和生产蛋白质分子的方法。优选所述蛋白质分子包含促红细胞生成素(EPO)，因为(重组)EPO的作用主要依赖于蛋白质上存在的寡糖的糖基化模式。本发明还提供了基于其生产的蛋白质和/或翻译后修饰的能力而获得的哺乳动物细胞，其中预定的翻译后修饰是所希望的。优选地，所述哺乳动物细胞具有神经特征和性质，由此可以生产携带“神经或脑型”性质的大量重组蛋白质。
文档编号A61K38/00GK101177700SQ200710149498
公开日2008年5月14日 申请日期2002年10月29日 优先权日2001年10月29日
发明者迪尔克·扬·埃尔贝特斯·奥普斯泰尔滕, 约翰·克里斯蒂安·卡普坦, 彼德鲁斯·克里斯蒂安纳斯·约翰内斯·约瑟夫斯·帕西耶, 罗纳德·亨德里克·彼得·布鲁斯, 亚伯拉罕·布特 申请人:克鲁塞尔荷兰公司