抑制人dmt1蛋白的rna、重组体及应用的制作方法

专利名称：：抑制人dmt1蛋白的rna、重组体及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学、生物医药及基因工程
技术领域：
，具体涉及利用逆转录病毒(Retrovirus)介导的RNA干扰技术，构建针对人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1，DMT1)基因的逆转录病毒干扰体系Retro-DMTli，并将其运用到铁代谢相关疾病的药物开发制备当中。
背景技术：
：RNAi指的是当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。RNA干扰过程主要有2个步骤(1)长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的核酸酶切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。(2)小干扰性RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),该复合体可识别与小干扰性RNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。1998年，安德鲁々去厄(AndrewZ.Fire)等在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正链或反链RNA显示出了更强的抑制效果(Fireetal.,1998)。从与靶mRNA的摩尔比考虑，加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制效果，因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。随后，又相继发现具有RNaseIII活性的Dicer可将长的双链RNA加工成称之为siRNA(smallinterferingRNA)的2123nt及3'端突出的短的双链RNA，siRNA与若干个蛋白组成称之为RISC复合物(RNA-inducedsilencingcomplex)的RNA蛋白复合物，并由该复合物主导RNAi效应。2001年，Tuschl等将短的siRNA导入到哺乳动物细胞中并由此解决了在哺乳细胞内导入长的双链RNA时引发的干扰素效应，由此拓展了RNAi在基因治疗上应用前景。RNAi机制普遍存在于生物种中，因此被认为是进化上相对保守的基因表达调控机制。一种假说为，RNAi机制是作为在RNA水平上抵御病毒入侵的防御机制而存在的。目前发现，RNAi机制中的相关一些因子如内源性双链RNA及蛋白因子可以在多种层次上对基因表达进行调控，其范围已经超越了PTGS(posttranscriptionalgenesilencing),如RNAi机帝lJ同样参与了转录水平上的基因表达调控过程中。2006年，安德鲁，法厄与克雷格，梅洛(CmigC.Mdlo)由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。由外界导入的长的双链RNA首先被称作Dicer并具有RNaseIII活性的RNA酶切割成21~23碱基对的小的双链RNA，这种RNA被称作smallinterferingRNA(siRNA)，其特征是3'端相对于互补链突出两个碱基。完成上述过程后，siRNA上结合RNAi蛋白因子，并形成称为RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)的RNA-蛋白复合物。在RISC复合物中，siRNA依赖于ATP/或ATP非依赖性的转换为单链，进而RISC被活化。活化型RISC受已成单链的siRNA引导(guidestrand),序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。在果蝇(Drosophilamelanogaster)RISC中，已知存在着称为Argonaute2(AG02)的因子，AG02蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AG02是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性(sliceractivity),RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶(RNAhelicase)也被鉴定为参与RNAi机制的因子。在秀丽隐杆线虫(C.elegans)的RNAi中必须的因子有EGOl，这是一种RdRP(RNA-dependentRNAPolymerase),植物屮也存在该蛋白同系物。RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA(或siRNA)作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异。RNAi在基因沉默方面的具有高效性和简单性，所以是基因功能研究的重要工具。大多数药物属于靶标基因(或疾病基因)的抑制剂，因此RNAi模拟了药物的作用，这功能丢失(LOF)的研究方法比传统的功能获得(GOF)方法更具优势。因此,RNAi在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具。同时，那些在耙标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为RNAi药物。在药物靶标发现和确认方面，RNAi技术已获得了广泛的应用。生物技术公司或制药公司通常利用建立好的RNAi文库来引入细胞，然后通过观察细胞的表型变化来发现具有功能的基因。如可通过RNAi文库介导的肿瘤细胞生长来发现能抑制肿瘤的基因。一旦所发现的基因属于可用药的靶标(如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌出细胞外)，就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选。此外，被发现的靶标还可用RNAi技术在细胞水平或动物体内进一步确认。在疾病治疗方面，双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗，如老年视黄斑退化。然而要将RNA干扰技术运用于临床治疗，需要解决RNA干扰片段表达持续以及表达效率等重要问题。shRNA即短发夹RNA(shorthairpinRNA)。在RNAi感染过程中，产生dsRNA的一个有效方法就是在体内表达一个短发夹RNA，这种shRNA包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补)，中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。在体内shRNA可以被加工成siRNA，从而降解目的基因抑制其表达。人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1，DMT1)在人体组织分布十分广泛。RNA印迹分析显示DMT1在近端小肠表达最高,在肾、胸腺和脑有中等度的表达，而在睾丸、肝、结肠、心脏、脾、骨骼肌、肺、骨髓的含量相对较低。在细胞水平，DMT1特异地表达于某些细胞.在小肠，DMT1仅表达于小肠绒毛的肠上皮细胞，尤其在隐窝和绒毛较低部位含量最高，并从近端到远端表达呈逐渐减低，这种表达方式与小肠铁吸收的解剖位置一致。在脑内，DMT1主要发现在神经元上.然而，大多数的神经元表达DMT1的水平相对较低。原位杂交确定DMT1mRNA在不同组织定位的研究显示，DMT1mRNA存在于神经元及脉络丛上皮细胞，而同区的胶质细胞和室管膜细胞却不表达。在密集排列的细胞群，如海马锥体和颗粒细胞、小脑颗粒细胞、视上核和梨状皮层的锥体细胞,DMTlmRNA的表达相对较显著。在黑质,DMTlmRNA表达中等，在嗅核前部腹侧区，则含有大量的DMTlmRNA。DMTl有高度的疏水性，其氨基端和羧基端都嵌入胞桨内。第四跨膜区是其重要的功能区，如发生突变，将会严重干扰DMT1的正常功能。人类DMT1的基因组成已比较清楚.它包括17个外显子，由36kb核苷酸组成。DMT1mRNA存在两种形式，即"+IRE"和"-IRE"型。"+IRE"型的3'非翻译区含有与运铁蛋白受体(transferrinreceptor,TfR)mRNA的3'非翻译区相似的铁调节元件(ironregulatoryelement,IRE)。"-IRE"型则不包含有IRE结构."+IRE"型和"-IRE"型DMT1编码分别为561个和568个氨基酸(一)DMT1在外周的功能DMT1是哺乳动物细胞摄取二价铁的主要蛋白。近端小肠(十—指肠和空肠)是铁吸收的主要部位。铁在小肠的吸收通过两个转运过程，即粘膜吸收过程(铁进入肠吸收上皮细胞)和粘膜转运过程(铁从肠上皮细胞的基底侧转运入血液循环)。其中粘膜吸收过程被认为是机体维持铁平衡的最关键一步，但其机制一直不明。DMT1在小肠上皮细胞上的发现，才使这一问题的研究有了重大突破。现在知道，肠腔内铁主要是以二价的形式经小肠上皮细胞膜上的DMT1介导，由肠腔进入上皮细胞内。然后，再经新近发现的Ferroportin1介导由细胞内进入血液循环。DMT1介导的二价铁离子的转运是H+依赖的主动转运过程。在患有严重缺铁性贫血(microcyticanemia,mk)的小鼠和Begrade大鼠都存在相同的DMT1基因G185R位点的突变。他们均表现为小肠铁吸收障碍导致的铁严重缺乏的小细胞、低色素性贫血.此外，实验显示，机体的铁状态与小肠DMT1的表达紧密相关.当铁缺乏时，十二指肠细胞上DMT1的表达增加，而在高铁状态鼠的小肠,DMT1表达则明显下降。这些结果均显示DMT1是介导小肠铁吸收的重要转运蛋白。(二)DMT1在中枢神经系统中的作用用位点克隆方法发现mk小鼠和Begrade大鼠都有DMTl的基因突变，原有甘氨酸(G185R)被精氨酸替代。因此DMTl的基因突变被认为是导致mk小鼠和Begrade大鼠的铁吸收障碍，以及Begrade大鼠细胞内铁释放利用障碍的原因。遗传性血色素沉积症(hereditaryhemochromatosis,HH)是盛行于北欧的一种常染色体隐性遗传病.它的特征是铁广泛沉积在体内多个组织,如肝脏、心脏等，导致这些组织的纤维变性、坏死，最终因器官的衰竭而死亡。现已清楚，这种疾病重要原因之一是由一种HFE(hemochromatosisgene)突变(C282Y)所引起.最近的研究显示HH病人的十二指肠DMT1mRNA表达明显增加.在HFE基因敲除的小鼠，DMT1表达显著高于对照.在不存在HFE基因突变的HH的散发病例中，DMT1的表达也有增加。因此认为在HH病人小肠DMT1的表达异常增加可导致铁过度吸收，造成铁在组织细胞发生沉积。大脑需要铁，脑铁缺乏可以导致脑发育不良和智力障碍。然而铁在脑内过多沉积则可引发一系列病理反应，进而损害神经细胞，最终导致各种脑疾病发生，如各种神经退行性疾病(NDs),包括帕金森氏综合症(PD),阿尔茨默综合症等等。新近研究显示脑铁异常增高的原因可能是由於某些脑内铁转运蛋白表达失控。DMT1表达失控引起的脑内铁代谢紊乱可能也与某些NDs发生发展有关。DMT1分布在脑内的许多区域。含铁丰富的黑质冇较高的DMT1存在，需要大量铁供给生长的细胞中DMT1也有高密度表达。脑内也存在两种形式的DMT1mRNA."+IRE"与"-IRE"型的比率高於除小肠以外的其他组织.Roth等用大鼠的PC12细胞研究了这两种形式在神经细胞的分布和功能。结果发现"+IRE"型DMT1主要分布在细胞表面，树突或轴突的运输小泡以及细胞内含Tf游离铁的内吞小体上."-IRE"型则主要分布在细胞核。这一发现显示"+IRE"可能主要发挥细胞摄取铁和胞内转运铁的功能，而"-IRE"型可能起有俘获核内二价金属并转运二价金属进入细胞核以及传递信号到细胞核和保持核内金属离子稳态的作用。已有报道在PD病人脑内黑质神经元DMT1有过高表达。而以往的病理研究显示黑质是PD病人铁异常过度沉积区域.因此一些研究者推测DMT1表达失控可能是引发某些NDs脑内铁过多沉积的众多原因之一。
发明内容本发明的目的就是针对现有技术的上述问题，提供-一种能够有效抑制体内人二价金属离子转运蛋白表达、从而调节体内铁水平的RNA。本发明的另一目的在于提供编码上述RNA的DNA。本发明的再一目的在于提供具有优良的靶向性、安全性以及持续表达上述RNA、进而抑制人二价金属离子转运蛋白(DMT1)表达的重组体。本发明的再一目的在于提供上述RNA、DNA以及重组体在制备药物方面的应用。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种人二价金属离子转运蛋白(DMT1)表达的RNA，所述RNA含有以下序列SeqIDNo,1:5，-CUACCUGGAUCCAGGAAAU-3'在本发明的具体实施方式中，所述RNA为含有以下双链结构的siRNA:5，-CUACCUGGAUCCAGGAAAU-3'3，-GAUGGACCUAGGUCCUUUA-5'优选地，所述siRNA具有以下结构5，-CUACCUGGAUCCAGGAAAU口CD-3'3，-口口GAUGGACCUAGGUCCUUUA-5'其中口口为3'端的两个突出碱基，可以为AA或UU，或本领域技术人员所熟知的其他形式。或者，在本发明另外的实施方式中，所述RNA为同时含有SeqIDNo.1以及SeqIDNo.l的反向重复序列的短发夹RNA(shRNA)。所述shRNA优选含有以下序列S叫IDNo.2:CAGGUAG-3'本发明还公开了编码所述RNA的DNA。优选的，所述DNA含有序列表中SeqIDNo.3和/或SeqIDNo.4所示的序列。本发明还公开了一种人二价金属离子转运蛋白的重组体，所述重组体含有上述的DNA以及基因转移载体。所述基因转移载体优选为病毒性载体，更优选为逆转录病毒载体。本发明进一步公开了上述RNA、上述DNA以及上述重组体在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。所述铁代谢紊乱疾病是指血清铁水平高而导致的铁代谢紊乱疾病，或者是指人DMT1过量表达而导致的铁代谢紊乱疾病。由于采用了以上技术方案，使本发明具备了以下有益效果本发明的RNA，特别是siRNA及shRNA，以及编码shRNA的DNA以及重组慢病毒能够有效抑制体内人二价金属离子转运蛋白表达、抑制铁的吸收与代谢，并降低体内的血清铁水平，从而达到治疗铁代谢相关疾病的目的。本发明设计的shRNA经过体内以及体外实验证明，能有效的抑制DMT1的表达，有效的调节血清铁的水平。图1是本发明所用的Retrovirus逆转录病毒载体的多克隆位点图；图2是Retro-DMTli系统感染体细胞后，DMT1蛋白的表达情况图；图3是通过高铁饲料词养SD大鼠，构建高血清铁动物模型，然后利用Retrovirus-DMTli系统进行体内实验，降低血清铁水平结果图。具体实施例方式本发明利用铁代谢相关疾病的发病机理，有针对性的调节DMT1的表达，设计特定的小干扰性RNA以及编码shRNA的DNA，从而降低血清铁对于细胞的损害。本发明的小干扰性RNA以及DNA所编码的shRNA，能特异性的识别序列CTACCTGGATCCAGGAAAT，该序列位于DMT1(NM_000617.1)第249-267碱基处。要将RNA干扰技术运用于临床治疗，就需要解决RNA干扰片段表达持续以及表达效率等重要问题。我们利用失活逆转录病毒载体携带RNA干扰片段的DNA模板，其在体内转录成shRNA，完美的解决了RNA干扰基因治疗的靶向性、安全性以及表达持续性的问题。本发明采用逆转录病毒作为基因转移载体，逆转录病毒载体具有广泛的宿主细胞以及高的转导效率和持续且可控制的基因表达等特点，是一种非常适合用于生物药品开发的优良基因转移载体。通常而言，基因转移载体可分两大类病毒性载体和非病毒性载体。非病毒性载体的方法包括裸DNA注射、基因枪法、多聚赖氨酸或阳离子脂质体包裹DNA法等。一般非病毒性载体毒性成分少，且较安全。但它们存在共同的弱点效率低且携带基因表达时间短。所以目前研究仍是一些病毒性载体，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等。逆转录病毒应用最早，研究也相当成熟，目前仍被广泛应用。逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的上佳选择。最重要的一点是它可以有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。而另几种整合载体——例如腺相关病毒，以同源重组的方式整合，整合过程中病毒基因组发生重排，可能会影响到外源基因的结构与功能。因此，如果能实现有效的基因转移，基因治疗在对付遗传性疾病、减缓肿瘤发展、战胜病毒性感染和终止神经系统退行性病变等方面都会有广阔的应用前景。本发明通过合成干扰片段，.将片段连接至Retrovirus逆转录病毒载体当中。转染重组体入Phoenix细胞，获取病毒上清，体外以及体内实验证明能够有效抑制DMT1。在本发明优选的实施方式中，构建了人二价金属离子转运蛋白(DMT1)的逆转录病毒干扰体系(Retro-DMTli)，并取得了良好的抑制效果。下面通过具体的实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例l根据人二价金属离子转运蛋白(DMT1)序列(NM—000617.1)，设计模板链与编码链。分别于5'端加上BglII与Xhol酶切位点，送Invitrogen公司合成序列。经过筛选，获得干扰效果最为显著的本发明的DMT1干扰片断序列如下模板链(S叫IDNo.3):5，-GATCCCCCTACCTGGATCCAGGAAATTTCAAGAGAATTTCCTGGATCCAGGTAGTTTTTTA-3,编码链(SeqlDNo.4):5，-AGCTTAAAAACTACCTGGATCCAGGAAATTCTCTTGAAATTTCCTGGATCCAGGTAGGGG-3,实施例2Retro-DMTli系统构建一、将合成的DMT1干扰片段(SeqlDNo.3及SeqlDNo.4)进行退火。具体步骤如下1.建立退火系统5ul10x退火buffer2nmole模板链SeqIDNo.32nmole编码链SeqIDNo.4用三蒸水补足至50ul。2.放入PCR仪，95°C5分钟，75°C5分钟，55°C5分钟，42°C5分钟，37°C15分钟，之后逐步递减温度至室温。3.制12%1xTAE聚丙烯酰胺胶，取10ul上述退火产物跑胶200Vlh。银染观察退火条带。置于-8(TC保存退火产物。三、酶切(XbaI与XhoI)逆转录病毒载体(图l所示)，胶纯化回收后，用T4连接酶与退火产物室温连接24小时，经转化筛选之后，获得正确克隆。送Invitrogen公司测序鉴定，命名为Retro-DMTli系统。具体操作步骤如下1.构建质粒酶切体系BglII而Xhol歸10xBuffer5ulBSA0.5ulpSUPER.Retro质茅立10ul用水补足50ul，37°C，2h。3.利用试剂盒(iiwitrogen)胶纯化上述酶切产物。4.构建连接系统10xBuffer2ulT4连接酶lulRetro酶切产物lul退火产物5ul用水补足20ul，16°C，16h。4.取5ul连接产物转化感受态细胞，涂板后，氨苄青霉素筛选。5.挑取阳性克隆，小量扩增质粒。6.用EcoRI与XhoI酶切鉴定质粒，选择阳性结果质粒，测序保存。实施例3重组逆转录病毒Retro-DMTli的生产流程1、接种Phoenix细胞1.5乂107个细胞于9cm培养皿(Corning)中，37°C,5。/。C02培养过夜；2、转染前20分钟换新鲜培养基；3、取20ul上述Retro-DMTli与DMEM培养基500ul混匀，标记为A管，另取20ul脂质体与500ulDMEM培养基混匀，标记为B管。将A管与B管混匀，室温放置30min，将混合物轻轻加入第1歩中的9cm培养皿的培养基中，培养过夜；5、24小时后加7.5ml培养基继续培养48小时；6、收集细胞上清并用0.45um滤器过滤，细胞可以扩大培养，持续收取病毒上清。7、测定病毒上清滴度，用PH8.0Tris-HCl调整细胞滴度至1000VP/ml。8、包装入2ml西林瓶中(每瓶含lml)，保存于-8(TC。9、对病毒进行热源检测、微生物检测，确保无热源，无细菌、真菌、野生病毒污染。实施例4重组逆转录病毒Retro-DMTli体外实验复苏神经元细胞株P12，接种于6孔板，每孔1X106个。取Retro-DMTli慢病毒液，按照每毫升培养基加lul病毒液(1000VP/ml)的比例加入P12细胞培养基中，轻轻左右混匀，以充分感染细胞株，分别处理0h、6h、12h、24h、48h，收集细胞，利用real-timePCR技术进行定量测定DMT1mRNA表达情况，以0h为对照组，可见DMT1的表达在12h之后受到明显的抑制。如图2。实施例5重组逆转录病毒Retro-DMTli体内实验选择3月龄SD大鼠雄雌各10只，按性别随机分为两组，两组实验鼠均以高铁饲料(购自SIGMA)喂养3个月，构建高血清铁大鼠模型，并测定血清铁浓度。之后，实验组注射retro-DMTli病毒液，每次剂量为500ul病毒液(1000VP/ml)，每3天注射一次，3次为一疗程；对照组注射PBS等渗盐水；一疗程结束后，分别于3、6、9、12、15、18天抽取血清，按常规方法利用血清生化仪测定血清铁浓度。结果发现，从第6天开始，病毒组血清铁浓度开始下降，12天达到正常血清铁水平。如图3。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一歩详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>〈400〉3gatccccctacctggatccaggaaatttcaagagaatttcctggatccaggtagtttttt6061〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉460DNA人工序列〈400>4agcttaaaaactacctggatccaggaaattctcttgaaatttcctggatccaggtagggg60权利要求1、一种抑制人二价金属离子转运蛋白(DMT1)表达的RNA，其特征在于所述RNA含有以下序列SeqIDNo.15’-CUACCUGGAUCCAGGAAAU-3’。2、根据权利要求1所述的RNA，其特征在于所述RNA为含有以下双链结构的siRNA:5，-CUACCUGGAUCCAGGAAAU-3'3，-GAUGGACCUAGGUCCUUUA陽5'。3、根据权利要求1所述的RNA，其特征在于所述RNA为同时含有SeqIDNo.l及其反向重复序列的shRNA。4、根据权利要求3所述的RNA，其特征在于，所述shRNA含有以下序列SeqIDNo.2:CAGGUAG-3，。5、编码权利要求14任意一项所述RNA的DNA。6、根据权利要求5所述的DNA，其特征在于所述DNA含有序列表中SeqIDNo.3禾口/或SeqIDNo.4所示的序列。7、一种抑制人二价金属离子转运蛋白表达的重组体，其特征在于所述重组体含有权利要求5或6所述的DNA以及基因转移载体。8、根据权利要求7所述的重组体，其特征在于所述基因转移载体为逆转录病毒载体。9、权利要求14任意一项所述的RNA在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。10、权利要求5或6项所述的DNA在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。11、权利要求7或8所述的重组体在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种抑制人二价金属离子转运蛋白(DMT1)表达的小干扰性RNA。本发明进一步公开了编码所述小干扰性RNA的相应shRNA的DNA以及能表达所述RNA的重组体。本发明的小干扰性RNA、DNA以及重组体能够有效抑制体内人二价金属离子转运蛋白表达、抑制铁的吸收与代谢，降低体内的血清铁水平，从而达到治疗铁代谢相关疾病的目的。文档编号A61K48/00GK101538569SQ20081014191公开日2009年9月23日申请日期2008年8月19日优先权日2008年8月19日发明者亚柯,葛啸虎,钱忠明申请人:香港理工大学深圳研究院