三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学【技术领域】，具体的说是一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白(PtPLC)的应用。所述三疣梭子蟹PtPLC重组表达产物用于制备抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。本发明在药物开发和饲料添加剂生产等方面具有潜在的应用价值，为三疣梭子蟹的病害防治和基因辅助选育奠定基础。
【专利说明】三抚梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学【技术领域】，具体的说是一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝 氨酸蛋白酶抑制剂蛋白（PtPLC)的应用。
【背景技术】
[0002] 丝氨酸蛋白酶抑制剂是对丝氨酸蛋白酶有抑制活性的一类蛋白质，其通过与靶酶 相互结合形成稳定的复合体，来防止机体内丝氨酸蛋白酶的有害水解激活，是生物体内免 疫系统的重要组成部分。根据序列特征、拓扑结构和功能的相似性，丝氨酸蛋白酶抑制剂可 以被分为74个家族，但在虾蟹等甲壳动物中其结构和功能的报道较少。
[0003] Pacifastin是一类新的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，最初是1987年在淡水螯虾 Pacifastus Ieniusculus的血淋巴中被发现。研宄表明该基因只存在于节肢动物中，目前 已经在多种昆虫中发现Pacifastin相关基因，但在甲壳动物中只在淡水螯虾和中华绒螯 蟹中发现。淡水螯虾的Pacifastin由两条肽链构成，重链和轻链，其中轻链含有一个典型 的半脫氛酸排列模式 Cys_Xaa9_12_Cys-Asn-Xaa-Cys-Xaa-Cys-Xaa2_ 3-Gly-Xaa3_4_Cys-Thr-X aa3_Cys(Pacifastin I ight chain domain, PLD)。PLD 结构域对 Pacifastin 的结构和功 能至关重要。
[0004] 三琉梭子蟹（Portunus trituberculatus)是我国重要的海水养殖品种，但随着养 殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不断提高，由细菌、真菌和病毒等引起的各种病 害日趋严重，给三疣梭子蟹养殖业造成巨大损失。因此，开展三疣梭子蟹免疫防疫基础研 宄，为蟹病的防治寻找更科学有效的途径，通过提高蟹自身免疫抵抗力来防止和减少蟹病 的发生，是实现其健康养殖的可靠保障。
[0005] 到目前为止，未有关于三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂的报道。因 此，研宄免疫因子一 Pacifastin对理解三疣梭子蟹的免疫防御机制和进行病害防治无疑具 有十分重要的理论与实践意义，同时将有助于开发天然药物用于人类疾病的治疗。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的 应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] -种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白PtPLC的应用，所述三 疣梭子蟹PtPLC重组表达产物用于制备抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜 剂。
[0009] 所述三疣梭子蟹PtPLC重组表达产物用于制备酚氧化酶抑制剂药物或革兰氏阴 性菌的抑菌药物。
[0010] 所述革兰氏阴性菌为溶藻弧菌或铜绿假单胞菌。
[0011] 所述三疣梭子蟹PtPLC重组表达产物按照常规方式获得，具体氨基酸序列如下所 示，
[0012] MRGSHHHHHHGMASELALTSPPFVELPSDPDAPECEGRPLVDRWRKDCNWCSCNEGRVRCSRQLCPEGQ QDPEPQCEGSPTWKDDCNTCRCAGGRAVCTAKHCDQLGPEQQIVEVQVESAECKEGSRWRVECNWCTCRGGKGACTE MACLNWDEDQAREDGILECHGSSRWKKDCNWCRCAEGRGFCTKKACPQTGPFDNLPEDATCVPGSRWLVDCNWCGCS DDGRSSFCTLMACIPGYVHEGPTCEDGSVWKTDDCNICRCIDGMSACTKRLCATPN
[0013] 本发明所具有的优点：
[0014] 本发明利用三疣梭子蟹PtPLC重组表达蛋白浓度为2. 28、4. 56、9. 11 μ M时，在反 应40min时，对三疣梭子蟹血细胞破碎裂解液酚氧化酶的抑制活性达到18. 95-72. 75 %。 重组蛋白PtPLC对处于对数生长期和平稳期（4-10h)的溶藻弧菌具有明显的抑制效果， 与阴性对照组相比，达到了显著差异水平（P〈〇. 05)。重组蛋白PtPLC对处于对数生长期 (3-4,6-7h)的铜绿假单胞菌具有明显的抑制效果，与阴性对照组相比，达到了显著差异水 平（Ρ〈0· 05) 〇
[0015] 本发明基因及其重组蛋白可作为酚氧化酶类抑制剂药物的生产，应用于人类相关 疾病的治疗，或用于饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂的生产等，另外还可以为进一步研宄三疣 梭子蟹免疫防御机制提供基础，并为三疣梭子蟹的病害防治和基因辅助选育提供参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为本发明实例不同浓度的三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制 剂PtPLC重组蛋白对三疣梭子蟹血细胞破碎上清液（HLS)酚氧化酶的的抑制作用图 (Tris-HCL为阴性对照）。
[0017] 图2为本发明实例三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC重组蛋 白（终浓度9. 11 μ Μ)对溶藻弧菌的抑制作用图（Tris-HCL为阴性对照）。
[0018] 图3为本发明实例三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC重组蛋 白（终浓度9. 11 μΜ)对铜绿假单胞的抑制作用图（Tris-HCL为阴性对照）。
【具体实施方式】
[0019] 下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。
[0020] 实施例1.
[0021] 三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC重组蛋白的酚氧化酶抑制 试验：
[0022] 1.三疣梭子蟹血细胞破碎上清液（HLS)的制备：抽取三疣梭子蟹血细胞，迅速加 入到抗凝剂中，离心IOmin后，获得血细胞沉淀。将沉淀用0. IM PBS(pH = 7. 0)重悬后，用 20kHz/100W的超声波击打4次，每次30s后，12, OOOrpm 4度离心lOmin，除去沉淀。上清液 即为血细胞破碎上清液（HLS)，放入4度环境备用。
[0023] 2.酚氧化酶活力的测定：将40 μ L HLS与50 μ L不同浓度的PtPLC重组蛋白（终 浓度分别为2. 28、4. 56、9. 11 μ Μ)混合后置于96孔板中。将10 μ L溶藻弧菌（OD56tl= 0. 4) 加到96孔板中室温孵育5min，然后加入100 μ L 2mg/ml的L-dopa溶液开始反应。在反应 后的0、5、10、15、20、30和40min分别用酶标仪（Emax)在490nm波长下读数，测得酚氧化酶 的活性。在反应20min后三疣梭子蟹HLS中的PO活性达到平台期，在反应40min后发现上 述实施例重组蛋白PtPLC在终浓度为2. 28、4. 56、9. 11 μ M时，对三疣梭子蟹血细胞破碎裂 解液酚氧化酶的抑制活性达到18. 95-72. 75%。
[0024] 实施例2.
[0025] 三琉梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC重组蛋白的体外溶藻弧菌 抑制试验：
[0026] 1.微生物的培养及制备：溶藻弧菌属于弧菌科、弧菌属，发酵型革兰氏阴性短杆 菌，无芽孢、荚膜，单独存在或尾端相连成"C"或"S"形，为嗜盐嗜温性、兼性厌氧海生弧菌， 是三疣梭子蟹乳化病的重要的病原菌。
[0027] 溶藻弧菌用TSB培养基在28°C、转速为220rpm/min摇床上培养，使菌浓度达到对 数生长期时，用50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)缓冲液稀释菌体，使其每毫升菌液中的菌落数约 为 IXlO30
[0028] 2.重组蛋白PtPLC抑菌活性测定：取50 μ L对数生长期的溶藻弧菌菌液，加入等 体积溶解在50mM Tris-HCUpH = 8. 0)缓冲液中的PtPLC重组蛋白（终浓度9. 11 μ Μ)，室 温下孵育30min。取20 μ L孵育后混合液，加到含有180 μ L TSB液体培养基的96孔板中。 在28°C、转速为220rpm/min摇床上培养，每Ih在波长为560nm的可见光下读数，连续测量 l〇h。发现上述实施例重组蛋白PtPLC对处于对数生长期和平稳期（4-10h)的溶藻弧菌具 有明显的抑制效果（见图2)，与阴性对照组相比，达到了显著差异水平（P〈0. 05)。
[0029] 实施例3.
[0030] 三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC重组蛋白的体外铜绿假单 胞菌抑制试验：
[0031] 1.微生物的培养及制备：铜绿假单胞菌又称绿脓杆菌，属于假单胞菌科、假单胞 菌属，非发酵型革兰氏阴性杆菌，菌体细长且长短不一，菌体的一端有单鞭毛，为需要菌，存 在于土壤、尘埃、水中，是一种常见的条件致病菌，但非三疣梭子蟹病原菌。
[0032] 铜绿假单胞菌用LB培养基在37°C、转速为220rpm/min摇床上培养，使菌浓度达到 对数生长期时，用50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)缓冲液稀释菌体，使其每毫升菌液中的菌落数 约为1X103。
[0033] 2.重组蛋白PtPLC抑菌活性测定：取50 μ L对数生长期的铜绿假单胞菌液，加入 等体积溶解在50mM Tris-HCUpH = 8. 0)缓冲液中的PtPLC重组蛋白（终浓度9. 11 μΜ)， 室温下孵育30min。取20 μ L孵育后混合液，加到含有180 μ L LB液体培养基的96孔板中。 在28°C、转速为220rpm/min摇床上培养，每Ih在波长为560nm的可见光下读数，连续测量 l〇h。发现上述实施例重组蛋白PtPLC对处于对数生长期（3-4,6-7h)的铜绿假单胞菌具有 明显的抑制效果（见图3)，与阴性对照组相比，达到了显著差异水平（P〈0. 05)。
[0034] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种三琉梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白PtPLC的应用，其特征在 于：所述三疣梭子蟹PtPLC重组表达产物用于制备抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防 腐剂或保鲜剂。
2. 按权利要求1所述的三琉梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白PtPLC的 应用，其特征在于：所述三疣梭子蟹PtPLC重组表达产物用于制备酚氧化酶抑制剂药物或 革兰氏阴性菌的抑菌药物。
3. 按权利要求2所述的三琉梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白PtPLC的 应用，其特征在于：所述革兰氏阴性菌为溶藻弧菌或铜绿假单胞菌。
【文档编号】A61K38/57GK104491851SQ201410724321
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】刘媛, 崔朝霞, 王双艳, 师国慧 申请人:中国科学院海洋研究所