专利名称：沙苑子及其黄酮提取物在制备增强自然杀伤细胞活性药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及沙苑子及其黄酮提取物的新用途，具体涉及利用其对自然杀伤细胞活性的增强作用在药物制备中的用途。
背景技术：
沙苑子为豆科植物扁莖黄苗(Astragalus complanatus R .Br)的干燥成熟种子，有温补肝肾，固精、缩尿、益肝明目的功能，为补益肝肾的传统中药，味甘、辛温、无毒。沙苑子主要含有黄酮类、三萜类、有机酸类、氨基酸、多肽、蛋白质、留醇、多糖及铁、锌、猛、铜等微量元素，其中沙苑子黄酮有沙苑子式(complanatuside),沙苑子新式 (neocompalnoside),沙苑子杨梅式(myricomplanoside),鼠李朽1 檬素-3_0_β -D-葡萄糖 ft (rhomnocitrin-3-O- β -D-glucoside),紫云英 ft (astragalin),山奈素-3-0-L 阿拉伯批喃糖式(kaempferol-3-0- a -L-arabinoside),山奈酌·(kaompferol),杨梅树皮素(myricetin),毛蕊异黄酮-7-0-葡萄糖式(calycosin-7-O-glucoside)等。药理研究表明，沙苑子具有保肝、降脂、降压、抑制血小板聚集、改变血液流变学指标、抗炎及增加非特异性和特异性免疫功能等作用。自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)是体内一类独特的淋巴细胞,具有无需预先致敏、无主要组织相容性体系(MHC)限制性、能直接杀伤靶细胞的功能特性。在机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节和造血调控等方面发挥着重要的免疫功能，因此，NK细胞的临床治疗研究已经成为国内外学者研究的热点，通过各种途径扩增和激活NK细胞具有重要意义。而中药活性成分调节NK活性目前未见有文献报道
发明内容
本发明的发明目的是提供一种沙苑子及其黄酮提取物的新用途。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是
沙苑子和/或沙苑子黄酮提取物在制备增强自然杀伤细胞活性药物中的应用。所述沙苑子黄酮提取物中以重量计黄酮含量> 50%。沙苑子黄酮提取物的制备属于现有技术，例如，可以采用下列方法制备沙苑子粗粉用80%乙醇提取，经AB-8大孔树脂纯化，无水乙醇重结晶，得黄色沙苑子黄酮提取物。上述技术方案中，所述沙苑子黄酮提取物包括黄酮及其医药上可接受的盐。所述药物含有治疗有效量的沙苑子和/或沙苑子黄酮提取物及药学上可接受的载体。沙苑子黄酮提取物可口服给药，每日剂量为3. Og-6. 0g，优选4. Og-5. 0g。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
I.研究证明，沙苑子黄酮提取物能促进NK细胞增殖，提高NK的杀伤能力，上调NK细胞表面活性分子和NK细胞活化受体的表达；2.本发明首次采用中药活性成分调节NK活性，具有重要的意义。
图I是实施例二中沙苑子黄酮提取物(ACF)对NK细胞增殖活性的影响柱状对比图。图2是实施例三中沙苑子黄酮提取物(ACF)对NK细胞杀伤K-562细胞作用的影响图。图3是实施例三中沙苑子黄酮提取物(ACF)对NK细胞杀伤SMCC7721细胞作用的影响图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
实施例一沙苑子黄酮提取物(ACF)的制备
沙苑子粗粉lkg，用80%乙醇8000ml、7000 ml,7000 ml回流提取3次，每次I. 5 h，过滤，合并滤液，回收溶剂至无醇味后，加水稀释至1000 ml，通过AB-8大孔树脂，上样速度为l.Oml/min、上样浓度为10. Oml/min、样品液pH 5. O，水洗脱至淡黄色，40 %乙醇洗脱至
浅黄色。收集40%乙醇洗脱液，减压浓缩至干，无水乙醇重结晶，结晶真空干燥，得黄色固体状沙苑子黄酮提取物，采用紫外分光光度法以沙苑子苷为对照品测定总黄酮含量D，结果D 彡 60%ο实施例二 沙苑子黄酮提取物(ACF)对NK细胞增殖活性的影响
实验方法将NK-92细胞调整密度为I X IO5个细胞/ml，于96孔板中加IOOul/孔，力口入用培养基配制的不同浓度ACF，使终浓度分别为200，100，50，25，12 μ g/ml，于37°C培养2411、4811和7211，每孔加入1(^1^皿17溶液，继续培养4h，加入100 μ I 10%SDS,待紫色结晶完全溶解后，测定570nm的OD值。实验结果培养24h、48h和7此后，ACF各剂量对NK-92细胞活性均有增强作用，并呈现一定的剂量依赖关系。与对照组比较，培养24h的ACF-B、48h的ACF-B和ACF_C、72h的ACF-A E组细胞活性显著增强(/7〈0. 01)，尤以100 μ g/ml的ACF-B组最明显，见图I。实验结果证明，沙苑子黄酮提取物(ACF)能显著促进NK细胞增殖，提高NK活性。实施例三沙苑子黄酮提取物(ACF)对NK细胞杀伤活性的影响
I.沙苑子黄酮提取物(ACF)对NK细胞杀伤K-562肿瘤细胞作用的影响实验方法以K-562为靶细胞，细胞浓度调至5 X IO4个细胞/ml，每孔100 μ I，加入96孔板中，不同浓度加药培养的ΝΚ-92细胞为效应细胞，效靶比为10: 1,5: I, I: 1，每孔100 μ 1，对照组加不含药培养的ΝΚ-92细胞，每个效靶比设4个复孔，各组设效应细胞和靶细胞对照孔。37°C，5%C02培养24h，吸弃100 μ I上清，加入MTT 10 μ I后继续培养4h，加入100ull0%SDS，待紫色结晶完全溶解后，测定570nm OD,根据以下公式计算NK细胞杀伤活性
杀伤活性(%) = {1_[(效应细胞+靶细胞OD值)一效应细胞OD值]/靶细胞OD值}X100%
实验结果NK-92细胞加ACF培养3天后，ACF能增强NK-92细胞对K-562细胞的杀伤作用。与对照组比较，ACF-A, ACF-B和ACF-C组能显著提高NK-92细胞对K-562细胞的杀伤活性(/KO. 01)，见图2。2.沙苑子黄酮提取物(ACF)对NK细胞杀伤SMCC7721肝癌细胞作用的影响
实验方法将3丽(-7721靶细胞调至5\104个细胞/1111，于96孔板中加入100 μ I/孔，培养12h后，按照效靶比为10:1，5: I, I: 1，加入不同浓度加药培养的NK-92细胞为效应细胞，对照组加不含药培养的NK-92细胞，每个效靶比设4个复孔，各组设效应细胞和靶细胞对照孔。37°C，5%C02培养24h，吸弃100 μ I上清，加入MTT 10 μ I后继续培养4h，加入100ull0%SDS，放置过夜，测定570nm 0D,计算NK细胞杀伤活性。实验结果NK-92细胞加ACF培养3天后，ACF能增强NK-92细胞对SMMC-7721细胞的杀伤作用。当效靶比为10 :1和5 :1时，与对照组比较，ACF-A、ACF-B和ACF-C组能显著提高NK-92细胞对SMMC-7721细胞的杀伤活性(/X0. 01 )，见图3。
实验结果证明，沙苑子黄酮提取物(ACF)能显著提高NK细胞对肿瘤细胞K562和SMMC-7721的杀伤活性。实施例四沙苑子黄酮提取物(ACF)对NK细胞表型及活化分子表达的影响
实验方法流式细胞术检测NK细胞表面分子。NK-92细胞于含不同浓度ACF(终浓度为100，50，25 μ g/ml)的a -MEM培养基中培养7天，实验同时设对照组，每2天换液I次。收集细胞，PBS洗涤两次，加入O. 25%BSA封闭30min后，PBS洗涤两次，加入单抗CD3、CD56、CD16、CD25 (IL-2L)、CD69、CD95 (同时以同型单抗作对照)，冰浴30min, PBA洗涤两次，流式细胞仪分析。实验结果细胞表型流式细胞仪检测显示，ACF培养7天的NK-92，其细胞膜表面表达的CD56分子与对照组的NK-92细胞相同，均为CD56toight，control组、ACF100, ACF50、ACF25组⑶56分子表达率和平均荧光强度分别为99. 2±0. 5、82. 4±0. 3,99. 1±0. 3、85. 6±0· 2,99. 4±0· 3,84. 8±0· 2,99. 1±0· 1,85. 5±0· 3 ;而 CD3 和 CD16 分子仍为阴性，但⑶25、⑶69分子的表达强度提高，各组⑶25分子表达率和平均荧光强度分别为63. 4±0. 7、
2.21±0· 2,74. 3±0· 4**、3· 67±0· 3*, 72. 6±0· 5**、2· 58±0· 2,57. 26±0· 6,2. 48±0· 2 ；各组⑶69分子表达率和平均荧光强度分别为13. 2±0. 3、1.93±0. 3，13. 4±0. 2、
5.05±0· 4**，14. 94±0· 3,1. 87±0· 5，13. 1±0· 5,1. 98±0· 2 ;各组 CD95 分子表达率增加，分别为3. 76±0· 2，4. 22±0· 3，4. 98±0· 3*，4. 20±0· 2，而荧光强度无明显差异。见Fig4-4。实验结果证明，沙苑子黄酮提取物(ACF)可通过上调⑶25 (IL_2 R)、⑶69和⑶95分子的表达，增加与IL-2的结合而激活杀伤分子的转录表达，提高其杀伤作用。实施例五沙苑子黄酮提取物(ACF)对NK细胞活化受体KLRK1、NCR1、NCR2、NCR3表达的影响
实验方法采用荧光定量RT-PCR检测NKP46、NKP44、NKP30、NKG2D mRNA的表达。NK-92细胞于含不同浓度ACF (终浓度为100，50，25 μ g/ml)的a-MEM培养基中培养7天，实验同时设对照组，每2天换液I次。收集细胞，PBA洗涤两次，按RNA抽提试剂盒说明进行总RNA提取，逆转录合成cDNA，在MJ Research Opticon TM2实时荧光定量PCR仪上同时检测NKP46、NKP44、NKP30、NKG2D和β-actin的表达，以SYBR Green I为荧光染料。以看家基因β-actin表达作为内参照，基因表达水平的改变=2_ΛΛετ。目的基因表达水平Λ CT =目的基因CT 一 β-actin CTo ΛΛ CT =实验组Λ CT —对照组Λ CT值。重复实验3次。CT值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。引物序列
权利要求
1.沙苑子和/或沙苑子黄酮提取物在制备增强自然杀伤细胞活性药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的沙苑子和/或沙苑子黄酮提取物在制备增强自然杀伤细胞活性药物中的应用，其特征在于所述沙苑子黄酮提取物中以重量计黄酮含量> 50%。
3.根据权利要求I所述的沙苑子和/或沙苑子黄酮提取物在制备增强自然杀伤细胞活性药物中的应用，其特征在于所述沙苑子黄酮提取物包括黄酮及其医药上可接受的盐。
4.根据权利要求I所述的沙苑子和/或沙苑子黄酮提取物在制备增强自然杀伤细胞活性药物中的应用，其特征在于所述药物含有治疗有效量的沙苑子和/或沙苑子黄酮提取物及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了沙苑子和/或沙苑子黄酮提取物在制备增强自然杀伤细胞活性药物中的应用。沙苑子黄酮提取物能促进NK细胞增殖，提高NK的杀伤能力，上调NK细胞表面活性分子和NK细胞活化受体的表达；本发明首次采用中药活性成分调节NK活性，具有重要的意义。
文档编号A61P37/04GK102716178SQ20121010651
公开日2012年10月10日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者刘春宇 申请人:苏州大学