抑制表皮生长因子受体基因表达的siRNA及其应用的制作方法

专利名称：：抑制表皮生长因子受体基因表达的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学与生物医药
技术领域：
，具体为抑制人类表皮生长因子受体(EGFR)表达的siRNA及其应用。
背景技术：
：RNA干扰(RNAinterference,RNAi)，又叫基因沉默，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，clsMA)诱发的、同源rn副A高效特异性降解的现象。它是一种在动植物中广泛存在的序列特异性转录后水平的基因沉默过程，是牛物基因组抵抗病毒之类的外来遗传元件入侵的一种生物保护机制。生物体内的双链KNA可来自于RNA病毒感染、转座子的转录产物、外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断，同时，与其内源的细胞基因组中的基因也被阻断。RNAi还具有很高的特异性。19个核苷酸的双链RNA几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的一个核苷酸突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了(Brummelkamp.T.R，Bernads.R,Agami.R.AsystemforstableexpressionofshortintereringRNAsinMammaliancells.Science.2002;296:550-553)，这对双链RNA的应用是非常重要的，这可以避免双链RNA降解与靶mRNA同家族的其他的mRNA。最有效的小分子干扰RNA(smallinterferenceRNA,以下简称siRNA)是19个碱基大小、且3'端有两个碱基突出(悬挂碱基)的双链RNA。siRNA的序列专一性要求非常严格，与靶mRNA之间的一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果(BrownD,JarvisR，PallottaVandetal.，RNAinterferenceinmammaliancellculture:design,executionandanalysisofthesi腿effect.Technotes,9(1):3-5:MiyagishiMandTairaK.，U-6promoter-drivensiRNAswithfoururidine3'-overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.NatureBiotechnology,20:497-500)。快速发展的RNAi技术为恶性肿瘤机制的研究提供了有力工具，同时也推动了以该技术为基础的肿瘤治疗策略的研发进程。肿瘤分子生物学研究表明，肿瘤是由于基因异常引起的疾病，致病机理包括癌基因的激活和抑癌基因的失活以及细胞周期的异常，肿瘤发病分子机理的进一步阐明为肿瘤基因治疗提供了可靠的理论依据。RNA干扰技术是近几年兴起的生物技术，用小分了下扰RNA抑制特定基因的表达是基因治疗的重要组成部分。人类表皮生长因子受体(印idermalgrowthfactorrec印tor，EGFR)家族是具有酪氨酸激酶活性的膜受体。EGFR广泛表达于上皮、间质及神经组织。在正常组织中调控细胞的生长、分裂和分化等重要牛理过程。实验研究发现EGFR在许多人类肿瘤中有不同程度的过度表达，如头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌和脑肿瘤等。且己证明EGFR与肿瘤的分化程度、恶性程度及浸润程度、放化疗敏感性、肿瘤耐药性及预后等密切相关(JeffreyA.K'DavjdA.S，etaletal.，pl85neuExpressioninHumanLungAdenocarcinomasPred丄ctsShortenedSurvival.CancerRes，1990，50:5184-5191;BattistaP，PizzicannellaG，etalctal.，Theepidermalgrowthfactorfamilyinpulmonarycarcinoids:Animmunahistochemicalevidenceofgrowth-promotingcircuits.ModPathol'1993，6(2):162-166.)。EGFR家族被认为是抗肿瘤治疗理想的分子靶点。
发明内容本发明的目的在于提供能在mRNA水平和蛋白水平上抑制EGFR基因表达的siRNA.实现上述目的的技术方案如下-一种抑制EGFR基因表达的siRNA，其核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任一种正义链5'-GGCUGGUUAUGUCCUCAUUGCCC-3'，反义链5'-GAGGGCAAUGAGGACAUAACCAGCC-3';正义链5'-CAAGCAACAUGGUCAGUUUUCUCUU-3'，反义链5'-AAGAGAAAACUGACCAUGUUGCUUG-3';正义链5'-GCUGGAUGAUAGACGCAGAUAGUCG-3，，反义链5'-CGACUAl]CUGCGUCUAUCAUCCAGC-3'，或上述三对核苷酸序列的任一对正义链3'末端、反义链中5'末端对应缺失1—6个碱基的双链RNA分子。优选地，所述抑制EGFR基因表达的siRNA为以下双链RNA分子中的任一种正义链5'-GGCUGGUUAUGUCCUCAUU-3'，反义链5'-AAUGAGGACAUAACCAGCC-3';正义链5'-CAAGCAACAUGGUCAGUUU-3',反义链5'-AAACUGACCAUGUUGCUUG-3';正义链5'-GCUGGAUGAUAGACGCAGA-3'，反义链5'-UCUGGGUCUAUCAUCCAGC-3'。所述双链RNA分子的3'末端还设有两个脱氧核苷组成的悬挂碱基(Over-hang)，所述悬挂碱基例如可为本领域技术人员熟知的dTdT或dTdC或dUdU等，以增加siRNA的活性。更优选地，所述抑制EGFR基因表达的siRNA为正义链5'-GGCUGGUUAUGUCCUCAUUdTdT-3'，反义链5'-AAUGAGGACAUAACCAGCCdTdT-3'。优选地，上述抑制EGFR基因表达的siRNA为任意部分经化学修饰的双链RNA分子；所述化学修饰包括对连接核苷酸的磷酸二酯键的部分修饰或用其它任何化学建取代；化学修饰包括对这些siRNA分子核酸戊糖的2位上的0H作任何化学的修饰和改变。本发明的另一目的是提供上述siRNA在制药中的应用。实现上述目的的技术方案如下上述抑制EGFR基因表达的si腦A在制备预防或治疗人类表皮生长因了受体相关的疾病的药物或制剂中的应用。所述疾病为肺癌、肝癌、食管癌、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔上皮癌、卵巢癌、头颈癌、脑瘤、胶质细胞瘤的任一种或多种。RNA干扰技术是将一段双链的siRNA导入细胞，使具有同源序列的基肉表达受到抑制，是肿瘤基因治疗的新领域。本发明的技术方案中的siRNA序列的长度均为19一25bp，这些siRNAs既足够长诱导基因特异性抑制，又足够短，逃避宿主干扰素反应。本发明所述抑制EGFR基因表达的siRNA为制备预防或治疗人类表皮生长因子受体相关的疾病的药物或制剂提供了新的，较好的选择。图l是各实验组和对照组分别作用于A549细胞后Rea.1-timeRT-PCR法检测各处理组细胞中EGFRmRNA的表达量示意图2是各实验组和对照组分别作用于A549细胞后Westernb1ot法检测各处理组细胞巾EGFR蛋白的表达量示意图3是MTT法分析EGFRsiRNA1实验组和对照组对A549细胞增殖的影响示意图4是AnnexinV-FITC/PI双染法检测EGFRsiRNAl实验组和对照组对A5的细胞凋亡的影响示意图5是活体成像监测不同时间点不同处理组裸鼠肺癌皮下移植瘤的生长情况示意图，其中1:空白对照组；2:NotargetsiKNA对照组；3:EGFRsiRNA治疗组；图6是各处理组裸鼠肺癌皮下移植瘤荧光值随时间变化的关系示意图7是实施例七中所述siRNA分子对EGFRmRNA表达的抑制效果示意图；图8是实施例八中所述siRNA分子对EGFRmRNA表达的抑制效果示意图。具体实施例方式发明人采用siRNA设计法则，并结合发明人自主开发的设计软件辅助设计抑制EGFR基因表达的siRNA序列，通过实验筛选多条高效EGFRsiRNA序列其核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任一种正义链5'-GGCUGGUUAUGUCCUCAUUGCCCUC-3'，反义链5'-GAGGGCAAUGAGGACAUAACCAGCC-3';正义链5'CAAGCAACAUGGUCAGUUUUCUCUU-3，，反义链5，-AAGAGAAAACUGACCAUGUUGCUUG-3';正义链5'-GCUGGAUGAUAGACGCAGAUAGUCG-3，，反义链5'-CGACUAUCUGCGUCUAUCAUCCAGC-3'，或上述三对核苷酸序列的任一对正义链3'木端、反义链中5'末端对应缺失1一6个碱基的双链RNA分子。其中，任一对正义链3'末端、反义链中5'末端对应缺失1一6个碱基是指正义链和相应的反义链互补配对，例如，当选择的正义链为具有20个核苷酸时，则其互补配对的反义链也具有20个核苷酸。上述任一条抑制EGFR基因表达siRNA可用于制备预防或治疗人类表皮牛长因子受体相关的任何疾病的药物或制剂。实施例一EGFRsiRNA的设计与合成。首先在美国国立生物技术信息中心IVCBI数据库中获取人EGFRraRNA的序列全长(序列号AY588246)，使用本实验室自主开发的siRNA设计软件，设计三条EGFRsiRNA和一条阴性对照siRNA(NotargetsiRNA)。此外，设计了dTdT两个碱基的悬挂末端，以增加siRNA的稳定性。设计的siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成。表2设计的EGFRsiRNA及阴性对照NotargetsiRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例二RealtimeRT-PCR检测3条EGFRsiRNA对EGFRmRNA表达的抑制效果人肺腺癌细胞株A549常规培养于含10X胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于5WC0"37。C饱和湿度的孵箱中培养，用O.25%的胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的A549细胞，转染前24h将细胞接种于6孔培养板，接种密度为lXl()V'孔，使得次日转染时细胞融合度达30%50%。根据LipofectamineT"2000试剂操作指南进行转染，设空白对照组、阴性对照转染组(NotargetsiRNA)、EGFRsiRNAl转染组、EGFRsiRNA2转染组、EGFRsiRNA3转染组。转染方案为在250"0PTI-MEM中加入5uL,M的siRNA，室温孵育5min。在250uLOPTI-MEM中加入5yLLipofcctamine2000，室温孵育5min。将上述两种稀释液混匀，室温孵育20min后加入细胞板孔中，细胞置于培养箱常规培养。收集转染后24-48h的细胞，6孔板每孔加入lmLTrizo1,加入氯仿和异丙醇按常规方法抽提细胞总RNA，所提RNA溶于40nL无RNA酶水中，紫外分光光度计检测各处理组RNA的含量和纯度，并进行凝胶电泳，观察RNA完整性。以oligo(dT)w为引物，lugRNA为模板，按Promega逆转录试剂盒操作生成cDNA。各取逆转录的cDNA产物l.6PL做模板，利用SYBRGreenI染料实时定量PCR试剂盒检测不同转染组细胞中的EGFRmRNA表达，并以无RNA酶水作为阴性模板对照，以P-Actin作为内参。引物序列根据GenBank公布的cDNA序列设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件为95。C预变性]0s;94。C变性5s:退火30s;72。C延伸ls;45个循环。用2—AACT法计算和分析EGFR基因的相对表达量，确定EGFR基因的mRNA被siRNA沉默的程度。①EGFR基因PCR扩增长度为217bp，退火温度为55.6'C。上游引物5'-AGGACCAAGCAACATGGTCA-3'下游引物5'-CCTTGCAGCTGTTTTCACCT-3'②P-Actin基因PCR扩增长度为452bp，退火温度为6CTC。上游引物5'-CGTACCACTGGCATCGTGAT-3'下游引物5'-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'结果见图l。与NotargetsiRNA转染组比较，EGFR的三条siRNA均明显抑制了EGFRmRNA的表达，其中EGFRsi腦Al的抑制效果最好，抑制率为85%左右。NotargetsiRNA转染组与空白对照组相比无明显差异。实施例三Westernblot检测三条siRNA对EGFR蛋白表达的抑制效果人肺腺癌细胞株A549常规培养于含iOM胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于5%0)2、37°C饱和湿度的孵箱中培养，用O.25%的胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的A549细胞，转染前24h将细胞接种于6孔培养板，接种密度为lX105/孔，使得次日转染时细胞融合度达30%50%。根据Lipofectamine"2000试剂操作指南进行转染，设空白对照组、阴性对照转染组(NotargetsiRNA)、EGFRsiRNAl转染组、EGFRsiRNA2转染组、EGFRsiRNA3转染组。转染方案为在250uLOPTI-MEM中加入5yL20wM的siRM，室温孵育5min。在250liL0PTI-MEM中加入5iiLLipofectamine2000，室温孵育5rain。将上述两种稀释液混匀，室温孵育20min后加入细胞板孔中，细胞置于培养箱常规培养。收集转染后48h的6孔板细胞，PBS洗两遍，每份加160yLTNE裂解液，提取细胞总蛋白，再加入40uL5XSDSloadingbuffer。各组分别取总蛋白25ug，经8XSDS-PAGE电泳后转膜。加5%的脱脂牛奶封闭液封闭过夜。与特异性一抗(兔抗人EGFR多克隆抗体，兔抗人13-Actin多克隆抗体)室温孵育2h，TBST洗膜三次，每次10min。与二抗(碱性磷酸酶标记的山羊抗兔丄gG)，室温孵育lh，TBST洗膜三次，按1:2的比例加入底物BCIP和NBT进行显色，扫描图片。结果见图2。不同处理组中的P-Actin条带亮度几乎无差异，说明总蛋白量基本一致，NotargetsiRNA转染组和空白对照组的EGFR蛋白表达有明显条带，而转染了EGFRsiRNAl、EGFRsiRNA2、EGFRsiRNA3的细胞几乎检测不到EGFR蛋白的表达，实验结果进一歩证实了EGFRsiRNA在蛋白水平对靶基因表达的抑制及作用的特异性。实施例四MTT法分析转染EGFRsiRNAl对A549细胞增殖的影响。人肺腺癌细胞株A549本实验室保存，常规培养于含10W胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于5%(]02、37。C饱和湿度的孵箱中培养，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的A549细胞，以每孔4乂103细胞接种于96孔板中，使得次日转染时细胞融合度达30%50%。根据LipofectamineTM2000试剂操作指南进行转染，设宇白对照组、阴性对照转染组(NotargetsiRNA)和EGFRsiRNAl转染组，每组设3个复空。转染方案为在25yL0PTI-MEM中加入O.25pL20uM的siRNA，室温孵育5min。在25uL0PTI-MEM中加入O.25tiLLipofectamine2000，室温孵育5min。将上述两种稀释液混匀，室温孵育20min后加入细胞板孔中，细胞置于培养箱常规培养。48h后吸出培养基，每孔加入80yL新鲜培养基，同时每孔加入新配制的5mg/mlMTT液20uL，于37。C、5%002饱和湿度下培养。4h后吸出培养液，每孔加入150uLDMSO，于振荡器上震荡10min。置酶标仪570，处测定吸光度值(A值)。取3孔平均值，比较EGFRsiRNAl转染组与NotargetsiRNA转染组A值的差异，计算细胞增殖抑制率。抑制率(％)=(1—实验孔A值/对照孔A值)X100%。结果见图3。与NotargetsiRM转染组比较，EGFRsiRNAl转染组细胞生长受到明显抑制。其抑制率为50%左右。由于转染试剂Lipofectamin^2000有一定毒性，所以空白对照组的细胞数明显多于NotargetsiRNA转染组。实施例五AnnexinV—FITC/PI双染法分析转染EGFRsiRMl对A549细胞凋亡率的影响。人肺腺癌细胞株A549常规培养于含10X胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于5%0)2、37°C饱和湿度的孵箱中培养，用O.25%的胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的A549细胞，转染前24h将细胞接种于6孔培养板，接种密度为1X10V孔，使得次日转染时细胞融合度达30%50%。根据Lipofectamine'M2000试剂操作指南进行转染，设空白对照组、阴性对照转染组(NotargetsiRNA)和EGFRsiRNAl转染组。转染方案为在250uL0PTI-MEM中加入5uL20uM的si腿，室温孵育5min。在250uL0PTI-MEM中加入5yLLipofectamine2000，室温孵育5min。将上述两种稀释液混匀，室温孵育20min后加入细胞板孔中，细胞置于培养箱常规培养。转染48h后吸出各孔培养液，消化收集各孔细胞。按ArmexinV-FITC/PI检测试剂盒操作指南..用流式细胞仪检测细胞凋亡。比较EGFRsiRNAl转染组与NotargetsiRNA转染组的细胞凋亡率差异。结果见图4。空白对照组的细胞凋亡率为4.93%，NotargetsiRNA转染组的细胞凋亡率为4.25%，EGFR1siRNAl转染组的细胞凋亡率为22.98%。与NotargetsiRNA转染组比较，EGFRsiRNAl转染组的细胞率明显增加，空白对照组与NotargetsiRNA转染组之间比较无明显差异。实施例六EGFRsiRNAl靶向抑制EGFR基因后对裸鼠肺癌皮下移植瘤生长的作用研究。稳定表达荧光素酶报告基因的人肺腺癌细胞A549-luc本实验室保存，常规培养于含10%胎牛血清、6(XHig/mLG418的RPMI1640培养液中，置于5訓2、37。C饱和湿度的孵箱中培养，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。BALB/c裸鼠，45周龄，体重20g左右，雌性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于高度洁净的SPF环境下。取对数生长期A549-luc细胞，用0.25%胰酶消化收集细胞，以1000r/min离心5min，弃上清液，PBS稀释细胞，血球计数仪计数细胞，用PBS调整细胞浓度至1.5X1(T/mL。取上述备好的A549-luc^细胞悬液0.2mL，用微量注射器注射至裸鼠右背侧近腋部皮下。动物接种数12只。A549-luc细胞接种5天后，每只裸鼠腹腔注射150uL30mg/mL荧光素酶底物，底物注射1025min后采用美国精诺真活体成像系统(IVIS200)，进行活体成像，并定量检测肿瘤接种部位的荧光值大小，根据荧光值大小将动物均匀分为3组，每组3只，分别为①溶剂对照组:瘤体内多点注射70uL5%葡萄糖溶液；②NotargctsiRNA对照组瘤体内多点注射jetPEI/NotargetsiRNA复合物(15ugNotargetsiRNA，2.4uLjetPEI);③EGFRsiRNA治疗组瘤体内多点注射jetPEI/EGFRsiRNA复合物(15ugEGFRsiRNAl,2.4yLjetPEI)，均每两天给药一次。每4天采用活体成像系统进行活体成像，并定量分析比较各时间点各组的荧光值，待肿瘤出现表面坏死时，停止活体成像。以肿瘤接种天数为横坐标，肿瘤接种部位单位面积荧光值为纵坐标，绘制各组肿瘤皮下生长曲线。结果见图5。给药后0-12天之内，各组肿瘤萤光值均呈进行性增加，但与溶剂对照组和NotargetsiRNA对照组相比，EGFRsiRNA治疗组肿瘤荧光值增加缓慢，说明EGFRsiRNA治疗组肿瘤生长明显慢于NotargetsiRNA对照组和溶剂对照组。其中，A:0天(第一次处理前)；B:4大；C:8天；D:12天.本发明将上述针对EGFRmRNA编码区不同位置的3条EGFRsiRNA序列(SEQ:7-12)和一条阴性对照siRNA(NotargetsiRNA)分别导入肺癌细胞株A549，结果显示，与导入阴性对照siRNA相比，A549细胞中EGFR的mRNA和蛋白的表达量明显降低。虽然针对同一靶基因，但位置不同，效果不同。本发明从EGFR的mRNA和蛋白的表达得到的结果是一致的，3条EGFRsiRNA序列均能明显抑制A549细胞中EGFR基因mRNA和蛋白的表达，其中EGFRsiRNAl的效果较EGFRsiRNA2禾QEGFRsiRNA3稍好。然后，我们采用MTT法和AnnexinV-FITC/PI双染法，从体外培养细胞水平，检测了EGFRsiRNAl特异诱导EGFR基因抑制后，对A549细胞的增殖和凋亡的影响。结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，EGFRsiRNAl处理组的细胞凋亡率明显增加，而细胞增殖活性受到明显抑制。最后，利用本实验室保存的稳定表达荧光素酶报告基因的人肺腺癌细胞株A549-luc建立裸鼠皮下移植瘤模型，采用活体动物体内光学成像系统实时检测移植瘤的生长情况，通过比较空白对照组、NotargetsiRNA阴性对照组和EGFRsiRNAl治疗组之间的移植瘤荧光值，来反映移植瘤大小的差异。结果显示，EGFRsiRNAl治疗组移植瘤荧光值比空白对照组和NotargetsiRNA对照组增加缓慢，移植瘤的生长速度也较空白对照组和NotargetsiRNA对照组明显变慢，说明千扰EGFR基因表达对肺癌皮下移植瘤的生长具有明显的抑制作用。实施例七27个碱基的siRNA分子对EGFRmRNA表达的抑制效果。表3设计的EGFRsiRNA及阴性对照NotargetsiRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>EGFR2849-2873GCUGGAUGAUAGACGCAGAUAGUCGACUAUCUGCGUCUAUCAUCC5，6si扁-27CGdTdTAGCdTdT人肺腺癌细胞株A549常规培养于含10X胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于5WC02、37'C饱和湿度的孵箱中培养，用O.25%的胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的A549细胞，转染前24h将细胞接种于6孔培养板，接种密度为lX105/孔，使得次日转染时细胞融合度达30%50%。根据Lipofectemine"2000试剂操作指南进行转染，设空白对照组、阴性对照转染组(NotargetsiRNA)、21bpEGFRsiRNA转染组、21bpEGFR化学修饰siRNA转染组、27bpEGFRsiRNA转染组。转染方案为在250uL0PTI-MEM中加入5uL20uM的siRNA，室温孵育5min。在250yL0PTI-MEM中加入5uLLipofectam丄ne'"2000，室温孵育5min。将上述两种稀释液混匀，室温孵育20min后加入细胞板孔中，细胞置于培养箱常规培养。收集转染后24-48h的细胞，6孔板每孔加入lmLTrizo1，加入氯仿和异丙醇按常规方法抽提细胞总RNA，所提RNA溶于40nL无RNA酶水中，紫外分光光度计检测各处理组RNA的含量和纯度，并进行凝胶电泳，观察RNA完整性。以oligo(dT),5为引物，lygRNA为模板，按卩romega逆转录试剂盒操作生成cDNA。各取逆转录的cDNA产物l.6liL做模板，利用SY服GreenI染料实时定量PCR试剂盒检测不同转染组细胞中的EGFRmRNA表达，并以无RNA酶水作为阴性模板对照，以P-Actin作为内参。引物序列根据GenBank公布的cDNA序列设计(与实施例2相问)，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件为:95。C预变性10s;94。C变性5s;退火30s;72。C延伸ls;45个循环。用2—A^法计算和分析EGFR基因的相对表达量，确定EGFR基因的mRNA被siRNA沉默的程度。结果见图7。实验分五组EGFRsiRNAl21bp未进行化学修饰组，EGFRsiRNAl21bp—种化学修饰组，EGFRsi腿527bp(EGFRsiRNA4、6的结果示意图效果与EGFRsi腿527bp相同，省略)未修饰组，NotargetsiRNA组，空白对照组。结果显示，与NotargetsiRNA组相比，21bp修饰组及27bp未修饰组的沉默效果也很好。实施例八经过化学修饰的siRNA分子对EGFRmRNA表达的抑制效果。对EGFRsiRNAl21bp，即SEQ6-7_进行两种修饰①有dTdT悬垂，正反义链3'、5'末端的三个碱基甲基化，反义链的5'末端磷酸化；②无悬垂，正义链所有碱基2'甲基化，反义链5'端磷酸化.人肺腺癌细胞株A549常规培养于含10X胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于5%0)2、37°C饱和湿度的孵箱中培养，用O.25%的胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的A549细胞，转染前24h将细胞接种于6孔培养板，接种密度为lX10&/孔，使得次日转染时细胞融合度达30%50%。根据LipofectamineT"2000试剂操作指南进行转染，设空白对照组、阴性对照转染组(NotargetsiRNA)、2丄bpEGFRsiRNAl转染组、21bpEGFRl化学修饰①siRM转染组、27bpEGFRsiRNA4转染组、21bpEGFR化学修饰②siRM转染组。转染方案为在250wL0PTI-MEM中加入5yL20iiM的siRM，室温孵育5min。在250uL0PTI-MEM中加入511LLipofectamine2000,室温孵育5min。将上述两种稀释液混匀，室温辨育20min后加入细胞板孔中，细胞置于培养箱常规培养。收集转染后24-48h的细胞，6孔板每孔加入lmLTrizo1，加入氯仿和异丙醇按常规方法抽提细胞总RNA，所提RNA溶于40yL无RNA酶水中，紫外分光光度计检测各处理组RNA的含量和纯度，并进行凝胶电泳，观察RNA完整性。以oligo(dTL为引物，lugRNA为模板，按Pr匿ga逆转录试剂盒操作生成cDNA。各取逆转录的cDNA产物l.6ixL做模板，利用SYBRGreenI染料实时定量PCR试剂盒检测不同转染组细胞中的EGFRmRNA表达，并以无RNA酶水作为阴性模板对照，以P-Actin作为内参。引物序列根据GenBank公布的cDNA序列设计(与实施例2相同)，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件为:95'C预变性10s;94'C变性5s;退火30s;72'C延伸ls;45个循环。用2—A^法计算和分析EGFR基因的相对表达量，确定EGFR基因的mRNA被siRNA沉默的程度。结果见图8。图注实验分五组EGFRsiRNAl21bp未进行化学修饰组，EGFRsiRNAl21bp第一种化学修饰组，EGFRsiRNA427bp未修饰组，EGFRsiRNAl21bp第二种化学修饰组，NotargetsiRNA组。结果显示，与NotargetsiRNA组相比，21bp两种修饰组及27bp未修饰组的沉默效果很好。系列表<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院〈120〉抑制表皮生长因子受体基因表达的siRNA及其应用〈160〉14〈170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>25212>腿<213>人工序列〈400〉1ggcugguuauguccucauugcccuc25<210>2,〈211>25<212〉腿<213〉人工序列〈400〉2g3gggC33Ug3gg3C3U33CC8gCC25〈210〉3<211〉25〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉3caagcaacauggucaguuuucucuu25<210〉4〈211〉25〈212〉腿<213〉人工序列〈400〉4aagagaaaacugaccauguugcuug25〈210〉5〈211〉25<212>脂A〈213〉人工序列〈400〉5gcuggaugauagacgcagauagucg25<210〉6〈211〉25〈212〉画〈213〉人工序列〈400〉6cgacuaucugcgucuaucauccagc25〈210〉7〈211〉19<212〉腿〈213>人工序列〈400>7ggcugguuauguccucaxiu1〈210〉8<211〉19〈212〉腿<213〉人工序列<400〉8〈210〉9〈211〉19〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉9caagcaacauggucaguuu19〈210>10〈211〉19〈212>腿<213〉人工序列〈400〉10aaacugaccauguugcuug〈210〉11<211>19<212>脂A〈213〉人工序列<400>11gcuggaugauagacgcaga<210〉12〈211>19〈212〉腿〈213〉人工序列<400〉12ucugcgucusucauccagc〈210〉13〈211〉19<212>腿〈213〉人工序列〈400〉13uucuccgascgugucacgu<210>14〈211〉19<212>腿〈213〉人工序列〈400〉14acgugacacguucggagaa191919权利要求1.一种抑制EGFR基因表达的siRNA，其特征是，其核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任一种正义链5’-GGCUGGUUAUGUCCUCAUUGCCCUC-3’，反义链5’-GAGGGCAAUGAGGACAUAACCAGCC-3’；正义链5’-CAAGCAACAUGGUCAGUUUUCUCUU-3’，反义链5’-AAGAGAAAACUGACCAUGUUGCUUG-3’；正义链5’-GCUGGAUGAUAGACGCAGAUAGUCG-3’，反义链5’-CGACUAUCUGCGUCUAUCAUCCAGC-3’；或上述三对核苷酸序列的任一对正义链的3’末端、反义链中5’末端对应缺失1-6个碱基的双链RNA分子。2.根据权利要求l所述抑制EGFR基因表达的si脂A，其特征是，其为以下双链RNA分子中的任一种正义链5'-GGCUGGUUAUGUCCUCAUU-3''反义链5'-AAUGAGGACAUAACCAGCC-3';正义链5，-CAAGCAACAUGGUCAGUUU-3'，反义链5'-AAACUGACCAUGUUGCUUG-3';正义链5'-GCUGGAUGAMGACGCAGA-3'，反义链5'-UCUGCGUCUAUCAUCCAGC-3'。3.根据权利要求l一2任一项所述抑制EGFR基因表达的siRNA，其特征是，所述双链RNA分子的3'末端还设有以两个脱氧核苷的组合的悬挂碱基。4.根据权利要求3所述抑制EGFR基因表达的siRNA，其特征是，其为正义链5'-GGCUGGUUAUGUCCUCAUUdTdT-3'，反义链5'-AAUGAGGACAUAACCAGCCdTdT-3'的双链RNA分子。5.根据权利要求l或2所述抑制EGFR基因表达的siRNA，其特征是，所述的siRNA为任意部分经化学修饰的双链RNA分子。6.根据权利要求5所述抑制EGFR基因表达的siRNA，其特征是，所述化学修饰包括对连接核苷酸的磷酸二酯键的部分修饰或用其它任何化学基团取代。7.根据权利要求5所述抑制EGFR基因表达的siRNA，其特征是，化学修饰为在siRNA分子核酸戊糖的2，位上的OH作化学的修饰和改变.8.根据权利要求7所述抑制EGFR基因表达的siRNA，其特征是，所述2'位上的OH化学修饰的基团为Cfta,F—'CH30CH2CH20—，CH3NHCH2CH20—。9.如权利要求1—8任一项所述抑制EGFR基因表达的siRNA在制备预防或治疗人类表皮生长因子受体相关的疾病的药物或制剂中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征是，所述疾病为肺癌、肝癌、食管癌、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔上皮癌、卵巢癌、头颈癌、脑瘤、胶质细胞瘤的任一种或多种。全文摘要本发明公开了一种抑制EGFR基因表达的siRNA，其核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任一种正义链5’-GGCUGGUUAUGUCCUCAUUGCCCUC-3’，反义链5’-GAGGGCAAUGAGGACAUAACCAGCC-3’；正义链5’-CAAGCAACAUGGUCAGUUUUCUCUU-3’，反义链5’-AAGAGAAAACUGACCAUGUUGCUUG-3’；正义链5’-GCUGGAUGAUAGACGCAGAUAGUCG-3’，反义链5’-CGACUAUCUGCGUCUAUCAUCCAGC-3’；或上述三对核苷酸序列的任一对正义链的3’末端、反义链中5’末端对应缺失1-6个碱基的双链RNA分子。本发明所述抑制EGFR基因表达的siRNA为制备预防或治疗人类表皮生长因子受体相关的疾病的药物或制剂提供了新的，较好的选择。文档编号A61P35/00GK101353656SQ20081002971公开日2009年1月28日申请日期2008年7月24日优先权日2008年7月24日发明者张必良,艳李申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院